葉　晶,　劉特思,　金賢國,　樸英實(shí),　趙元媛，　韓晶邑，　林貞花，　原田憲一，　任香善△

(1延邊大學(xué)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)教研室， 2延吉市中醫(yī)醫(yī)院消化內(nèi)科，吉林 延吉 133000； 3金澤大學(xué)醫(yī)學(xué)部病理學(xué)教研室，日本 金澤 9208640)

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NVP-BEZ235誘導(dǎo)多囊腎大鼠膽管上皮細(xì)胞自噬的機(jī)制研究*

葉晶1▲,劉特思1▲,金賢國2,樸英實(shí)1,趙元媛1，韓晶邑1，林貞花1，原田憲一3，任香善1△

(1延邊大學(xué)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)教研室，2延吉市中醫(yī)醫(yī)院消化內(nèi)科，吉林 延吉 133000；3金澤大學(xué)醫(yī)學(xué)部病理學(xué)教研室，日本 金澤 9208640)

[摘要]目的： 探討PI3K/Akt/mTOR雙靶點(diǎn)抑制劑NVP-BEZ235誘導(dǎo)多囊腎(polycystic kidney，PCK)大鼠膽管上皮細(xì)胞自噬的作用。方法: 免疫組化法檢測(cè)p-mTOR和p-Akt在PCK大鼠膽管上皮細(xì)胞中的水平。WST-1比色法檢測(cè)NVP-BEZ235對(duì)膽管細(xì)胞活力的抑制作用以及LC3、Beclin 1基因沉默和自噬特異性抑制劑3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine，3-MA)對(duì)細(xì)胞活力的影響。蛋白免疫印跡法檢測(cè)NVP-BEZ235對(duì)PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路相關(guān)蛋白及自噬標(biāo)志蛋白LC3和Beclin 1的變化。結(jié)果: p-mTOR和p-Akt在PCK大鼠膽管上皮細(xì)胞中顯著升高，NVP-BEZ235可明顯抑制膽管上皮細(xì)胞的活力，且呈濃度和時(shí)間依賴性改變(P<0.05)；NVP-BEZ235明顯抑制PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路相關(guān)蛋白的水平；并上調(diào)自噬標(biāo)志蛋白LC3 II/LC3 I比值和Beclin 1蛋白的表達(dá)水平。LC3、Beclin 1 基因沉默和3-MA均可明顯減弱NVP-BEZ235對(duì)細(xì)胞活力的抑制作用(P<0.01)。結(jié)論: NVP-BEZ235可抑制PCK大鼠膽管上皮細(xì)胞的活力，其機(jī)制與自噬密切相關(guān)。

[關(guān)鍵詞]自噬； PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路； 多囊腎； NVP-BEZ235

多囊腎(polycystic kidney，PCK)大鼠為Caroli病的動(dòng)物模型，常表現(xiàn)為多發(fā)性膽管囊狀擴(kuò)張和肝門靜脈纖維化[3]。Caroli 病的膽管上皮細(xì)胞過度增殖是導(dǎo)致膽管囊狀擴(kuò)張的主要機(jī)制之一[4-5]。而磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)信號(hào)通路參與和調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、凋亡、自噬等重要的細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，其異常活化引起包括乳腺癌、宮頸癌、肺癌、胃癌等多種疾病的發(fā)生[6-9]。蛋白激酶B(protein kinase B，PKB/Akt)和哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)是PI3K的主要下游效應(yīng)分子之一。研究發(fā)現(xiàn)，ARPKD患者的腎臟和肝臟中Akt、mTOR、S6等蛋白的磷酸化水平異常增高，因此該信號(hào)通路的異?；罨茿RPKD發(fā)生的主要機(jī)制[10]。NVP-BEZ235是一種新型的PI3K/mTOR 雙靶向抑制劑[11]，在多種腫瘤中通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和自噬抑制細(xì)胞的增殖[12-13]，但國內(nèi)尚未見NVP-BEZ235與ARPKD治療方面的研究。

本研究旨在明確NVP-BEZ235對(duì)細(xì)胞生長和自噬的影響，闡明其相關(guān)機(jī)制，為Caroli病的臨床治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

材料和方法

1材料

1.1試劑與抗體NVP-BEZ235(Selleck Chemicals)溶于DMSO中；3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine, 3-MA; Calbiochem)；Alexa-488熒光 II 抗以及Akt、p-Akt(Ser473)、S6、p-S6(Ser235/236)、mTOR、p-mTOR(Ser2448)、p-mTOR(Ser2481)、4E-BP1、p-4E-BP1(Thr37/46)、LC3、Beclin 1抗體(CST)；β-actin抗體(Abcam)。

1.2組織標(biāo)本正常和PCK大鼠肝組織蠟塊由日本金澤大學(xué)病理學(xué)教研室提供。10月齡大鼠的肝組織取出后，浸泡在4%甲醛緩沖液(pH 7.4)中進(jìn)行固定，經(jīng)石蠟包埋處理后，將蠟塊切成4 μm厚的切片，備免疫組化染色用。

2主要方法

2.1細(xì)胞培養(yǎng)正常和PCK大鼠膽管上皮細(xì)胞由日本金澤大學(xué)病理學(xué)教研室提供。細(xì)胞培養(yǎng)用DMEM/F-12培養(yǎng)液(含10% 胎牛血清、5 μmol/L 毛喉素、20 μmol/L表皮生長因子和1% 青-鏈霉素)，于37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。

本研究采用真假詞識(shí)別和褒貶判斷兩個(gè)任務(wù)揭示了社群性和能動(dòng)性信息加工過程的ERP特征。研究結(jié)果表明，個(gè)體對(duì)社群性詞語的識(shí)別和褒貶判斷要快于能動(dòng)性詞匯。在詞語識(shí)別任務(wù)中社群性詞匯誘發(fā)的N400潛伏期較長，而兩類詞匯誘發(fā)的波幅大小沒有差異；在褒貶判斷任務(wù)中社群性詞匯誘發(fā)的N400波幅較小，兩類詞匯誘發(fā)的潛伏期不存在差異。

2.2免疫組織化學(xué)染色免疫組化染色采用EnVision法，切片常規(guī)脫蠟，梯度乙醇入水，抗原修復(fù)分別用10 mmol/L枸櫞酸鹽檸檬酸鈉緩沖劑(pH 6.0)微波加熱20 min或乙二胺四乙酸(EDTA，pH 9.0)高壓加熱，p-mTOR (Ser2448)(1∶200)和p-Akt(1∶25) I 抗4 ℃過夜。 II 抗室溫孵育30 min，二甲基聯(lián)苯胺(DAB)顯色，蘇木素核染，中性樹脂封片。

2.3免疫蛋白印跡實(shí)驗(yàn)0、10、50、100 nmol/L NVP-BEZ235處理PCK大鼠膽管上皮細(xì)胞24 h，用T-PER蛋白提取液(Pierce)提取細(xì)胞總蛋白，40 μg蛋白經(jīng)4%～12% 梯度膠電泳，電轉(zhuǎn)至硝酸纖維膜，加 I 抗[Akt(1∶1 000)、p-Akt (1∶1 000)、S6(1∶500)、p-S6 (1∶500)、4E-BP1(1∶1 000)、p-4E-BP1(1∶1 000)、LC3(1∶500)和Beclin 1(1∶500)]4 ℃過夜，加HRP標(biāo)記 II 抗室溫孵育30 min，DAB顯色。

2.4LC3和Beclin1基因沉默實(shí)驗(yàn)LC3和Beclin1的siRNA和陰性對(duì)照均購自于Qiagen。siRNA轉(zhuǎn)染使用HiPerFect轉(zhuǎn)染試劑，具體實(shí)驗(yàn)步驟依據(jù)試劑盒說明進(jìn)行。用標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)液培養(yǎng)PCK大鼠膽管上皮細(xì)胞24 h后換成DMEM/F-12培養(yǎng)液、siRNA(10 nmol/L)和3 μL HiPerFect轉(zhuǎn)染試劑液的混合液，繼續(xù)培養(yǎng)72 h。

2.5WST-1比色法用NVP-BEZ235藥物之前，加入500 nmol/L 3-MA預(yù)處理PCK大鼠膽管上皮細(xì)胞1 h，再用100 nmol/L NVP-BEZ235與500 nmol/L 3-MA 共同處理細(xì)胞24 h，細(xì)胞活力用WST-1 比色法測(cè)定，按照試劑盒使用說明書操作。

2.6免疫熒光染色細(xì)胞接種于8孔熒光染色載玻片，NVP-BEZ235(100 nmol/L)處理24 h，用4% 多聚甲醛固定，用1% 的Triton X-100處理 10 min，血清封閉，加入LC3抗體(1∶200)4 ℃孵育過夜，加10 μg/L Alexa-488，DAPI染細(xì)胞核。

3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)應(yīng)用Prism 5.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行處理。所有數(shù)據(jù)使用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示；兩組間數(shù)據(jù)比較采用t檢驗(yàn)；多組間比較采用單因素方差分析,組間兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1在PCK大鼠膽管上皮細(xì)胞中p-mTOR和p-Akt蛋白水平增高

10月齡大鼠肝組織免疫組化染色示，p-mTOR蛋白陽性顆粒位于肝細(xì)胞和膽管細(xì)胞的細(xì)胞核和細(xì)胞漿，p-Akt蛋白主要位于肝細(xì)胞和膽管細(xì)胞的細(xì)胞核。這2種蛋白在正常大鼠膽管上皮細(xì)胞中顯色較弱，而在PCK大鼠膽管上皮細(xì)胞顯色較強(qiáng)，見圖1。

Figure 1. The p-mTOR and p-Akt in the bile duct epithelial cells were examined by immunohistochemistry. In the pictures, the arrows showed the interlobular bile ducts of normal rats and PCK rat dilated bile ducts (×400).

圖1PCK大鼠膽管上皮細(xì)胞中的p-mTOR和p-Akt蛋白

2NVP-BEZ235 抑制膽管上皮細(xì)胞活力

0、10、50和100 nmol/L NVP-BEZ235 分別作用正常和PCK大鼠膽管上皮細(xì)胞24 h、72 h和120 h后發(fā)現(xiàn)，NVP-BEZ235組與對(duì)照組相比可顯著抑制膽管上皮細(xì)胞活力，且在同一時(shí)間內(nèi)，隨藥物濃度增加其抑制效果更明顯，呈濃度和時(shí)間依賴性改變(P<0.05)，見圖2A。

Figure 2. The effect of NVP-BEZ235 on viability of cholangiocytes detected by WST-1 assay (A) and the effect of NVP-BEZ235 on the levels of PI3K/Akt/mTOR signaling pathway-related proteins in the PCK rat cholangiocytes detected by Western blot (B). Mean±SD. n=3.*P<0.05 vs 0 nmol/L group；#P<0.05 vs 10 nmol/L group;&P<0.05 vs 50 nmol/L group.

圖2不同濃度NVP-BEZ235對(duì)細(xì)胞活力及PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路相關(guān)蛋白水平的影響

3NVP-BEZ235 下調(diào)PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路相關(guān)蛋白的水平

不同濃度NVP-BEZ235 處理PCK大鼠膽管上皮細(xì)胞24 h后，p-mTOR(Ser2448)、p-mTOR(Ser2481)、p-Akt、p-S6和p-4E-BP1蛋白水平明顯下降，且呈劑量依賴性改變，NVP-BEZ235在100 nmol/L時(shí)，其抑制效果最為明顯(P<0.05)，見圖2B。

4NVP-BEZ235誘導(dǎo)PCK大鼠膽管上皮細(xì)胞自噬

蛋白免疫印跡法檢測(cè)自噬相關(guān)蛋白LC3和Beclin 1蛋白表達(dá)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，NVP-BEZ235作用PCK大鼠膽管上皮細(xì)胞24 h后，LC3 II/ LC3 I比值逐漸升高，表明NVP-BEZ235 能夠誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)自噬活性。Beclin 1蛋白表達(dá)水平也隨藥物濃度的增加逐漸增高(P<0.01)。LC3免疫熒光染色結(jié)果顯示，100 nmol/L NVP-BEZ235處理的PCK大鼠膽管上皮細(xì)胞的胞漿中用藥組LC3 陽性顆粒數(shù)量均明顯增加(P<0.05),見圖3。

Figure 3. Effect of NVP-BEZ235 on the autophagy of PCK rat cholangiocytes.A: the PCK cells treated with different concentrations of NVP-BEZ235 for 24 h, and then LC3 II/I ratio and Beclin 1 were significantly increased; B: the protein expression of LC3 increased in the PCK rat cholangiocytes treatment with NVP-BEZ235 (immunofluorescence staining,×400). Mean±SD. n=3～4.*P<0.05,**P<0.05 vs 0 nmol/L group.

圖3NVP-BEZ235對(duì)PCK大鼠膽管上皮細(xì)胞自噬的影響

5LC3、Beclin1 siRNA和3-MA可明顯逆轉(zhuǎn)NVP-BEZ235對(duì)PCK大鼠膽管上皮細(xì)胞活力的抑制效應(yīng)

LC3和Beclin1基因沉默方法干擾PCK大鼠膽管上皮細(xì)胞72 h，免疫熒光染色方法示LC3基因沉默后細(xì)胞漿內(nèi)綠色熒光顆粒(LC3陽性顆粒)明顯減少(P<0.05)，見圖4A。蛋白免疫印跡法顯示，Beclin1 基因沉默的細(xì)胞Beclin1表達(dá)顯著下調(diào)，說明siRNA干擾有效(P<0.05),見圖4B。LC3和Beclin 1siRNA對(duì)膽管上皮細(xì)胞的活力影響甚微，而與NVP-BEZ235共同處理可顯著逆轉(zhuǎn)NVP-BEZ235對(duì)細(xì)胞活力的抑制效果(P<0.01)，見圖4C。0.5 μmol/L 3-MA本身對(duì)PCK膽管上皮細(xì)胞活力的影響甚微，但與NVP-BEZ235共同處理后，NVP-BEZ235對(duì)細(xì)胞活力的抑制效果顯著逆轉(zhuǎn)(P<0.01)，見圖4D。上述結(jié)果提示NVP-BEZ235誘導(dǎo)的自噬是抑制PCK膽管上皮細(xì)胞生長的主要機(jī)制。

Figure 4. Effects of LC3 siRNA, Beclin 1 siRNA and 3-MA on the viability of PCK rat cholangiocytes inhibited by NVP-BEZ235. A: the results of immunofluorescence showed the silencing of LC3 for 72 h; B: the results of Western blot showed the silencing ofBeclin1 for 72 h; C: WST-1 assay determined the effect ofLC3 siRNA orBeclin1 siRNA for 72 h and NVP-BEZ235 for 48 h together on the viability of the cholangiocytes; D: WST-1 assay determined the effect of 3-MA and NVP-BEZ235 together for 48 h on the viability of in the cholangiocytes. Mean±SD. n=3～6.*P<0.05,**P<0.01 vs negative siRNA group;△△P<0.01vsNVP-BEZ235+negative siRNA group;##P<0.01 vs NVP-BEZ235 group.

圖4RNA干擾LC3、Beclin1基因表達(dá)和自噬抑制劑3-MA對(duì)NVP-BEZ235抑制細(xì)胞活力的影響

討論

PI3K/Akt/mTOR 信號(hào)傳導(dǎo)通路參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、凋亡、自噬等生物學(xué)功能，是抗腫瘤藥物研發(fā)的一個(gè)潛在靶點(diǎn)。NVP-BEZ235作為PI3K/Akt/mTOR的靶向抑制劑已用于多種腫瘤的治療。魏娟等[14]研究發(fā)現(xiàn)，NVP-BEZ235可通過抑制 mTOR 信號(hào)通路誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡，抑制肝癌HepG2細(xì)胞的增殖及轉(zhuǎn)移。NVP-BEZ235不僅誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，亦可引起細(xì)胞自噬。Yothaisong等[15]研究中表明，NVP-BEZ235可通過下調(diào)Akt/mTOR 通路誘導(dǎo)細(xì)胞自噬，抑制膽管上皮細(xì)胞的增殖。在本研究中，PCK大鼠膽管上皮細(xì)胞中磷酸化Akt 和磷酸化mTOR 水平增高，提示Akt/mTOR 信號(hào)通路的活化是導(dǎo)致PCK大鼠膽管上皮細(xì)胞過度生長的機(jī)制之一。

自噬與人類腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，并影響腫瘤進(jìn)程、腫瘤細(xì)胞凋亡及抗腫瘤治療等。mTOR是調(diào)控細(xì)胞自噬的重要通路。曹錦霞等[16]的研究表明，EGCG可通過mTOR通路誘導(dǎo)PC12細(xì)胞凋亡和自噬，從而抑制細(xì)胞增殖。謝彪等[17]的研究也提示，5-Aza誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞自噬和凋亡，進(jìn)而抑制細(xì)胞增殖。本文為進(jìn)一步闡明NVP-BEZ235誘導(dǎo)PCK大鼠膽管上皮細(xì)胞發(fā)生自噬的分子機(jī)制, 對(duì)Akt/mTOR 信號(hào)通路中一些關(guān)鍵蛋白的變化進(jìn)行了檢測(cè)。結(jié)果表明，NVP-BEZ235呈濃度依賴性地抑制Akt 及其下游靶蛋白mTOR、S6以及4E-BP1蛋白的磷酸化，但其總蛋白無變化，提示NVP-BEZ235僅抑制Akt/mTOR 信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白的活化。

自噬發(fā)生后，LC3 I和磷脂酰乙醇胺偶聯(lián)形成LC3 II，因此LC3 I向LC3 II的轉(zhuǎn)變代表了自噬的誘導(dǎo)。本研究用NVP-BEZ235處理細(xì)胞后，LC3 II/LC3 I 比值逐漸增高，另一自噬標(biāo)識(shí)蛋白Beclin 1蛋白表達(dá)量也隨藥物濃度增高而增高，說明NVP-BEZ235可誘導(dǎo)PCK大鼠膽管上皮細(xì)胞的自噬。

為了反證NVP-BEZ235誘導(dǎo)的自噬在抑制膽管上皮細(xì)胞生長中的機(jī)制，本研究觀察了LC3、Beclin1基因沉默和自噬抑制劑3-MA對(duì)膽管上皮細(xì)胞活力的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)自噬相關(guān)基因沉默和3-MA本身對(duì)細(xì)胞活力影響甚微，但可顯著逆轉(zhuǎn)NVP-BEZ235對(duì)細(xì)胞活力的抑制效應(yīng)，提示誘導(dǎo)細(xì)胞自噬是其主要機(jī)制之一。LC3、Beclin1基因沉默和3-MA 雖然明顯逆轉(zhuǎn)NVP-BEZ235對(duì)細(xì)胞活力的抑制作用，但并沒有完全逆轉(zhuǎn)，說明除自噬外，其它死亡方式亦可能存在。

綜上所述，PCK大鼠膽管上皮細(xì)胞過度生長與PI3K/mTOR 通路被異常激活相關(guān)。NVP-BEZ235通過誘導(dǎo)細(xì)胞自噬抑制膽管上皮細(xì)胞活力，提示NVP-BEZ235 有望成為Caroli病的治療藥物。

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(責(zé)任編輯： 盧萍， 羅森)

NVP-BEZ235 induces autophagy of polycystic kidney rat cholangiocytes

YE Jing1, LIU Te-si1, JIN Xian-guo2, PIAO Ying-shi1, ZHAO Yuan-yuan1, HAN Jing-yi1, LIN Zhen-hua1, HARADA Kenichi3, REN Xiang-shan1

(1Department of Pathology, Yanbian University Medical College,2Department of Gastroenterology, Yanbian Hospital of Traditional Chinese Medicine, Yanji 133000, China;3Department of Pathology, School of Medical Sciences, Kanazawa University, Kanazawa 9208640, Japan. E-mail: renxsh@ybu.edu.cn)

[ABSTRACT]AIM: To explore the effect of dual PI3K/Akt/mTOR inhibitor NVP-BEZ235 on autophagy of polycystic kidney (PCK) rat cholangiocytes. METHODS: The protein levels of p-mTOR and p-Akt in the bile duct epithelial cells were examined by immunohistochemistry. The effect of NVP-BEZ235 on the viability of cholangiocytes was detected by WST-1 assay. The levels of PI3K/Akt/mTOR signaling pathway and autophagy-related proteins with NVP-BEZ235 treatment were determined by Western blot. The effects of LC3 and Beclin 1 silencing, and authophagy-specific inhibitor 3-methyladenine (3-MA) on the cell viability were analyzed by WST-1 assay. RESULTS: The protein levels of p-Akt and p-mTOR were highly increased in the bile duct epithelium of the PCK rats. NVP-BEZ235 significantly inhibited the viability of the cholangiocytes in a dose- and time-dependent manner (P<0.05). NVP-BEZ235 significantly reduced the levels of PI3K/Akt/mTOR signaling pathway-related proteins in the PCK rat cholangiocytes. NVP-BEZ235 upregulated the autophagy-specific proteins LC3 II and Beclin 1. The inhibitory effect of NVP-BEZ235 on the cell viability was weakened by treatment with 3-MA and knockdown of LC3 and Beclin 1 (P<0.01).CONCLUSION: The PI3K/Akt/mTOR inhibitor NVP-BEZ235 suppresses the viability of PCK rat cholangiocytes, and the mechanism is closely related with autophagy.

[KEY WORDS]Autophagy; PI3K/Akt/mTOR signaling pathway; Polycystic kidney; NVP-BEZ235

[文章編號(hào)]1000- 4718(2016)05- 0886- 06

[收稿日期]2015- 11- 23[修回日期] 2016- 03- 03

*[基金項(xiàng)目]國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No. 413010033)；延邊大學(xué)自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No. 602013109)

通訊作者△Tel: 0433-2435092; E-mail: renxsh@ybu.edu.cn

[中圖分類號(hào)]R363

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A

doi:10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.05.020

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