甘　宇，周建業(yè)，胡盛壽，唐　躍，楊新衛(wèi)，陳海波，閆曉倩，孫嘉康

1.山西醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院(太原 030001)；2.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院，北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院，國(guó)家心血管病中心，阜外醫(yī)院，心血管疾病國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

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左心輔助裝置致心肌梗死早期心肌卸負(fù)荷后心肌細(xì)胞變化的研究

甘宇1，周建業(yè)2，胡盛壽2，唐躍2，楊新衛(wèi)1，陳海波2，閆曉倩2，孫嘉康2

1.山西醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院(太原 030001)；2.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院，北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院，國(guó)家心血管病中心，阜外醫(yī)院，心血管疾病國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

摘要：目的 制作羊急性心肌梗死模型，觀察左心輔助裝置卸負(fù)荷干預(yù)下心肌細(xì)胞發(fā)生的變化，為左心輔助裝置能否應(yīng)用于急性心肌梗死病人提供依據(jù)。方法實(shí)驗(yàn)組3只成年小尾寒羊在心臟不停跳下植入左心輔助裝置(FW-Ⅱ型軸流泵)，另3只為對(duì)照組不作卸負(fù)荷處理。記錄心肌梗死后12 h、24 h、36 h、48 h、72 h肌鈣蛋白I(CTn I)值評(píng)價(jià)心肌細(xì)胞損傷程度。72 h后取出標(biāo)本，觀察心肌細(xì)胞破壞及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)情況，以及檢測(cè)兩組動(dòng)物心肌細(xì)胞凋亡情況。結(jié)果卸負(fù)荷后各個(gè)時(shí)間點(diǎn)實(shí)驗(yàn)組CTn I值變化幅度與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，實(shí)驗(yàn)組心肌梗死及梗死邊帶區(qū)域炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)較少，壞死心肌細(xì)胞較少，大量心肌細(xì)胞呈冬眠細(xì)胞狀態(tài)存活；而對(duì)照組對(duì)應(yīng)區(qū)域炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)廣泛，壞死心肌細(xì)胞較多。細(xì)胞凋亡結(jié)果顯示：實(shí)驗(yàn)組梗死邊帶區(qū)域心肌細(xì)胞凋亡程度低于對(duì)照組[(47.83±16.24)%比(75.80±11.16)%，P<0.05]。結(jié)論左心輔助裝置對(duì)心肌梗死早期心肌卸負(fù)荷，可以有效減輕心肌梗死心肌細(xì)胞死亡程度，減少炎癥細(xì)胞滲出，為心肌梗死后續(xù)治療提供良好的心肌細(xì)胞基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：心肌梗死；左心輔助裝置；卸負(fù)荷；動(dòng)物模型；冬眠細(xì)胞；小尾寒羊

急性心肌梗死(AMI)是一個(gè)具有高發(fā)病率與高死亡率的全球性疾病。急性心肌梗死是冠心病最嚴(yán)重的類型，當(dāng)冠脈管腔狹窄到一定程度，心肌供血減少，心肌的氧需量(MVO2)與供氧量之間存在矛盾，部分心肌細(xì)胞進(jìn)入冬眠狀態(tài)(myocardial hibernation)[1]，以保護(hù)缺血心肌。若供氧與需氧矛盾無(wú)法調(diào)和，缺氧心肌細(xì)胞將發(fā)生不可逆性的損傷乃至死亡[2-3 ]。因此，采取適當(dāng)?shù)母深A(yù)措施緩解心肌氧的供需矛盾，保護(hù)缺血的心肌細(xì)胞不發(fā)生死亡、甚至恢復(fù)到正常狀態(tài)，正成為心肌梗死治療的新策略。體外模式氧合器裝置(ECMO)、主動(dòng)脈內(nèi)球囊反搏(IABP)作為臨時(shí)、部分心臟輔助已應(yīng)用于心肌梗死病人，但不能使心肌梗死面積縮小。

左心輔助裝置(LVAD)通過(guò)輔助心臟部分泵功能，應(yīng)用于晚期心力衰竭病人[4-5]。但對(duì)于急性心肌梗死后是否使用左心輔助裝置，目前尚存在爭(zhēng)議， 部分學(xué)者認(rèn)為使用輔助裝置有可取之處，如：Xydas 等[6]發(fā)現(xiàn)左心輔助裝置能夠顯著降低心肌氧需量，Kloner[7]認(rèn)為借助左心輔助裝置的機(jī)械卸負(fù)荷(mechanical unloading)作用，減少梗死心肌氧需求，從而減少心肌梗死面積；還有研究發(fā)現(xiàn)通過(guò)對(duì)心肌梗死心臟使用左心輔助裝置，能限制心肌梗死后的左室重構(gòu)[8]，與ECMO、IABP相比較，Thiele等[9-10]認(rèn)為L(zhǎng)VAD不受左心功能限制，并對(duì)外周循環(huán)有充分的支持，即使左心功能受損情況下，仍可對(duì)左心室充分卸負(fù)荷，并能緩解心肌氧需求，縮小心肌梗死面積。目前也有對(duì)心肌梗死及心源性休克病人使用左心輔助裝置的個(gè)案報(bào)道[11]。但也學(xué)者認(rèn)為，心肌梗死病人使用左心輔助裝置后，存在血栓形成等并發(fā)癥，并且與ECMO、IABP等治療方法相比較，在病人生存率方面，左心輔助裝置并無(wú)優(yōu)勢(shì)。所以左心助裝置能否應(yīng)用于心肌梗死病人還需進(jìn)一步的證據(jù)[12-13]。

通過(guò)使用左心輔助裝置卸負(fù)荷，可以緩解氧供給與需求的矛盾，保護(hù)缺血心肌細(xì)胞免于死亡，從而為心肌梗死治療提供良好的心肌細(xì)胞基礎(chǔ)、贏得治療時(shí)間。本研究制作羊急性心肌梗死模型，用FW-2型軸流血泵進(jìn)行輔助循環(huán)，觀察卸負(fù)荷干預(yù)下心肌細(xì)胞的變化。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)儀器與材料選用FW-2型軸流式輔助血泵作為左心輔助裝置(阜外心血管病醫(yī)院自行研制)，LEICA DM 6000B正置熒光顯微鏡(德國(guó))，LEICA sp8激光掃描共聚焦顯微鏡(德國(guó))，Swan-gaze漂浮導(dǎo)管(愛(ài)德華生命科學(xué)有限公司，美國(guó))。

1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物12只成年小尾寒羊，均為雄性，體重(54.2±8)kg，數(shù)字法隨機(jī)分為兩組，實(shí)驗(yàn)組(MI+VAD)5只，對(duì)照組(MI) 7只；實(shí)驗(yàn)組制作心肌梗死模型后加FW-2型軸流泵卸負(fù)荷，實(shí)驗(yàn)組僅制作心肌梗死模型不作進(jìn)一步處理。該實(shí)驗(yàn)按照《北京市實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》進(jìn)行，本研究得到阜外心血管病醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利倫理審查委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.3術(shù)前處理術(shù)前24 h禁食，12 h禁水；術(shù)前抽血檢查生化全套，心肌損傷標(biāo)志物肌鈣蛋白(CTnI)、血常規(guī)、血?dú)夥治龅软?xiàng)目。

1.4心肌梗死動(dòng)物模型制作丙泊酚誘導(dǎo)動(dòng)物麻醉成功后，氣管插管，異氟烷吸入維持全麻，動(dòng)物右側(cè)臥位，常規(guī)消毒、鋪無(wú)菌巾，取左側(cè)胸第4肋間手術(shù)切口，經(jīng)靜脈給予肝素(3 mg/kg)后，保持全血激活凝血時(shí)間(ACT)在400 s以上。心表噴灑利多卡因，5-0 prolene線于鈍緣支根部結(jié)扎，觀察鈍緣支分布心肌組織顏色變紫、心臟跳動(dòng)異常，心率增快，心電圖顯示心肌缺血改變(見(jiàn)圖1)，心肌梗死動(dòng)物模型制作成功。

注：A1為實(shí)驗(yàn)組術(shù)前心電圖；A2為實(shí)驗(yàn)組冠脈結(jié)扎后心電圖；B1為對(duì)照組術(shù)前心電圖；B2為對(duì)照組冠脈結(jié)扎后心電圖。

圖1實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組冠脈結(jié)扎前后心電圖變化

1.5實(shí)驗(yàn)組植入FW-2型軸流泵實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物心肌梗死造模前，將FW-2型軸流泵輸入端經(jīng)心尖部進(jìn)入左心室，輸出端用牛頸靜脈與降主動(dòng)脈行端側(cè)吻合，排氣后連接牢靠。在心肌梗死動(dòng)物模型制作成功的同時(shí)，開(kāi)啟FW-2型軸流泵，將流速調(diào)至接近術(shù)前心排量，置入的Swan-gaze漂浮導(dǎo)管記錄確認(rèn)卸負(fù)荷成功。檢查各吻合口無(wú)滲血，血泵轉(zhuǎn)速、流量平穩(wěn)，留置左側(cè)胸腔負(fù)壓引流管，常規(guī)關(guān)胸。對(duì)照組僅留置左側(cè)胸腔負(fù)壓引流管后，術(shù)畢。

1.6術(shù)后處理實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組經(jīng)靜脈微量泵持續(xù)泵入肝素，將ACT維持于280 s～320 s；并肌肉注射青霉素48×105U，12 h1次；術(shù)后1 h、24 h、36 h、48 h、72 h抽血檢測(cè)記錄CTnI，常規(guī)飼養(yǎng)。期間檢測(cè)FW-2型軸流泵轉(zhuǎn)速，并使流量盡量接近心排量，維持卸負(fù)荷狀態(tài)。存活72 h后，全麻動(dòng)物，原手術(shù)部位進(jìn)入胸腔，靜脈推注氯化鉀處死動(dòng)物的同時(shí)，F(xiàn)W-2型軸流泵停轉(zhuǎn)，完整取出動(dòng)物心臟，去除各插管，分別取心肌梗死、梗死邊帶區(qū)域、正常心肌組織置入10%甲醛溶液固定。

1.7組織病理學(xué)檢查分別取實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組各自心肌梗死、梗死邊帶區(qū)域、正常心肌組織行固定、包埋、制片，蘇木素-伊紅(haematoxylin-eosin，HE)常規(guī)染色。低倍顯微鏡下觀察心肌細(xì)胞死亡及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)的大體分布，高倍顯微鏡觀察心肌細(xì)胞形態(tài)及心肌纖維的改變。

1.8免疫組織化學(xué)檢查兩組梗死邊帶區(qū)域各采用數(shù)字法隨機(jī)取4個(gè)組織蠟塊行TUNEL法細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)，每個(gè)蠟塊拍取5張照片，每張照片計(jì)算超過(guò)200細(xì)胞，計(jì)算細(xì)胞凋亡比例。

1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。對(duì)CTnI結(jié)果進(jìn)行重復(fù)測(cè)量方差分析，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組心肌凋亡細(xì)胞所占心肌細(xì)胞百分?jǐn)?shù)均采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物總體情況實(shí)驗(yàn)組5只，1只結(jié)扎冠脈時(shí)發(fā)生室顫死亡，1只心臟非手術(shù)區(qū)域小破口術(shù)中未發(fā)現(xiàn)，術(shù)后心臟破裂死亡；存活3只(編號(hào)：A、B、C)；對(duì)照組7只，4只結(jié)扎冠脈時(shí)發(fā)生室顫死亡，存活3只(編號(hào)：D、E、F)。

2.2實(shí)驗(yàn)組心肌卸負(fù)荷評(píng)價(jià)(見(jiàn)表1)實(shí)驗(yàn)組心肌梗死模型建立后心排量較術(shù)前下降(P<0.05)，心肌梗死后心室的容量負(fù)荷升高；FW-2型軸流泵啟動(dòng)后心排量較心肌梗死模型建立后上升(P<0.05)；心肌梗死模型建立后肺動(dòng)脈楔壓較術(shù)前肺動(dòng)脈楔壓升高(P<0.05)，心肌梗死后心室的容量負(fù)荷升高；FW-2型軸流泵啟動(dòng)后肺動(dòng)脈楔壓較心肌梗死模型建立后肺動(dòng)脈楔壓下降(P<0.05)，F(xiàn)W-2型軸流泵啟動(dòng)后心室的容量負(fù)荷下降。FW-2型軸流泵卸負(fù)荷結(jié)果與Jung等[14]描述的經(jīng)典卸負(fù)荷效果相似，卸負(fù)荷作用確切。

表1　實(shí)驗(yàn)組心臟卸負(fù)荷評(píng)價(jià)(±s)

2.3兩組CTnI水平比較(見(jiàn)表2、圖2)實(shí)驗(yàn)組較對(duì)照組CTnI上升及下降均為一個(gè)緩慢的過(guò)程，相比對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組的缺血、缺氧心肌細(xì)胞是緩慢壞死的過(guò)程。實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組以時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行兩兩比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表2　兩組CTnⅠ水平比較

圖2　實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組CTn I均數(shù)比較

2.4HE染色實(shí)驗(yàn)組：心肌梗死區(qū)域存在大量細(xì)胞水腫、細(xì)胞核水腫，肌束水平波浪樣改變及橫紋紊亂的

冬眠心肌細(xì)胞，其形態(tài)特征與Page等[15]描述的冬眠心肌細(xì)胞特征相同，同時(shí)少量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。對(duì)照組：心肌壞死破壞程度較大，僅留有視野中央部分心肌纖維未被破壞，病理顯示大量心肌細(xì)胞破壞崩解并炎癥細(xì)胞滲出。

2.5TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況(見(jiàn)圖3)TUNEL標(biāo)記的細(xì)胞核被熒光激發(fā)后呈黃綠色，4，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)標(biāo)記后細(xì)胞核被熒光激發(fā)后呈藍(lán)色。實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞凋亡率低于對(duì)照組[(47.83±16.24)%比(75.80±11.16)%，P<0.05]。提示實(shí)驗(yàn)組梗死邊帶區(qū)域心肌細(xì)胞凋亡程度低于對(duì)照組。

注：A為實(shí)驗(yàn)組；B為對(duì)照組。

3討論

急性心肌梗死是心血管疾病中最危重的緊急事件之一，由于心肌細(xì)胞大量死亡，心臟泵功能衰竭，導(dǎo)致該病發(fā)病兇險(xiǎn)，死亡率高；同時(shí)由于大量心肌細(xì)胞死亡，炎癥細(xì)胞滲出引起的左室重構(gòu)與心臟破裂及真、假室壁瘤形成等嚴(yán)重并發(fā)癥和心臟擴(kuò)大、心力衰竭有關(guān)，也是影響AMI近遠(yuǎn)期預(yù)后的主要原因之一[16]。如何挽救更多的缺血、缺氧瀕臨死亡的心肌細(xì)胞，同時(shí)減輕心肌梗死后心室重構(gòu)是心肌梗死治療的目的之一。本實(shí)驗(yàn)在建立羊急性心肌梗死模型的基礎(chǔ)上，成功地運(yùn)用FW-2型軸流血泵進(jìn)行輔助循環(huán)，有效減少了缺血左室的容量負(fù)荷后，代表心肌破壞的CTnI、心肌凋亡以及病理結(jié)果均證實(shí)，通過(guò)對(duì)心肌梗死動(dòng)物模型使用左心輔助裝置，使心肌梗死心肌卸負(fù)荷，能夠有效減少心肌梗死心肌死亡、破壞，使原本將要死亡的心肌細(xì)胞在術(shù)后72 h仍以冬眠心肌細(xì)胞形式存在。

基于本實(shí)驗(yàn)結(jié)果認(rèn)為，在心肌梗死早期通過(guò)使用左心輔助裝置輔助心肌梗死心肌泵功能，能增加心排血量，維持臟器灌注，保護(hù)臟器功能，最主要的是能夠有效保護(hù)缺血、缺氧心肌，使本應(yīng)死亡的心肌梗死心肌細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)槎咝募〖?xì)胞而存活，從而為經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入(PCI)或心臟血管重建贏得時(shí)間，增加手術(shù)成功率。心肌炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)是心肌梗死后左室重構(gòu)的主要原因之一。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在心肌梗死早期使用左心輔助裝置，能有效減少炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，因此認(rèn)為使用左心輔助裝置能減輕心肌梗死后左室重構(gòu)的程度，并改善AMI近、遠(yuǎn)期預(yù)后。

參考文獻(xiàn)：

[1]Camici PG，Prasad SK，Rimoldi OE.Stunning，hibernation，and assessment of myocardial viability[J].Circulation，2008，117(1)：103-114.

[2]Fallavollita JA. Hibernating myocardium retains metabolic and contractile reserve despite regional reductions in flow，function，and oxygen consumption at rest[J].Circulation Research，2002，92(1)：48-55.

[3]Vanoverschelde JL，Wijns W，Borgers M，et al.Chronic myocardial hibernation in humans.From bedside to bench[J].Circulation，1997，95(7)：1961-1971.

[4]Wang TS，Hernandez AF，F(xiàn)elker GM，et al.Valvular heart disease in patients supported with left ventricular assist devices[J].Circ Heart Fail，2014，7(1)：215-222.

[5]Stepanenko A，Potapov EV，Jurmann B，et al.Outcomes of elective versus emergent permanent mechanical circulatory support in the elderly：a single-center experience[J].The Journal of Heart and Lung Transplantation， 2010，29(1)：61-65.

[6]Xydas S，Rosen RS，Pinney S，et al.Reduced myocardial blood flow during left ventricular assist device support：a possible cause of premature bypass graft closure[J].The Journal of Heart and Lung Transplantation，2005，24(11)：1976-1979.

[7]Kloner RA.Can myocardial infarct size be reduced by mechanically unloading the left ventricle? [J].Circulation，2013，128(4)：318-321.

[8]Sun X，Li J，Zhao W，et al.Early assistance with left ventricular assist device limits left ventricular remodeling after acute myocardial infarction in a swine model[J].Artif Organs，2016，40(3):243-251.

[9]Thiele H，Smalling RW，Schuler GC.Percutaneous left ventricular assist devices in acute myocardial infarction complicated by cardiogenic shock[J].European Heart Journal，2007，28(17)：2057-2063.

[10]Garatti A，Russo C，Lanfranconi M，et al.Mechanical circulatory support for cardiogenic shock complicating acute myocardial infarction：an experimental and clinical review[J].ASAIO J， 2007，53(3)：278-287.

[11]Selzman CH，Chang PP，Vernon-Platt T，et al.Use of the Jarvik 2000 continuous flow left ventricular assist device for acute myocardial infarction and cardiogenic shock[J].J Heart Lung Transplant，2007，26(7)：756-758.

[12]Westaby S，Anastasiadis K，Wieselthaler GM.Cardiogenic shock in ACS.Part 2： role of mechanical circulatory support[J].Nature Reviews Cardiology，2012，9(4)：195-208.

[13]Werdan K，Gielen S，Ebelt H，et al.Mechanical circulatory support in cardiogenic shock[J].European Heart Journal，2014，35(3)：156-167.

[14]Jung MH，Hassager C，Balling L，et al.Relation between pressure and volume unloading during ramp testing in patients supported with a continuous-flow left ventricular assist device[J].ASAIO J，2015，61(3)：307-312.

[15]Page BJ，Banas MD，Suzuki G，et al.Revascularization of chronic hibernating myocardium stimulates myocyte proliferation and partially reverses chronic adaptations to ischemia[J].Journal of the American College of Cardiology， 2015，65(7)：684-697.

[16]Latet SC，Hoymans VY，Van Herck PL，et al.The cellular immune system in the post-myocardial infarction repair process[J].Int J Cardiol，2015，179：240-247.

(本文編輯郭懷印)

Research on the Effects of Volume Unloading on Myocardial Cells with Left Ventricular Assist Device During the Early Stage of Myocardial Infarction

Gan Yu，Zhou Jianye，Hu Shengshou，Tang Yue，Yang Xinwei，Chen Haibo，Yan Xiaoqian，Sun Jiakang

The First Clinical College，Shanxi Medical University，Taiyuan 030001，Shanxi，China

Abstract：ObjectiveTo investigate the changes of cardiomyocyte after left ventricular assist device(LVAD) unloading in a ovine model of acute myocardial infarction (AMI)，in order to provide the evidence that LVAD could be used in AMI.MethodsAMI models were established in six adult sheep by ligation of circumflex coronary artery.Three of them were mechanically unloaded with an continue-flow LVAD (FW-2 axial pump) with heart beating.The others without LVAD supporting served as control.Postoperative 12 hours，24 hours，36 hours，48 hours，72 hours，CTn I and other routine serum items were examined to evaluate the damage of cardiomyocytes.After 72 hours，the hearts were harvested for histological examinations.TUNEL staining was performed to evaluate the apoptosis of cardimyocytes.ResultsThere were differences in CTn I value in each time point between two groups.Inflammatory cells infiltration was less both in the peri-infarction and infarction area of unloading group than those of control group.A large number of myocardial cells were in hibernation status.And the myocardial cell apoptosis was significantly lower than that in control group[(47.83±16.24)% vs (75.80±11.16)%，P<0.05)].ConclusionThe results suggest that early assistance with an LVAD in AMI can maintain myocardial cells in hibernation status，and inhibit apoptosis and inflammatory cells infiltration.These may provide a good condition for myocardial infarction treatment.

Key words：myocardial infarction；left ventricular assist device；unloading；animal model；myocardial hibernation；small tailed han sheep

(收稿日期：2015-12-18)

Corresponding Author：Zhou Jianye(State Key Laboratory of Cardiovascular Disease，F(xiàn)uwai Hospital，National Center for Cardiovascular Diseases，Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College，Beijing，100037，China)

中圖分類號(hào)：R547.2R256.2

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

doi：10.3969/j.issn.1672-1349.2016.09.012

文章編號(hào)：1672-1349(2016)09-0963-04

通訊作者：周建業(yè)，E-mail：zhoujianye@fuwaihospital.org

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金(No.81300183)；人工心臟專項(xiàng)基金[No.醫(yī)科函(2014)58號(hào)]