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微生物紅外鑒定儀在結(jié)冷膠高產(chǎn)菌株選育中的應(yīng)用探索

2016-06-02 09:23:49浙江工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院浙江杭州310014
發(fā)酵科技通訊 2016年2期
關(guān)鍵詞:結(jié)冷膠篩選多糖

汪 釗,徐 力,魏 春(浙江工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院,浙江杭州310014)

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微生物紅外鑒定儀在結(jié)冷膠高產(chǎn)菌株選育中的應(yīng)用探索

汪釗,徐力,魏春
(浙江工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院,浙江杭州310014)

摘要:利用利福平等抗生素對結(jié)冷膠生產(chǎn)菌株Sphingomonas elodea WZW002進(jìn)行誘變處理,同時(shí)根據(jù)傅立葉紅外光譜(FTIR)原理,對微生物紅外鑒定譜圖進(jìn)行歸一化和基線校正的處理,對比特征峰的吸收強(qiáng)度以及朗伯比爾定律分析糖組分,建立了高效篩選結(jié)冷膠高產(chǎn)菌株的方法。篩選得到一株結(jié)冷膠高產(chǎn)菌株,產(chǎn)量為17.21 g/L,較原始菌株提高5.8%。

關(guān)鍵詞:結(jié)冷膠;FTIR;篩選;多糖

結(jié)冷膠是由革蘭氏陰性菌少動(dòng)鞘氨醇單胞菌(Sphingomonas elodea ATCC31461)在有氧條件下發(fā)酵生產(chǎn)的一種新型胞外多糖(Exopolysaccharide,EPS)[1],它以獨(dú)有的流變特性,廣泛的pH適用性以及使用安全性,在食品、醫(yī)藥、化工等領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。結(jié)冷膠具有極好的熱穩(wěn)定,耐酸堿及其他獨(dú)特的理化性質(zhì),其出色的增稠性、假塑流變性、凝膠性、穩(wěn)定性使其應(yīng)用領(lǐng)域廣泛,應(yīng)用價(jià)值逐步提高[2-3]。菌株是發(fā)酵工業(yè)生產(chǎn)中最為關(guān)鍵的一環(huán),目前結(jié)冷膠生產(chǎn)中缺乏優(yōu)良的發(fā)酵菌株,國內(nèi)外的研究主要集中于對現(xiàn)有高產(chǎn)結(jié)冷膠菌株進(jìn)行遺傳改造,如物理誘變、化學(xué)誘變、分子生物學(xué)技術(shù)改造等得到高產(chǎn)菌株,提高結(jié)冷膠的產(chǎn)量是目前一大研究重點(diǎn)。

1991年,Naumann等在Nature雜志中指出傅立葉變換紅外光譜法具有判別、分類和鑒別微生物的能力[4]。隨后關(guān)于傅立葉變換紅外光譜法在微生物中的應(yīng)用也相繼開展[5-8]。FTIR技術(shù)以未損傷細(xì)胞的FTIR光譜的特殊指紋區(qū)為基礎(chǔ),光譜反映的是整個(gè)細(xì)胞組成分子的振動(dòng)特征,也就是蛋白質(zhì)、核酸等物質(zhì)的特征,因此可以區(qū)分生化信息上的差別。根據(jù)微生物紅外光譜原理,本文結(jié)合已有文獻(xiàn)報(bào)道,建立了結(jié)冷膠高產(chǎn)菌株的篩選方法,提高高產(chǎn)菌株篩選效率。

1 材料和方法

1.1供試菌株

Sphingomonas sp.WZW002。

1.2主要儀器

紅外光譜分析儀,Tensor27德國布魯克公司;數(shù)字黏度計(jì),NDJ-8LN上海精科。

1.3培養(yǎng)基

1.3.1種子培養(yǎng)基

蛋白胨10 g/L,牛肉膏5 g/L,NaCl 5 g/L,pH 7.0~7.2,121℃滅菌20 min。

1.3.2發(fā)酵培養(yǎng)基

蔗糖40 g/L,豆餅粉6.0 g/L,KH2P042.0 g/L,MgSO40.8 g/L,CaCO31.0 g/L,pH 7.0~7.2,121℃滅菌20 min。

1.4微生物紅外光譜樣品處理方法

菌株誘變采用抗生素篩選方法,利用不同濃度利福平誘變篩選結(jié)冷膠生產(chǎn)菌株。采集誘變后菌種單菌落,制備懸濁液,用生理鹽水洗滌3次,去除培養(yǎng)基中的瓊脂及菌落附帶的雜質(zhì),吸取一定量轉(zhuǎn)移至樣品板。點(diǎn)樣分析板置于干燥箱內(nèi),40℃恒溫常壓干燥制備菌膜。菌膜應(yīng)該呈現(xiàn)干燥而且保持均勻的狀態(tài)以待分析。

1.5分析方法

1.5.1紅外光譜分析方法

表1 不同波長掃描下的消光系數(shù)[9]

利用傅立葉紅外光譜對菌種進(jìn)行鑒定,主要采用的是定性分析方法,包括主成分分析方法以及聚類分析方法,該種方法能夠反映菌種的生化信息,但是不能夠精確反映菌種各物質(zhì)之間成分的區(qū)別及含量。有研究表明各物質(zhì)在不同波長下的吸收值與物質(zhì)濃度以及物質(zhì)在該波長下的消光系數(shù)有密切聯(lián)系[10]。根據(jù)朗伯-比爾定律推出:

A(v)=ε1(v)Cpd+ε2(v)CCad+ε3(v)CNad+ε1(v)CLd

A(v)表示在波數(shù)v下的吸收值;ε(v)表示在波數(shù)v下的消光系數(shù);Cp、CCa、CNa、CL分別表示蛋白質(zhì)、糖類、核酸、脂質(zhì)的濃度。

1.5.2發(fā)酵液黏度測定[11-12]

NDJ-8SN型旋轉(zhuǎn)式黏度計(jì),室溫條件下用4#轉(zhuǎn)子在12 r/min條件下測定。

1.5.3結(jié)冷膠含量測定[13-14]

將去除菌體和雜質(zhì)后的上清液用2倍體積的95%乙醇提取結(jié)冷膠,經(jīng)過濾后取沉淀物60℃烘干至恒重后測定干重。產(chǎn)膠率為結(jié)冷膠干重與發(fā)酵液體積的比值,單位g/L。

2 結(jié)果與討論

2.1各類菌株紅外掃描譜圖比較

圖1 不同菌種紅外掃描圖譜

各類菌種在蛋白質(zhì)、脂肪酸、多糖等特定位點(diǎn)都具有很強(qiáng)的吸收值,但吸收強(qiáng)度顯差異,通過這些差異進(jìn)而可以分析各菌株的生理狀況。各類菌種利用在2 800~3 000 cm-1細(xì)胞膜上脂肪酸的特征吸收強(qiáng)弱區(qū)分依次為大腸桿菌、金黃色的葡萄球菌、酵母菌、Sphingomonas sp.WZW002、乳酸菌。譜圖一般采取兩種技術(shù)處理手段:基線校正,以避免基線偏移導(dǎo)致的光譜差異;歸一化,以消除樣品量不同帶來的光譜差異。通過基線校正和歸一化處理可以對比各菌株之間的相對吸收大小。不僅可以比較不同菌株之間的差異,同類誘變菌株亦可以通過紅外掃描圖譜區(qū)分差異。

2.2菌株重復(fù)性掃描圖譜

紅外光譜處理微生物具有高度的靈敏性、便捷性,圖2分別是3次紅外光譜處理原始菌株結(jié)果拆分圖。圖中可以看出:波數(shù)2 930附近有顯示脂肪酸的—CH3的對稱、反對稱伸縮運(yùn)動(dòng)產(chǎn)生的吸收峰;波數(shù)1 540和1 655處的譜帶主要來自蛋白質(zhì)酰胺II帶和酰胺I帶;1 100波數(shù)下多糖特征峰吸收強(qiáng)度最大。對3次平行數(shù)據(jù)進(jìn)行比對,譜圖具有很高的重合度,保證了紅外光譜處理微生物的可重復(fù)性。

圖2 原始菌株紅外掃描重復(fù)性圖譜

2.3結(jié)冷膠產(chǎn)量對多糖特征峰的影響

波數(shù)900~1 200是多糖類物質(zhì)的典型吸收帶,菌體中多糖的含量直接影響到紅外吸收的強(qiáng)弱。在檢測的菌懸液中添加微量的結(jié)冷膠成品,對比菌株吸收圖譜圖3(a),可以觀察到高含量多糖對譜圖的影響作用。圖3(b)中,添加結(jié)冷膠成品的試樣,多糖吸收特征峰明顯加強(qiáng),但是脂肪酸吸收峰以及蛋白質(zhì)吸收峰明顯減弱。初步分析是由于結(jié)冷膠的凝膠以及增稠作用,對菌體起到了包埋的作用,使菌膜不能夠充分得到分析,紅外的反射受到影響。

利用不同蔗糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)(4%、2%、1%、0.5%、0.25%)的培養(yǎng)基培養(yǎng)菌體可以得到產(chǎn)膠量相對有差異的菌體生理狀態(tài),蔗糖濃度對結(jié)冷膠產(chǎn)量有影響是通過實(shí)驗(yàn)證實(shí)的。4%的高糖平板培養(yǎng)菌體吸收峰明顯高于其他蔗糖梯度,其生理狀況比較活躍,在蛋白質(zhì)及脂肪酸吸收峰上也明顯高于其他梯度平板。蔗糖濃度較低,區(qū)分度就相對較差,如2%與1%梯度平板,很難區(qū)分多糖吸收條帶上的強(qiáng)弱。造成該種現(xiàn)象一方面是由于菌體代謝比較接近,另一方面是由于紅外光譜儀器存在一定誤差。對于該種情況,就需要用到上述所提定量區(qū)分法加以甄別。圖3~4充分說明高產(chǎn)菌株可以通過觀察菌株在特征峰上的吸收值加以區(qū)分。

2.4高產(chǎn)菌株的獲得及搖瓶發(fā)酵驗(yàn)證

利用紅外光譜對菌株進(jìn)行測定,圖5為篩選中典型的菌株譜圖。表2中是各菌株在特定波數(shù)下的吸收值,與原始菌株相比吸收強(qiáng)度有明顯波動(dòng)。通過吸收強(qiáng)度比較,H46號菌株在多糖吸收條帶上吸收強(qiáng)度比原始菌株有所提高,是提高結(jié)冷膠產(chǎn)量的潛在菌株,Z12、Z36、H04號菌株在多糖吸收條帶上明顯弱于原始菌株。綜合分析上述菌株,采用朗伯比爾定律進(jìn)行組分對比,同時(shí)對潛在菌株進(jìn)行搖瓶發(fā)酵驗(yàn)證,得到H46號菌株糖組分相對含量亦高于原始菌株,發(fā)酵搖瓶實(shí)驗(yàn)也驗(yàn)證該菌株結(jié)冷膠產(chǎn)量比原始菌株提高5.8%。通過表3對比Z36和H04發(fā)現(xiàn),在1 080波數(shù)下,Z36吸收值低于H04,但是具體糖組分分析過程中Z36高于H04,同時(shí)符合搖瓶發(fā)酵結(jié)冷膠產(chǎn)量Z36高于H04。出現(xiàn)該種情況的原因可能是紅外譜圖處理樣品具有高精密性,樣品試樣不均勻或者雜質(zhì)帶入都會(huì)影響分析結(jié)果,故需要糖組分分析以保證分析的準(zhǔn)確性。

圖3 結(jié)冷膠對多糖特征峰的影響

圖4 不同蔗糖濃度培養(yǎng)條件下菌體紅外掃描圖譜

圖5 篩選得到結(jié)冷膠菌株紅外掃描圖譜

表2 結(jié)冷膠菌株在不同特征峰下吸收值

表3 不同結(jié)冷膠菌株糖組分對應(yīng)含量與產(chǎn)量對比

2.5高產(chǎn)菌株的傳代穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

表4為高產(chǎn)菌株H46傳代發(fā)酵實(shí)驗(yàn)結(jié)果,在產(chǎn)膠量以及黏度上波動(dòng)都不大,具有很好的傳代性,可作為性能穩(wěn)定的產(chǎn)結(jié)冷膠發(fā)酵菌株。

表4 高產(chǎn)菌株的傳代穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

3 結(jié) 論

采用傳統(tǒng)的醇沉烘干測干重的檢測方法篩選結(jié)冷膠高產(chǎn)菌株,不僅周期長、效率低,同時(shí)投入相對較大,不能真正達(dá)到高效篩選結(jié)冷膠高產(chǎn)菌株的目的。傅立葉微生物紅外鑒定儀(FTIR)目前主要運(yùn)用在菌株鑒定和分類上,F(xiàn)TIR技術(shù)以未損傷細(xì)胞的FTIR光譜的特殊指紋區(qū)為基礎(chǔ),光譜反映的是整個(gè)細(xì)胞組成分子的振動(dòng)特征,也就是蛋白質(zhì)、核酸等物質(zhì)的特征,因此可以區(qū)分生化信息上的差別。本文根據(jù)FTIR技術(shù)原理對誘變菌株的生化信息進(jìn)行測定,從而推斷菌株的生理狀況,結(jié)合朗伯-比爾定律對各成分進(jìn)行分析比對,探索建立高通量篩選高產(chǎn)結(jié)冷膠菌株的方法。利用該方法篩選得到一株結(jié)冷膠高產(chǎn)菌株,產(chǎn)量為17.21 g/L,較原始菌株提高5.8%。

參考文獻(xiàn):

[1]BANIK R M,KANARI B,UPADHYAY S N,Exopolysaccharide of gellan family:prospects and potential[J]. World journal of microbiology and biotechnology,2000,16(5):407-414.

[2]GIAVASIS I,HARVEY L M,MCNEIL B,gellan gum[J].Critical reviews in biotechnology,2000,20(3):177-211.

[3]DONER L W. Rapid purification of commercial gellan gum to highly soluble and gellable monovalent cation salts[J]. Carbohydrate polymers,1997,32(3/4):245-247.

[4]NAUMANN D,HELM D,LABISCHINSKI H,Microbiological characterization by FTIR spectroscopy[J]Nature,1991,351(6321):81-82.

[5]慈云祥,藏凱賽,高體玉.幾種微生物的紅外光譜研究[J].高等學(xué)?;瘜W(xué)學(xué)報(bào),2002,23(6):1047-1049.

[6]聶明,羅江蘭,包衍,等.鐮刀菌的傅里葉變換紅外光譜鑒別[J].光譜學(xué)與光譜分析,2007,27(8):519-522.

[7]SANTOS C,F(xiàn)RAGA ME,KOZAKIEWICZ Z,et,al. Fourier transform infrared as a powerful technique for the identification and characterization of filamentous fungi and yeasts[J]. Research in microbiology,2010,161(2):168-175.

[8]WAGNER H,DUNKER S,LIU Z,et,al. Subcommunity FTIR-spectroscopy to determine physiological cell states[J]. Current opinion in biotechnology,2013,24(1):88-94.

[9]GRUBE M,ZAGREBA E,GROMOZOVA E,et al. Comparative investigation of the macromolecular composition of mycelia forms Thielavia terrestris by infrared spectroscopy[J]. Vibrational spectroscopy,1999,19(2):301-306.

[10]SHENG Guoping,YU Hanqing,WANG Chengming. FTIR -spectral analysis of two photosynthetic H-2-producing strains and their extracellular polymeric substances[J]. Applied microbiology and biotechnology,2006,73(1):204-210.

[11]陳亞敏.結(jié)冷膠發(fā)酵生產(chǎn)工藝技術(shù)優(yōu)化研究[D].杭州:浙江大學(xué).

[12]JAY A J,COLQUHOUN I J,RIDOUT M J,et al. Analysis of structure and function of gellans with different substitution patterns[J]. Carbohydrate polymers,1998,35(3/4):179-188.

[13]GIAVASIS I,HARVEY L M,MCNEIL B. The effect of agitation and aeration on the synthesis and molecular weight of gellan in batch cultures of Sphingomonas paucimobilis[J]. Enzyme and microbial technology,2006,38(1/2):101-108.

[14]WILLOUGHBY L E,KASSPIS S. The influence of sucrose upon the gelation of gellangum in large deformation compression analysis[J]. Food science and technology,1994(8):227-233.

(責(zé)任編輯:朱小惠)

Application of FTIR in screening of high-yield gellan gum producing strains

WANG Zhao,XU Li,WEI Chun
(College of Biotechnology and Bioengineering,Zhejiang University of Technology,Hangzhou 310014,China)

Abstract:A gellan gum producing strain Sphingomonas sp.WZW002 was mutated by rifampicin. Based on infrared spectrum(FTIR)identification,and lambert beer law analysis,a high-throughput screening method was established. A mutant strain with high productivity was screened and the yield of gellan gum reached 17.21 g/L,which increased by 5.8%comparing with the wild type strain.

Keywords:gellan gum;FTIR;screen;polysoccharide

作者簡介:汪釗(1960—),男,安徽歙縣人,教授,研究方向?yàn)槊讣夹g(shù)及應(yīng)用、發(fā)酵工程,E-mail:hzwangzhao@163.com.通信作者:汪釗教授,E-mail:hzwangzhao@163.com.

收稿日期:2015-04-16

中圖分類號:Q93

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

文章編號:1674-2214(2016)02-0065-05

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