代滿榮　洛若愚

luruoyu1018@126.com

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缺氧誘導(dǎo)因子-1α在子宮內(nèi)膜異位癥患者子宮內(nèi)膜的表達(dá)及意義

代滿榮1,2洛若愚1，*

luruoyu1018@126.com

【摘要】目的：觀察分析缺氧誘導(dǎo)因子-1α(HIF-1α)在子宮內(nèi)膜異位癥(簡稱內(nèi)異癥)患者子宮內(nèi)膜細(xì)胞的表達(dá)及意義。方法：收集不同r-AFS分期子宮內(nèi)異癥患者(內(nèi)異癥組，n=35)和同期子宮肌瘤患者(對(duì)照組，n=40)子宮內(nèi)膜組織標(biāo)本，應(yīng)用免疫組織化學(xué)(SP)技術(shù)檢測(cè)各組(期)HIF-1α的表達(dá)情況，分析組間差異及與r-AFS分期的相關(guān)性。結(jié)果：子宮內(nèi)異癥組異位、在位子宮內(nèi)膜HIF-1α陽性表達(dá)率分別為82.86%和77.14%，均明顯高于對(duì)照組子宮內(nèi)膜(52.50%)(χ2=7.741、4.920,P均<0.05)，且子宮內(nèi)異癥組子宮內(nèi)膜HIF-1α陽性表達(dá)率隨r-AFS分期提高而升高(r= 0.363，P<0.05)。結(jié)論：HIF-1α表達(dá)上調(diào)可能與子宮內(nèi)異癥的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。

【關(guān)鍵詞】子宮內(nèi)膜異位癥； 缺氧誘導(dǎo)因子-1α

子宮內(nèi)膜異位癥(簡稱內(nèi)異癥)是婦科常見病、多發(fā)病，是導(dǎo)致生育期婦女慢性腹腔痛、不孕的常見原因之一，約有8%-10%的生育期婦女患有此病[1]。子宮內(nèi)異癥的病因及發(fā)生機(jī)制目前仍不明確，研究[2]提示，血管生成在子宮內(nèi)異癥形成和發(fā)展中具有重要作用，但是子宮內(nèi)膜異位病灶如何獲得血管生成能力目前還不清楚。缺氧誘導(dǎo)因子-1α(Hypoxia-inducible Factor-1，HIF-1α)是機(jī)體缺氧狀態(tài)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子，通過促進(jìn)血管內(nèi)皮生長因子(Vascular Endothelial Growth Factor，VEGF)、血管生成素(Angiogenin，Ang)、血小板生長因子(Platelet Growth Factor，PGF)等的表達(dá)，對(duì)異位子宮內(nèi)膜的血管生成發(fā)揮重要作用[3，4]。本文采用免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測(cè)不同程度子宮內(nèi)異癥患者異位子宮內(nèi)膜、在位子宮內(nèi)膜HIF-1α的表達(dá)情況，并分析其臨床意義。

1資料與方法

1.1病例和分組

2012-10—2013-12在本院行子宮內(nèi)異癥手術(shù)治療患者(內(nèi)異癥組，n=35)，根據(jù)病檢結(jié)果并參照美國生育學(xué)會(huì)內(nèi)異癥分期標(biāo)準(zhǔn)(Revised Classification of American Fertility Society，r-AFS)[5]分為Ⅰ期(n=2)、Ⅱ期(n=8)、Ⅲ期(n=16)、Ⅳ期(n=9)。另選同期子宮肌瘤全切術(shù)患者作為對(duì)照組(n=40)。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)內(nèi)異癥組均為原發(fā)性子宮內(nèi)異癥患者，經(jīng)病理檢查確診；對(duì)照組既往均無子宮內(nèi)異癥或其它子宮內(nèi)膜疾病。(2)兩組患者均無內(nèi)分泌疾病、自身免疫性疾病、惡性腫瘤及嚴(yán)重肝、腎疾?。?3)兩組患者術(shù)前3個(gè)月未使用激素類藥物。兩組患者年齡、初潮年齡、月經(jīng)期別、人工流產(chǎn)次數(shù)、分娩次數(shù)等一般情況差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t值0.6-1.1，P>0.05)，見表1。收集標(biāo)本前，所有患者均知情同意。

表1　兩組一般情況比較±s)

1.2標(biāo)本采集和制片

快速切取同一子宮內(nèi)異癥患者異位和在位子宮內(nèi)膜以及對(duì)照者正常子宮內(nèi)膜組織，大小約1cm×1cm×1cm，立即用生理鹽水輕輕清洗表面血漬，10%福爾馬林固定24h后常規(guī)方法脫水、包埋、切片(厚約4μm)。

1.3免疫組化染色

1.3.1主要試劑：兔抗人HIF-1α多克隆抗體購自武漢谷歌生物工程有限公司(貨號(hào)：BA1231-3), DAB顯色試劑盒購自美國Sigma公司(貨號(hào)：1262159)，磷酸鹽緩沖溶液(PBS)購自碧云天公司,中性樹膠購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司。

1.3.2免疫組化染色方法：依照SP 試劑盒說明書，先置切片于65℃烘箱中烘片2h，再常規(guī)脫蠟至水化，微波加熱90s修復(fù)抗原，3%H2O2阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，正常山羊血清封閉20min，一抗?jié)窈?℃孵育過夜，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片；同時(shí)以PBS代替一抗作陰性對(duì)照，顯微鏡觀察結(jié)果。

1.3.3結(jié)果判定：SP染色子宮內(nèi)膜細(xì)胞胞漿呈淡棕色為弱陽性，棕色為陽性，棕褐色為強(qiáng)陽性[6]。光學(xué)顯微鏡下每張切片隨機(jī)選擇10個(gè)高倍視野，結(jié)合染色強(qiáng)度和陽性細(xì)胞數(shù)量取均值作為1例標(biāo)本結(jié)果納入各組進(jìn)行比較分析。觀察結(jié)果分為4級(jí)：(1)陽性細(xì)胞數(shù)<1%，且染色強(qiáng)度弱陽性為HIF-1α表達(dá)陰性；(2)陽性細(xì)胞數(shù)1%-10%，且>50%細(xì)胞染色強(qiáng)度弱陽性為HIF-1α表達(dá)弱陽性(+)；(3)陽性細(xì)胞數(shù)10%-60%，且>50%細(xì)胞染色強(qiáng)度弱陽性至強(qiáng)陽性為HIF-1α表達(dá)陽性(++) ；(4)陽性細(xì)胞數(shù)>60%，且50%以上細(xì)胞染色強(qiáng)度陽性至強(qiáng)陽性為HIF-1α表達(dá)強(qiáng)陽性(+++)。每組HIF-1α 陽性表達(dá)率的計(jì)算方法為每組(每期)SP結(jié)果(+)-(+++) 的細(xì)胞數(shù)占該組(期)標(biāo)本總細(xì)胞數(shù)的百分比。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2結(jié)果

2.1各組HIF-1α表達(dá)陽性率

HIF-1α在對(duì)照組和內(nèi)異癥組子宮內(nèi)膜均有表達(dá)，內(nèi)異癥組異位患者強(qiáng)陽性表達(dá)，主要見于胞漿內(nèi)，呈棕褐色、彌漫性或灶狀分布(圖1A)，內(nèi)異癥組在位患者為陽性表達(dá)，呈棕色、彌漫性分布(圖1B)；對(duì)照組子宮內(nèi)膜為弱陽性表達(dá)，呈淡棕色、散在分布(圖1C)。定量分析其陽性表達(dá)率，內(nèi)異癥組異位內(nèi)膜與在位內(nèi)膜HIF-1α陽性率分別為82.86%和77.14%，均顯著高于對(duì)照組(χ2=7.741,P<0.01；χ2=4.920,P<0.05)，異位內(nèi)膜和在位內(nèi)膜HIF-1α陽性表達(dá)率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.357,P>0.05)。見表2。

2.2內(nèi)異癥患者HIF-1α表達(dá)與r-AFS分期的關(guān)系

內(nèi)異癥Ⅰ期—Ⅳ期，HIF-1α表達(dá)率從50.00%升高到88.89%，明顯表現(xiàn)為隨r-AFS分期提高，HIF-1α表達(dá)逐漸增強(qiáng)。兩變量呈顯著正相關(guān)(r=0.363，P<0.05)。見表3。

表2　內(nèi)異癥組和對(duì)照組HIF -1α陽性表達(dá)率比較

注：與對(duì)照組比較，1)P<0.05，2)P<0.01

表3　r-AFS不同分期內(nèi)異癥患者HIF -1α表達(dá)陽性率

[本文圖1-圖3見封3]

3討論

子宮內(nèi)異癥指具有生長能力的子宮內(nèi)膜腺體和間質(zhì)在子宮腔以外部位生長引起的，以繼發(fā)性進(jìn)行性痛經(jīng)、慢性盆腔痛和不孕為主要臨床表現(xiàn)的激素依賴性婦科疾病，其發(fā)病機(jī)制仍不完全清楚。在較多機(jī)制學(xué)說如種植學(xué)說、體腔上皮化生學(xué)說、誘導(dǎo)學(xué)說、免疫學(xué)說中，目前更多傾向于種植學(xué)說，即子宮內(nèi)膜組織隨逆流的經(jīng)血通過輸卵管進(jìn)入盆腔及腹腔, 在局部細(xì)胞及細(xì)胞因子的參與下，逃避免疫清除并存活，繼而黏附、侵襲局部組織，形成異位病灶。HIF在此過程中扮演重要角色。

HIF-1是由HIF-1α和 HIF-β兩個(gè)亞基組成的異源二聚體[7]，其中HIF-1α既是活性亞基又是調(diào)節(jié)亞基，在機(jī)體缺氧情況下，通過與低氧反應(yīng)元件(Hypoxia Response Element，HRE)結(jié)合，調(diào)節(jié)下游靶基因的轉(zhuǎn)錄過程，涉及細(xì)胞凋亡、增殖、血管生成、能量代謝及紅細(xì)胞生成等諸多方面[8]。大量研究[9-12]表明HIF-1α在腫瘤的血管生成、侵襲和轉(zhuǎn)移等多種病理過程中發(fā)揮重要作用。子宮內(nèi)異癥雖屬良性疾病，但其增殖、浸潤、轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)等病理行為類似惡性腫瘤，HIF-1α在子宮內(nèi)異癥中的作用也受到廣泛關(guān)注。張曉梅等[13]報(bào)道50例子宮內(nèi)異癥患者在位、異位子宮內(nèi)膜VEGF及CD31的表達(dá)顯著高于正常子宮內(nèi)膜。Lu等[14]觀察到不同濃度氧預(yù)處理的內(nèi)異癥在位子宮內(nèi)膜移植到SCID小鼠，即重癥聯(lián)合免疫缺陷綜合癥( Severe Combined Immune Deficient Disease)小鼠后，發(fā)現(xiàn)低氧預(yù)處理能促進(jìn)子宮內(nèi)膜異位灶的增殖和血管生成相關(guān)標(biāo)志物如細(xì)胞增殖抗原標(biāo)記物(Ki67)、血小板內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子(Platelet Endothelial Cell Adhesion Molecule-1,PECAM-1,又稱CD31)、VEGF、HIF-1α表達(dá)上調(diào)，而高氧預(yù)處理則有抑制作用。Critchley等[15]研究發(fā)現(xiàn)HIF-1α在正常子宮內(nèi)膜的表達(dá)量在分泌晚期和月經(jīng)期最大。 Goteri等[16]在子宮內(nèi)異癥患者異位灶局部檢測(cè)到HIF-1α表達(dá)量顯著高于正常子宮內(nèi)膜組織。這些結(jié)果均表明內(nèi)異癥的發(fā)生發(fā)展與促血管因子表達(dá)上調(diào)和血管生成有關(guān)，HIF-1α可能在其中起到促進(jìn)作用。

本文樣本的對(duì)照組子宮內(nèi)膜、在位及異位子宮內(nèi)膜均被檢測(cè)到HIF-1α蛋白的表達(dá)，且異位內(nèi)膜及在位內(nèi)膜的HIF-1α表達(dá)顯著高于對(duì)照組內(nèi)膜，與上述報(bào)道相一致。內(nèi)異癥患者在位內(nèi)膜組織中增高的HIF-1α可能一方面通過其促增殖和抗凋亡作用[17]增加脫落內(nèi)膜組織在異常部位的存活能力；另一方面上調(diào)VEGF的表達(dá)[18]而為其在異常部位種植生長提供血管支持。進(jìn)一步分析內(nèi)異癥不同r-AFS分期患者異位灶局部HIF-1α的表達(dá)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著r-AFS分期的提高，HIF-1α的表達(dá)逐漸增強(qiáng)，兩者呈顯著正相關(guān)。提示HIF-1α不僅參與子宮內(nèi)異癥的發(fā)生，可能還促進(jìn)其進(jìn)展，如進(jìn)一步加重局部纖維化和異位灶內(nèi)缺氧，進(jìn)一步加重局部炎癥，使非低氧誘導(dǎo)的HIF-1α增加；增加的HIF-1α又進(jìn)一步促進(jìn)異位內(nèi)膜組織的增殖、侵襲能力，使內(nèi)異癥病變不斷發(fā)展和惡化。

總之，HIF-1α表達(dá)增加可能是子宮內(nèi)異癥發(fā)生發(fā)展的重要機(jī)制之一，理論上或可作為子宮內(nèi)異癥治療新靶點(diǎn)，但臨床可行性有待進(jìn)一步論證。

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代滿榮(1975-)，女，漢族，碩士研究生，副主任醫(yī)師，主要從事婦產(chǎn)科臨床工作

參考文獻(xiàn)

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The Expression of Hypoxia Inducible Factor-1α in the Endometrium of Patients with Endometriosis

DAI Man-rong1,2LUO Ruo-yu1，*

1Department of Gynecology,Renmin Hospital of Wuhan University,Wuhan 430060, China;2Department of Obstetrics and Gynecology, Xiantao People’s Hospital , Xiantao 433000, China;*Corresponding authors

【Abstract】Objective: To study the expression of hypoxia inducible factor-1α protein in the endometrium of patients with endometriosis.Method: The specimens were gathered from endometrium of 35 patients with endometriosis and 40 cases with hysteromyoma as control group. 35 cases with the endometriosis were staged according to the revised American Fertility Society System. Immunohistochemistry SP method was performed to examine the expression of hypoxia inducible factor-1α protein in the endometrium and the results were analyzed statistically.Results: The positive rates of hypoxia-inducible factor-1α protein in ectopic and eutopic endometria tissue were 82.86% and 77.14% respectively, which were significantly higher than that in control group (52.50%). There were statistical differences between the expression of hypoxia-inducible factor-1α protein in ectopic and eutopic endometria tissue and that in control group (χ2=7.741, χ2=4.920,P<0.05). The expression of hypoxia-inducible factor-1α protein was significantly positively correlated with r-AFS stage (r=0.363，P<0.05).Conclusion: The up-regulation of hypoxia-inducible factor-1α protein expression was possibly relevant to the development of the endometriosis.

【Key words】Endometriosis；Hypoxia inducible factor-1α

[中圖分類號(hào)]R711.71

[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A

[文章編號(hào)]1005-1740(2016)02-0014-04

第一作者簡介：本文

本文2015-12-16收到，2016-02-19修回