于　瑞，王幼平，崔　琳，李　彬，王新陸，謝世陽，高　原，朱明軍

河南中醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院(鄭州 450000)

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轉化生長因子β1對心肌成纖維細胞增殖及膠原分泌的影響

于瑞，王幼平，崔琳，李彬，王新陸，謝世陽，高原，朱明軍

河南中醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院(鄭州 450000)

摘要：目的探討轉化生長因子β1(TGF-β1)對原代培養(yǎng)的乳鼠心肌成纖維細胞(CFs)增殖與膠原合成的影響。方法出生1 d～3 d的SD大鼠，用胰蛋白酶消化、差速貼壁法分離培養(yǎng)乳鼠心肌成纖維細胞，用不同濃度的TGF-β1作用于心肌成纖維細胞，采用四氮唑鹽(MTT)法測定CFs增殖，羥脯氨酸試劑盒檢測膠原分泌，蛋白印跡法(Western Blot)檢測心肌成纖維細胞分泌的TGF-β1蛋白表達。結果與正常對照組比較，10 ng/mL TGF-β1組心肌成纖維細胞增殖明顯(P<0.05)；心肌成纖維細胞羥脯氨酸含量明顯增加(P<0.01)，同時TGF-β1蛋白表達明顯增加(P<0.05)。結論TGF-β1可引起心肌成纖維細胞的增殖，膠原分泌增加，同時可使蛋白TGF-β1蛋白含量增加。

關鍵詞：轉化生長因子β1；原代培養(yǎng)；心肌成纖維細胞；細胞增殖；膠原合成

心肌纖維化(myocardial fibrosis，MF)是各種病因所致持續(xù)性心肌損傷的病理性改變，主要表現(xiàn)為細胞增殖、膠原合成分泌過量[1]。MF不僅是各種心臟疾病發(fā)展到一定階段的病理產(chǎn)物，同時也是各種心臟疾病的誘因，如心力衰竭、惡性心律失常和心源性猝死等。有效的防治心肌纖維化的發(fā)生，對降低心血管疾病死亡率、改善心臟病病人生活質量有著極其重要的臨床意義。中醫(yī)藥對于心肌纖維化的治療具有多靶點、多層次、副反應小、經(jīng)濟費用低等獨特優(yōu)勢，近年來中藥復方及其有效成分對心肌纖維化的研究已成為熱點。

轉化生長因子β1(TGF-β1)是目前已知的與組織纖維化的發(fā)生關系最密切的生長因子。尤其在心臟重塑機制中起著至關重要的作用[2]。有研究證明[3]，TGF-β1在心肌缺血早期可以誘導單核細胞趨化以及淋巴細胞的浸潤，同時調控炎癥因子及氧化應激反應，使局部存活的心肌細胞肥厚，影響內皮細胞功能，其次TGF-β1誘導心肌成纖維細胞向肌成纖維細胞的轉化，進一步促進膠原蛋白沉積并抑制其降解。針對心血管系統(tǒng)，TGF-β1可產(chǎn)生以下影響：①調節(jié)成纖維細胞的表型轉化，增加膠原蛋白分泌，促進纖維化；②抑制基質金屬蛋白酶(MMPs)的活性和誘導合成蛋白酶抑制物，阻滯細胞外基質(ECM)的降解[4]；③參與β-腎上腺素介導的心肌重構[5]。總之，TGF-β1能誘導心肌成纖維細胞(cardiac fibroblasts，CFs)增殖，轉分化為肌成纖維細胞，同時刺激膠原蛋白、纖維聯(lián)結蛋白及蛋白多糖等細胞間質成分的合成，促進細胞間質的沉積。

本研究主要探討TGF-β1對原代培養(yǎng)的心肌成纖維細胞增殖以及膠原分泌合成的影響，為進一步建立離體心肌成纖維細胞纖維化模型，中藥或其有效成分防治心肌纖維化的研究奠定基礎。

1材料與方法

1.1實驗動物出生1 d～3 d的SD大鼠，雌雄不限，購于河南省動物實驗中心，許可證號：SCXK(豫)2010-0002，動物合格證號：41003100001896。

1.2主要實驗儀器RCO-3000TVBB型二氧化碳培養(yǎng)箱(美國REVCD公司)，Milli-Q Synthesis 超純水儀(美國Milipore公司)，Spetra Max M3酶標儀(美國Molecular Devices公司)，-70 ℃低溫冰箱(美國Thermo公司)，BCM-1300生物潔凈工作臺(蘇凈集團安泰公司)。

1.3試劑TGF-β1(PeproTech公司)，胎牛血清(以色列BI公司)，DMEM高糖、0.25%胰蛋白酶液、四氮唑鹽(MTT)、二甲基亞砜(DMSO)均購自北京Solarbio科技有限公司，羥脯氨酸試劑盒(南京建成科技有限公司)，TGF-β1一抗、GAPDH一抗(Abcam公司)，TGF-β1二抗、GAPDH二抗均購自Santa Cruz公司，其他試劑均為市售分析純。

1.4方法

1.4.1新生SD大鼠心肌成纖維細胞提取及培養(yǎng)出生1 d～3 d的SD大鼠，在無菌條件下取出心臟，沿房室分離部位剪去心房，留下心室，并仔細去除心底部結締組織及血管，置于4 ℃預冷的PBS溶液中，洗滌3次，用眼科剪剪成1 mm3大小的組織塊。加入心肌細胞消化液15 mL，置于37 ℃恒溫磁力攪拌器(速率40 r/min～60 r/min)中消化，每次8 min，至組織塊變?yōu)闊o色透明終止消化。棄去首次消化的上清，從第2次開始收集，加入等量含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)液終止消化。1 000 r/min離心10 min，棄上清，加入1 mL含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液輕輕吹打混勻，制成細胞懸液，置于200目篩網(wǎng)過濾。收集細胞懸液于培養(yǎng)瓶中，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中差速貼壁90 min，貼壁的細胞即為心肌成纖維細胞。待細胞成長接近融合時按1∶2傳代培養(yǎng)，本實驗采用第2代～4代細胞進行實驗。

1.4.2MTT法檢測TGF-β1對CFs增殖的影響取處于對數(shù)生長期的心肌成纖維細胞，密度調至5×104/mL接種于96孔板中，每孔加入100 μL細胞懸液，同時設有空白對照組(未接種細胞)，細胞培養(yǎng)24 h，饑餓12 h，使細胞處于同一生長周期。分為3組：正常對照組、1 ng/mL TGF-β1組、10 ng/mL TGF-β1組。加入含或不含TGF-β1的培養(yǎng)液繼續(xù)孵育24 h，每孔加入含5 mg/mL MTT的DMEM培養(yǎng)液100 μL，避光孵育4 h，小心吸取上清，每孔加入二甲基亞砜100 μL，震蕩10 min，使藍紫色結晶充分溶解。用酶標儀檢測各孔細胞490 nm波長處吸光度值。

1.4.3羥脯氨酸試劑盒檢測細胞上清液膠原含量取處于對數(shù)生長期的心肌成纖維細胞，密度調至5×104/mL接種于6孔板中，每孔接種1 mL細胞懸液，培養(yǎng)24 h后，饑餓12 h。分為兩組：正常對照組、10 ng/mL TGF-β1組。加入或未加入TGF-β1孵育24 h，收集上清于1.5 mL EP管中。按照羥脯氨酸試劑盒(消化法)說明書步驟操作，用酶標儀檢測各組上清550 nm處吸光度值。

1.4.4Western blot檢測心肌成纖維細胞TGF-β1蛋白含量將心肌成纖維細胞調至5×105/mL接種于6孔板中，每孔接種1 mL細胞懸液，培養(yǎng)24 h后，饑餓12 h。分為兩組：正常對照組、10 ng/mL TGF-β1組。加入或未加入TGF-β1孵育24 h，收集各組蛋白。置于4 ℃預冷的冰上，加入細胞裂解液裂解細胞，4℃ 120 000 r/min離心15 min，收集上清于-70 ℃冰箱凍存。將提取的細胞蛋白定50 μg，通過 SDS-PAGE 電泳跑膠分離，半干轉移法行PVDF轉膜，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，分別加入TGF-β1、GAPDH一抗4 ℃過夜，TBST洗膜，后置于37 ℃恒溫搖床孵育二抗1 h，TBST洗膜。ECL化學發(fā)光法暗室曝片。蛋白條帶采用Image J軟件分析，測定其灰度值。

2結果

2.1心肌成纖維細胞形態(tài)倒置顯微鏡下觀察，心肌成纖維細胞呈梭形或不規(guī)則的多邊形，排列緊密，胞質透明，胞核較大，呈橢圓形，輪廓清楚，細胞間可重疊交叉生長。心肌成纖維細胞形態(tài)見圖1。

圖1　心肌成纖維細胞

2.2TGF-β1誘導心肌成纖維細胞增殖的影響與正常對照組比較，1 ng/mL TGF-β1組、10 ng/mL TGF-β1組吸光度值均有升高趨勢。1 ng/mL TGF-β1組較正常對照組稍有增加(P>0.05)；10 ng/mL TGF-β1組增加顯著，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。詳見表1。

表1　TGF-β1誘導對心肌CFs

2.3TGF-β1對心肌成纖維細胞羥脯氨酸含量的影響10 ng/mL TGF-β1組較正常對照組比較，吸光度值含量增加明顯，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。詳見表2。

表2　TGF-β1對心肌成纖維細胞羥脯氨酸含量的影響(±s)

2.4TGF-β1對心肌成纖維細胞蛋白TGF-β1含量的影響與正常對照組比較，10 ng/mL TGF-β1組蛋白含量顯著增加，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。詳見圖2。

注：與正常對照組比較，﹟P<0.05。

圖2TGF-β1對心肌成纖維細胞分泌TGF-β1蛋白的影響

3討論

近年來大量研究表明，心肌纖維化與多種心血管疾病具有相關性，如高血壓病、心肌梗死、心力衰竭、風濕性心臟病等。同時MF是多種心血管系統(tǒng)疾病發(fā)展到一定階段的共同病理性改變，心室重構是其主要的病例特征，尤其表現(xiàn)在心肌僵硬度增加，心肌收縮力下降，冠脈血流儲備降低方面，甚則引起惡性心律失常和猝死，其危害性不容忽視。近年來，探討心肌纖維化的詳細發(fā)病機制，以及中藥復方、單味藥在干預心肌纖維化的作用成為熱點[6]。結合心肌成纖維細胞的增殖及膠原蛋白合成分泌增加是MF的細胞生物學基礎，所以藥物對體外CFs的抑制作用成為評價藥物防治MF的重要指標之一[7]。

TGF-β1是目前研究最多的參與到纖維化機制的細胞調控因子，其作為最重要的促纖維化生長因子[8]，不僅參與了上游各種生物工程以及信號傳導途徑的調節(jié)，同時可以直接刺激CFs的增殖。TGF-β1通過與細胞膜表面上的受體結合，然后激活信號傳導通路，發(fā)揮其生物學效應[9-10]。有研究證明[11]，肝細胞生長因子可以對TGF-β1誘導的心肌成纖維細胞的細胞增殖、膠原合成增加起到抑制作用。羅紅等[12]研究證明丹酚酸B可以顯著抑制TGF-β1誘導的心肌成纖維

細胞增殖，進一步為中藥防治心肌纖維化提供了新的思路和靶點。

本實驗結果在分子生物學的層面上證實，TGF-β1對體外培養(yǎng)的原代乳鼠心肌成纖維細胞的細胞增殖、膠原合成增加有促進作用，同時使蛋白TGF-β1的含量增加。進一步證實了TGF-β1在離體細胞實驗心肌纖維化模型的可行性。

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(本文編輯郭懷印)

(收稿日期：2016-01-19)

中圖分類號：R329.2R256.2

文獻標識碼：A

doi：10.3969/j.issn.1672-1349.2016.09.008

文章編號：1672-1349(2016)09-0952-03

通訊作者：朱明軍，E-mail：zhumingjun317@163.com

基金項目：國家自然科學基金項目(No.81173410)；河南省高?？萍紕?chuàng)新團隊支持計劃(No.13IRTSTHN012)；河南省中醫(yī)藥防治心血管疾病創(chuàng)新型科技團隊[No.豫科人組(2013)2號50]

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