崔秀平 周子健

小兒急性肺損傷患者血清miR-155的表達(dá)水平及其臨床意義

崔秀平 周子健

目的 通過(guò)檢測(cè)小兒急性肺損傷（acute lung injury,ALI）患者血清中miR-155的表達(dá)水平，探討其在診斷和評(píng)估小兒ALI中的臨床意義。方法 選擇符小兒AMI診斷的患者30例作為研究對(duì)象，分別于明確診斷后1、3、5、7 d取患者血清樣本，采用實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR（RT-PCR）檢測(cè)血清miR-155表達(dá)改變情況；并與30例正常人進(jìn)行對(duì)照。探討血清miR-155的表達(dá)水平在診斷和評(píng)估小兒ALI上的臨床價(jià)值。結(jié)果 小兒ALI患者血清miR-155表達(dá)水平在明確診斷后1、3、5、7 d時(shí)均明顯高于正常對(duì)照組（P＜0.05）。隨著病情的緩解，血清miR-155表達(dá)呈逐漸下降趨勢(shì)。Pearson相關(guān)分析顯示，血清miR-155與APACHE-II評(píng)分具有顯著相關(guān)性（P＜0.05）。結(jié)論 在小兒ALI患者血清中血清miR-155的表達(dá)水平不僅能夠成為新的ALI檢測(cè)標(biāo)記物，還可以作為患者病情監(jiān)測(cè)的臨床指標(biāo)。

急性肺損傷；兒童；miR-155；血清

急性肺損傷（acute lung injury,ALI）以肺部炎癥炎癥和肺毛細(xì)血管通透性增加為特征的臨床綜合征。ALI導(dǎo)致彌漫性肺間質(zhì)及肺泡水腫，臨床上表現(xiàn)為進(jìn)行性低氧血癥和呼吸窘迫，嚴(yán)重時(shí)則進(jìn)展為急性呼吸窘迫綜合征（acute respiratory distress syndrome,ARDS）。由于小兒肺部發(fā)育尚不夠成熟和免疫力低下，因此ALI在小兒中的發(fā)病率要高于成人。近年流行病學(xué)統(tǒng)計(jì)顯示國(guó)外ALI占兒科重癥監(jiān)護(hù)病房收治的10%[1]。ALI屬于兒科臨床危重癥之一，由于目前臨床上缺乏具有較高敏感性和特異性的早期診斷ALI的生物標(biāo)記物，因此診治難度較大。微小RNA（miRNA）是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一類長(zhǎng)度約20～25 nt的非編碼調(diào)控單鏈小分子RNA。研究顯示，miRNA在調(diào)控腫瘤發(fā)生發(fā)展、炎癥免疫反應(yīng)等一系列重要生理病理過(guò)程起著非常重要的調(diào)控作用[2]。最新的研究證實(shí)，miRNAs能在血液中穩(wěn)定存在，且其表達(dá)譜和表達(dá)水平改變情況也與疾病有關(guān)[3]。因此，科學(xué)家們推測(cè)miRNA可能是一個(gè)理想的生物檢測(cè)標(biāo)志物。miR-155是目前已知的在炎癥和免疫反應(yīng)起重要調(diào)控作用的miRNA。本次研究我們通過(guò)檢測(cè)小兒ALI患者血清中miR-155的表達(dá)水平，探討其在診斷和評(píng)估小兒ALI中的臨床意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2013年5月～2015年5月在梅河口市中心醫(yī)院住院并確診的小兒ALI患者30例作為研究對(duì)象。所有小兒ALI患者均符合我國(guó)1999年中華醫(yī)學(xué)會(huì)推薦的ALI診斷標(biāo)準(zhǔn)：（1）有導(dǎo)致ALI的高危因素；（2）急性起病，呼吸頻數(shù)增加和（或）呼吸窘迫；（3）低氧血癥：ALI時(shí)PaO2/ FiO2≤300 mmHg；（4）胸部X線檢查示雙肺浸潤(rùn)陰影；（5）肺動(dòng)脈楔壓（PCWP）≤18 mmHg或臨床上能除外心源性肺水腫。其中男19例，女11例，年齡1～11歲，平均年齡（3.5±1.2）歲。另選擇30例正常小兒作為對(duì)照組。所有入選小兒家長(zhǎng)研究前均被告知簽署知情同意書。

1.2 方法 （1）血清樣本采集：所有研究對(duì)象均在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)采集靜脈血5 mL，室溫下自然凝固20 min，然后2 000 rpm/ min條件下離心15 min，吸出上層血清，放入-80℃冰箱待實(shí)驗(yàn)。（2）主要設(shè)備及試劑：RNAisoTMPlus和RT-PCR試劑盒（Takara公司）；mirVanaTMmiRNA Isolation Kit和miScript Reverse Transcription Kit（Ambion公司）；miR-1及U6引物序列購(gòu)于上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司；微量高速離心機(jī)（Eppendorf公司）；ABI PRISM 7900實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（ABI公司）。（3）miR-155的檢測(cè)：①血清總RNA提?。翰捎肦NAisoTMPlus并按照操作說(shuō)明提取血清中的總RNA，異丙醇沉淀法濃縮

RNA，NanoDrop? ND-1000檢測(cè)RNA濃度并評(píng)估純度，1.5%甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA質(zhì)量。②逆轉(zhuǎn)錄（RT）反應(yīng)：采用miScript Reverse Transcription Kit并按照實(shí)驗(yàn)步驟說(shuō)明進(jìn)行操作。建立20μL RT混合反應(yīng)體系：dNTP（2.5 mM each）2μL；Total RNA 0.3 ug；RT特異引物（1 uM）：0.5μL；MMLV反轉(zhuǎn)錄酶（10U/μL）：2μL；RNA酶抑制劑（40 u/ μL）：0.3μL；10×RT Buffer 2μL；加入無(wú)RNA酶水至總體積20μL。反應(yīng)條件：16℃：30 min；40℃：40 min；85℃：5 min。③PCR反應(yīng)：構(gòu)建20μL反應(yīng)體系：通用引物1μL，目的引物1μL，QuantiTect SYBR Green PCR Master Mix 10μL，模板CDNA 1μL，無(wú)RNA酶水7μL。按以下程序進(jìn)行擴(kuò)增：95℃，3 min；40個(gè)PCR循環(huán)（95℃，15 s；60℃，30 s；70℃，30 s）。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。以U6 snRNA作為內(nèi)參，數(shù)據(jù)采用2-ΔΔCT法進(jìn)行分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料結(jié)果用“x±s”表示，治療前后及組間比較用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料以構(gòu)成比表示，用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 RNA質(zhì)量檢測(cè)結(jié)果 提取血清RNA經(jīng)檢測(cè)吸光度（A）值A(chǔ)260/A280在1.6～1.8，表明RNA濃度和純度較高，無(wú)DNA及蛋白質(zhì)污染。變性凝膠電泳結(jié)果顯示為3個(gè)清晰條帶，18 S和28 S條帶清晰無(wú)明顯拖尾，證實(shí)RNA提取成功，無(wú)RNA降解發(fā)生。

2.2 小兒ALI患者和正常小兒血清miR-155表達(dá)比較 正常小兒血清中只表達(dá)較低水平的miR-155表，約為（0.12±0.02）；小兒ALI患者血清miR-155表達(dá)水平較正常小兒有顯著的升高，約為（1.41±0.36）；兩者比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見圖1。

圖1 各組血清miR-1表達(dá)情況比較

2.3 不同時(shí)間點(diǎn)小兒ALI患者血清miR-155表達(dá)情況小兒ALI患者血清miR-155表達(dá)水平在明確診斷后1、3、5、7 d時(shí)均明顯高于正常對(duì)照組，3 d左右達(dá)到高峰（P＜0.05）。隨著病情的緩解，血清miR-155表達(dá)呈逐漸下降趨勢(shì)。見圖2。

圖2 不同時(shí)間點(diǎn)小兒ALI患者血清miR-155表達(dá)

2.4 小兒ALI患者血清miR-155表達(dá)與APACHE-II評(píng)分的相關(guān)性分析 Pearson相關(guān)分析結(jié)果顯示，小兒ALI患者血清miR-155表達(dá)與APACHE-II評(píng)分的相關(guān)系數(shù)r=0.68，呈明顯正相關(guān)（P＜0.05）。

3 討論

ALI發(fā)病機(jī)制錯(cuò)綜復(fù)雜，涉及多種病理生理機(jī)制，目前已知各種致病因素導(dǎo)致的全身炎癥反應(yīng)是小兒ARDS的根本原因。ALI疾病進(jìn)展迅速，如果不能得到及時(shí)有效的治療。ALI會(huì)發(fā)展為ARDS，嚴(yán)重威脅患者的生命[4]。據(jù)流行病學(xué)資料顯示，美國(guó)ALI/ARDS的年總發(fā)病率為19萬(wàn)，其病死率高達(dá)30%～40%[5]。小兒ALI早期往往缺乏特異性表現(xiàn)，待出現(xiàn)典型臨床表現(xiàn)時(shí)疾病往往已進(jìn)展至中晚期。因此，尋找能早期診斷小兒ALI，且特異性、敏感性更高的標(biāo)志物，對(duì)于及時(shí)開展治療，改善患者預(yù)后是至關(guān)重要的。近年來(lái)，雖然在ALI的生物標(biāo)記物研究上已經(jīng)獲得一些進(jìn)展，如肺細(xì)胞及基質(zhì)損傷的生物標(biāo)記物（AECⅠ、Ⅱ損傷標(biāo)記物、層黏連蛋白、血管性血友病因子）和炎癥反應(yīng)標(biāo)記物（TNF-α、IL-6、IL-8）[6-8]。但目前臨床上尚缺乏具有較高敏感性和特異性的診斷ALI的生物標(biāo)記物。

miRNA是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一類非編碼調(diào)控單鏈小分子RNA。研究證實(shí)，miRNA可通過(guò)轉(zhuǎn)錄后水平下調(diào)炎癥因子和炎癥因子信號(hào)通路的受體來(lái)調(diào)控失衡的炎癥反應(yīng)，因此在炎癥免疫反應(yīng)過(guò)程起著非常重要的調(diào)控作用。值得關(guān)注的是，由于miRNA與疾病的發(fā)生及發(fā)展密切相關(guān)，且在患者病變組織、血液中均可以發(fā)現(xiàn)異常表達(dá)的，與疾病發(fā)展密切關(guān)聯(lián)的miRNAs。因此，miRNA具備成為新的疾病檢測(cè)標(biāo)志物的潛力[9]。

miR-155是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的免疫系統(tǒng)相關(guān)的miRNA之一，其位于人類21號(hào)染色體上B-cell Integration Cluster（bic）基因的第三個(gè)外顯子內(nèi)。研究表明，LPS刺激可導(dǎo)致人免疫細(xì)胞中miR-155表達(dá)升高，且這種改變與Toll樣受體（TLR）的活化有關(guān)，提示miR-155可能通過(guò)轉(zhuǎn)錄后水平下調(diào)炎癥因子和炎癥因子信號(hào)通路的受體來(lái)調(diào)控失衡的炎癥反應(yīng)，因而在人體的炎癥反應(yīng)和免疫調(diào)節(jié)過(guò)程中發(fā)揮重要作用[10-11]。

綜上所述，小兒ALI患者血清miR-155表達(dá)水平較正常小兒顯著升高。隨著病情的緩解，血清miR-155表達(dá)呈逐漸下降趨勢(shì)。Pearson相關(guān)分析顯血清miR-155與APACHE-II評(píng)分呈明顯正相關(guān)。以上數(shù)據(jù)結(jié)果表明，血清miR-155具備成為早期診斷小兒ALI的新指標(biāo)。而其血清水平的下降也預(yù)示著疾病的好轉(zhuǎn)，提示血清miR-155水平也可作為判斷ALI預(yù)后的重要指標(biāo)。此外，由于小兒ALI的整個(gè)病理過(guò)程主要由炎癥反應(yīng)介導(dǎo)，因此，能夠調(diào)控炎癥反應(yīng)的miR-155也可能成為ALI治療的潛在靶點(diǎn)。

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10.3969/j.issn.1009-4393.2016.30.007

吉林 135000 梅河口市中心醫(yī)院兒科 （崔秀平） 梅河口市中心醫(yī)院心內(nèi)科（周子?。?/p>