單孟林,丁 滔,鄭江花,程增輝,郭 穎,夏前林.復(fù)旦大學(xué)附屬公共衛(wèi)生臨床中心醫(yī)學(xué)檢驗科,上海 0508;.上海交通大學(xué)附屬第六人民醫(yī)院南院泌尿外科,上海 0033
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應(yīng)用甲基化基因檢測技術(shù)分析前列腺癌中HIC1的甲基化狀態(tài)
單孟林1,丁 滔2,鄭江花1,程增輝1,郭 穎1,夏前林1
1.復(fù)旦大學(xué)附屬公共衛(wèi)生臨床中心醫(yī)學(xué)檢驗科,上海 201508;2.上海交通大學(xué)附屬第六人民醫(yī)院南院泌尿外科,上海 200233
[摘要]背景與目的:癌高甲基化基因1(hypermethylated in cancer 1,HIC1)因表觀遺傳甲基化修飾導(dǎo)致其在多種癌細(xì)胞和組織中表達沉默,可能與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。而這一現(xiàn)象在前列腺癌研究中的報道甚少。該研究采用甲基化基因檢測技術(shù)對前列腺癌中HIC1啟動子進行甲基化狀態(tài)分析。方法:采用甲基化特異性聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(methylation-specific polymerase chain reaction,MSP)和亞硫酸鹽測序PCR(bisulfate sequencing PCR,BSP)技術(shù),對前列腺癌細(xì)胞PC3、C4-2B和正常前列腺上皮細(xì)胞PrEC,以及前列腺癌組織標(biāo)本和正常前列腺穿刺標(biāo)本,進行HIC1啟動子甲基化分析;并使用去DNA甲基化酶5-Aza-CdR處理PC3、C4-2B和PrEC,經(jīng)反轉(zhuǎn)錄PCR(reverse transcription-PCR,RT-PCR)和蛋白[質(zhì)]印跡法(Western blot)分析HIC1在基因水平和蛋白質(zhì)水平上的變化。結(jié)果:MSP分析結(jié)果發(fā)現(xiàn),在PC3、C4-2B和PrEC中HIC1甲基化率分別為78.23%、72.15%和10.63%,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。對36例人前列腺癌實體瘤和36例人前列腺正常穿刺組織進行BSP測序,統(tǒng)計顯示,甲基化率分別是80.30%和31.56%。5-Aza-CdR處理后的PC3、C4-2B和PrEC經(jīng)RT-PCR和Western blot分析發(fā)現(xiàn),與未處理對照相比,HIC1轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平表達均顯著上調(diào)。結(jié)論:在前列腺癌中,抑癌基因HIC1啟動子呈高度甲基化狀態(tài)并出現(xiàn)表達沉默或下調(diào),可作為前列腺癌的早期預(yù)測指標(biāo)和潛在的治療靶點。
[關(guān)鍵詞]甲基化特異性PCR;亞硫酸鹽測序PCR;前列腺癌;癌高甲基化基因1;甲基化
Correspondence to:ZHENG JianghuaE-mail:zhengjianghua2015@163.com
近年來,我國前列腺癌的發(fā)病率逐年上升,已躍居男性泌尿生殖系腫瘤的第3位[1],但前列腺癌侵襲轉(zhuǎn)移的作用機制尚不清楚[2-3]。癌高甲基化基因1 (hypermethylated in cancer 1,HIC1)是一種抑癌基因[4]。目前研究表明,在多數(shù)腫瘤中,HIC1經(jīng)常高甲基化,提高了甲基化轉(zhuǎn)移酶的活性,以至在癌細(xì)胞和癌組織中出現(xiàn)HIC1表達沉默[5-6],這可能與腫瘤的進展有關(guān)。然而,在前列腺癌中,HIC1的高甲基化情況及是否與前列腺癌進展有關(guān),目前報道甚少。因此有必要探討HIC1在前列腺癌不同進展時期的甲基化狀態(tài)。
本研究采用甲基化特異性聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(methylation-specific polymerase chain reaction,MSP)和亞硫酸鹽測序PCR(bisulfate sequencing PCR,BSP)技術(shù),對前列腺癌細(xì)胞和正常前列腺上皮細(xì)胞,以及前列腺癌組織標(biāo)本和正常前列腺穿刺標(biāo)本進行HIC1啟動子甲基化分析,以探討HIC1甲基化水平對前列腺癌發(fā)生、發(fā)展的影響。
1.1標(biāo)本及臨床病理資料
前列腺癌組織標(biāo)本來自2011年4月—2014年5月在汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬粵北人民醫(yī)院泌尿外科住院的36例患者,年齡56~85歲。術(shù)前均無藥物、外科去勢及放射治療史,經(jīng)手術(shù)或穿刺活檢,所有標(biāo)本經(jīng)組織病理學(xué)檢查證實為前列腺腺癌。按照Gleason評分、前列腺特異性抗原(prostate-specific antigen,PSA)水平、2002年AJCC的TNM分期系統(tǒng),所有患者均隨訪至2014 年3月。同時選取36例正常前列腺穿刺組織作為對照組,年齡55~89歲,術(shù)前無長期藥物治療史,血清PSA檢測均為陰性。所有組織樣本于離體30 min內(nèi)以0.9%NaCl溶液沖洗表面污物血漬后,于腫瘤邊緣細(xì)胞活力較好處切取腫瘤組織,剔除可能附著的血管、神經(jīng)及結(jié)締組織等迅速置于液氮中凍存,并轉(zhuǎn)存于-80 ℃冰箱備用。
1.2細(xì)胞復(fù)蘇及培養(yǎng)
人前列腺癌細(xì)胞系PC3、C4-2B、DU145和LnCap購自美國ATCC公司,保存于液氮中,復(fù)蘇后在含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基(美國GIBCO公司)中傳代培養(yǎng),培養(yǎng)箱條件為CO2體積分?jǐn)?shù)為5%、37 ℃恒溫。人前列腺正常上皮細(xì)胞PrEC購自武漢原生原代生物醫(yī)藥科技有限公司,需用專用培養(yǎng)基,其中加有特制的細(xì)胞因子和10%FBS。取對數(shù)生長期細(xì)胞進行實驗。
1.3基因組DNA提取及亞硫酸鹽處理
采用基因組DNA小量抽提試劑盒(離心柱式,購自碧云天生物技術(shù)研究所)抽提前列腺癌細(xì)胞與組織的基因組DNA,并進行純度鑒定,-20 ℃保存?zhèn)溆?。按照EZ DNA Methylation Gold Kit(ZYMO研究試劑公司)說明書操作,使抽提到的DNA中未發(fā)生甲基化的胞嘧啶通過亞硫酸氫鹽處理后全部轉(zhuǎn)化為尿嘧啶,而甲基化的胞嘧啶不變。
1.4HIC1啟動子區(qū)MSP和BSP分析和引物設(shè)計
從NCBI數(shù)據(jù)庫中選取HIC1(NM-006497.3,GeneID:3090)轉(zhuǎn)錄起始點上游-1 000 bp的核苷酸序列輸入分析軟件。使用的在線分析軟件為Methprimer(http://www.urogene.org/methprimer/ indexl.html),可以預(yù)測被分析序列內(nèi)的CpG島,完成MSP、甲基化非特異性PCR(unmethylationspecific PCR,USP)和BSP技術(shù)的引物設(shè)計。
1.5HIC1啟動子區(qū)MSP和BSP反應(yīng)
以修飾后的DNA作為模板,按照熱啟動Taq酶試劑盒ZymoTaqTMPreMix進行PCR擴增。反應(yīng)體系:ZymoTaqTMPreMix 25.0 μL,0.3~1.0 μmol/L的上下游引物(圖1),<200 ng/50 μL的模板DNA,加ddH2O至50 μL。PCR反應(yīng)條件:95 ℃預(yù)變性10 min;95 ℃變性30 s,65 ℃退火40 s,72 ℃延伸1 min,36個循環(huán);72 ℃終延伸7 min。取PCR產(chǎn)物5 μL,經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分離。
圖1 HIC1啟動子CpG島的情況Fig. 1 HIC1 promoter region CpG islands
1.6目的基因測序
在紫外燈下從瓊脂糖凝膠中切下含待回收DNA的凝膠,經(jīng)QIAquick Gel Extract Kit(購自德國QIAGEN公司)純化后用A Cloning Kit(購自美國Invitrogen公司)連接到PCR2.1載體,并將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)菌(購自上海申能博彩生物技術(shù)公司)。挑取選擇性培養(yǎng)基平板上白色的單菌落10~20個進行PCR鑒定,以電泳片段的大小區(qū)分目的基因,把含有目的基因的菌落接種于含有氨芐西林的LB中,37 ℃、250 r/min搖菌過夜,取1 mL菌液送上海生物工程公司測序,利用在線甲基化分析網(wǎng)站QOMA(http://quma.cdb. riken.jp/top/index.html)分析測序結(jié)果。
1.7HIC1表達的反轉(zhuǎn)錄PCR(reverse transcription-PCR,RT-PCR)檢測
分別提取5-Aza-Cd R處理后的實驗組和對照組的P C 3、C 4 - 2 B和P r E C細(xì)胞的總R N A,采用c D N A合成反轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)(購自美國P r o m e g a公司)將其反轉(zhuǎn)錄成cDNA,再進行RT-PCR檢測。引物(正義鏈):5'-GAGAGCTTCGGTGACAACCTGTA-3',引物(反義鏈):5'-TTCTTCCCGCAGATGGTGCA-3',反應(yīng)體系:cDNA 1 μL,10×Buffer 2.5 μL,dNTP (10 mmol/L) 0.5 μL,Taq 酶0.25 μL,無菌水5 μL,引物各2.5 μL,最后加DEPC水到25 μL。取PCR產(chǎn)物5 μL,經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定為單一條帶,產(chǎn)物大小符合。PCR所用引物采用Primer5.0在線軟件設(shè)計,基因序列通過NCBI網(wǎng)站獲得。所有引物均通過BLAST比對驗證其正確性,產(chǎn)物經(jīng)測序證實,以GAPDH作內(nèi)參。
1.8HIC1蛋白表達的蛋白[質(zhì)]印跡法(Western blot)檢測
將5-Aza-CdR處理后的實驗組和對照組的PC3、C4-2B和PrEC細(xì)胞按單層貼壁細(xì)胞總蛋白提取方法抽提細(xì)胞的蛋白質(zhì),經(jīng)Western blot檢測HIC1蛋白的表達。一抗為Anti-HIC1抗體(H8539,購自美國Sigma公司),按照說明書用5%脫脂奶粉TBST以1∶5 000比例稀釋后使用。
1.9統(tǒng)計學(xué)處理
實驗結(jié)果用SPSS 15.0軟件進行統(tǒng)計分析,所有數(shù)據(jù)均以±s表示,P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
2.1前列腺癌細(xì)胞中HIC1啟動子的分析
使用在線分析軟件M e t h p r i m e r預(yù)測H I C 1(N M - 0 0 6 4 9 7 . 3,G e n e I D:3 0 9 0)轉(zhuǎn)錄起始點上游- 1 0 0 0 b p區(qū)域內(nèi)存在3個主要的C p G島,G C百分比>50.0%,每個島均>100 bp,Obs/Exp>0.60(圖1);并且獲得HIC1啟動子CpG島2(-624~-495 bp)區(qū)域的MSP、USP和BSP引物共5對,選取其中1對行MSP、USP和BSP分析(表1)。
表1 HIC1啟動子CpG島2(-624~-495 bp)區(qū)域檢測引物Tab. 1 Primers used for MSP and BSP in HIC1 promoter region CpG island 2
圖2 MSP產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果Fig. 2 MSP reaction electrophoregram
2.2HIC1啟動子區(qū)MSP和BSP分析結(jié)果
MSP分析出現(xiàn)的大小為119 bp的瓊脂糖電泳條帶為陽性PCR產(chǎn)物,發(fā)現(xiàn)在人前列腺癌細(xì)胞株P(guān)C3、C4-2B中,HIC1啟動子呈高甲基化,在DU145、LnCap中,HIC1啟動子呈部分甲基化,而在人前列腺正常上皮細(xì)胞PrEC中,HIC1的啟動子幾乎沒有甲基化(圖2)。統(tǒng)計分析顯示,PC3、C4-2B和PrEC中HIC1甲基化率分別為78.23%、72.15%和10.63%,前列腺癌細(xì)胞PC3 和C4-2B分別與PrEC比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。BSP分析出現(xiàn)的大小為129 bp的瓊脂糖電泳條帶為陽性PCR產(chǎn)物,結(jié)果顯示,在人前列腺癌細(xì)胞系PC3中HIC1呈高甲基化,此結(jié)果與MSP結(jié)果相符(圖3)。
圖3 BSP產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果Fig. 3 BSP reaction electrophoregram
2.3目的基因測序結(jié)果
進一步針對HIC1啟動子區(qū)CpG島2的-624~-495 bp區(qū)域,對人前列腺癌細(xì)胞PC3、C4-2B和人前列腺正常上皮細(xì)胞PrEC進行BSP測序(圖4)。另外,對36例前列腺癌實體瘤和36例前列腺正常穿刺組織進行BSP測序,其中分別檢測到29例和11例HIC1啟動子發(fā)生高甲基化(表2),統(tǒng)計顯示甲基化比例分別是80.30%和31.56%,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。
圖4 人前列腺癌細(xì)胞系和人前列腺正常細(xì)胞系中HIC1啟動子BSP分析的測序峰圖Fig. 4 The sequencing results of HIC1 promoter region CpG island 2 purple represent methylated cytosine
表2 人前列腺癌實體瘤的甲基化水平和臨床資料Tab. 2 Clinical information and body tumor methylation status of prostate cancer patients
2.4RT-PCR和Western blot檢測結(jié)果
使用去DNA甲基化酶試劑5-Aza-CdR處理前列腺癌細(xì)胞株P(guān)C3、C4-2B和前列腺正常細(xì)胞株P(guān)rEc,經(jīng)RT-PCR(圖5A)和Western blot(圖5B)檢測發(fā)現(xiàn),與未處理對照相比,HIC1轉(zhuǎn)錄水平和蛋白的表達均顯著上調(diào)。
圖5 5-Aza-CdR處理前列腺癌細(xì)胞株和PrEc細(xì)胞中HIC1表達變化結(jié)果Fig. 5 The efects of 5-Aza-CdR on HIC1 expression
表觀遺傳學(xué)在腫瘤的形成過程中具有重要作用,是指在不改變基因組序列的前提下,通過DNA和組蛋白的修飾等來調(diào)控基因表達,其中以DNA甲基化最為常見[7-8]。在人類表觀遺傳學(xué)研究中,最常見的就是CpG二核苷酸中胞嘧啶的甲基化修飾。在正常細(xì)胞中,位于抑癌基因啟動子區(qū)的CpG島處于低水平或未甲基化狀態(tài),此時抑癌基因處于正常的開放狀態(tài),抑癌基因不斷表達抑制腫瘤的發(fā)生。而在腫瘤細(xì)胞中,該區(qū)域的CpG島被高度甲基化,染色質(zhì)構(gòu)象發(fā)生改變,抑癌基因的表達被關(guān)閉,從而導(dǎo)致細(xì)胞進入細(xì)胞周期,凋亡喪失,DNA修復(fù)缺陷,血管生成及細(xì)胞黏附功能缺失等,最終導(dǎo)致腫瘤發(fā)生[9]。由于CpG島的局部高度甲基化要早于細(xì)胞惡性增生,早在腫瘤臨床確診之前就可檢測出特異基因的甲基化異常的現(xiàn)象,故其甲基化的檢測對腫瘤的篩查和風(fēng)險評估、早期診斷、分期分型、預(yù)后判斷及治療監(jiān)測具有重要的意義[10-11]。DNA甲基化研究的檢測方法很多,MSP和BCP是2種候選基因甲基化分析方法。
HIC1是定位在CpG島的一種抑癌基因,位于人類第17號染色體短臂上(17p13.3)。有研究表明,HIC1轉(zhuǎn)錄起始于P0、P1和P2這3個獨立的啟動子,其中P1和P2富含GC序列[12]。HIC1啟動子CpG島2包含有11個CpG位點[13],其甲基化是一個漸進的過程,每一個胞嘧啶堿基都是逐漸被甲基化的。Gonzalgo等[14]認(rèn)為CpG島甲基化達到一定比例(>60%)時才足以完全關(guān)閉基因表達,而低比例的甲基化只能降低其表達。本研究對HIC1啟動子CpG島2(-624~-495 bp)區(qū)域的11個CpG位點行MSP、USP和BSP分析,結(jié)果顯示,在前列腺癌細(xì)胞系和患者組織中,抑癌基因HIC1啟動子的高甲基化水平均明顯高于正常對照(P<0.05)。經(jīng)DNA甲基化酶試劑5-Aza-CdR處理的PC3、C4-2B和PrEC細(xì)胞與未處理對照相比,HIC1轉(zhuǎn)錄和蛋白表達均顯著上調(diào),而前列腺正常細(xì)胞株P(guān)rEC中,HIC1轉(zhuǎn)錄和蛋白表達均沒有變化。這表明5-Aza-CdR作用于高甲基化前列腺癌細(xì)胞,使其發(fā)生去甲基化,恢復(fù)HIC1表達;而對低甲基化的前列腺正常上皮細(xì)胞,5-Aza-CdR處理沒有影響其表達。這說明可能是前列腺癌細(xì)胞中HIC1高甲基化引起其表達沉默。
前列腺癌是一種老年性疾病,而且早期難以發(fā)現(xiàn),用現(xiàn)有的診斷方法確診時,患者大多已經(jīng)發(fā)生了骨和肺部的轉(zhuǎn)移,延誤了治療時機。Kilinc等[15]發(fā)現(xiàn)在Gleason評分高的前列腺癌組織中抑癌基因HIC1、SFRP2和DAPK1呈高度甲基化。我們在前列腺癌細(xì)胞株和前列腺癌組織標(biāo)本中得到的結(jié)果與這些報道一致。認(rèn)為在前列腺癌細(xì)胞株和前列腺癌組織中,HIC1啟動子是高甲基化的,并且呈現(xiàn)表達缺失或下調(diào)。本研究結(jié)果提示,對前列腺癌的早期診斷可以從檢測HIC1的甲基化水平入手。Chen等[16]發(fā)現(xiàn)雜合敲除基因HIC1(+/-)小鼠能誘發(fā)多種腫瘤發(fā)生,提示HIC1很可能參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。HIC1啟動子高度甲基化如何調(diào)節(jié)前列腺癌的發(fā)生、發(fā)展和侵襲轉(zhuǎn)移,將是未來需要深入研究的方向。
[參 考 文 獻]
[1] CHIANG A C, MASSAGUé J. Molecular basis of metastasis [J]. N Engl J Med, 2008, 359(26):2814-2823.
[2] ENGSTROM C A. Hot flashes in prostate cancer:state of the science [J]. Am J Mens Health, 2008, 2(2):122-132.
[3] FITZPATRICK J M, SCHULMAN C, ZLOTTA A R, et al. Prostate cancer:a serious disease suitable for prevention [J]. BJU Int, 2009, 103(7):864-870.
[4] JENAL M, BRITSCHGI C, FEY M F, et al. Inactivation of the hypermethylated in cancer 1 tumour suppressor--not just a question of promoter hypermethylation?[J]. Swiss Med Wkly, 2010, 140:w13106.
[5] SAITO K, SAKURAI S, SANO T, et al. Aberrant methylation status of known methylation-sensitive CpG islands in gastrointestinal stromal tumors without any correlation to the state of c-kit and PDGFRA gene mutations and their malignancy[J]. Cancer Sci, 2008, 99(2):253-259.
[6] DUMONT N, WILSON M B, CRAWFORD Y G, et al. Sustained induction of epithelial to mesenchymal transition activates DNA methylation of genes silenced in basallike breast cancers[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2008, 105(39):14867-14872.
[7] CARMONA F J, ESTELLER M. Epigenomics of human colon cancer[J]. Mutat Res, 2010, 693(1-2):53-60.
[8] JONES P A, BAYLIN S B. The epigenomics of cancer[J]. Cell, 2007, 128(4):683-692.
[9] ESTELLER M. Cancer epigenomics:DNA methylomes and histone-modification maps[J]. Nat Rev Genet, 2007, 8(4):286-298.
[10] RAKYAN V K, HILDMANN T, NOVIK K L, et al. DNA methylation profiling of the human major histocompatibility complex:a pilot study for the human epigenome project[J]. PLoS Biol, 2004, 2(12):e405.
[11] FINAK G, BERTOS N, PEPIN F, et al. Stromal gene expression predicts clinical outcome in breast cancer[J]. Nat Med, 2008, 14(5):518-527.
[12] ZHENG J, XIONG D, SUN X, et al. Signification of hypermethylated in cancer 1 (HIC1) as tumor suppressor gene in tumor progression[J]. Cancer Microenviron, 2012, 5(3):285-293.
[13] ZHENG J, WANG J, SUN X, et al. HIC1 modulates prostate cancer progression by epigenetic modification[J]. Clin Cancer Res, 2013, 19(6):1400-1410.
[14] GONZALGO M L, HAYASHIDA T, BENDER C M, et al. The role of DNA methylation in expression of the p19/p16 locus in human bladder cancer cell lines[J]. Cancer Res, 1998, 58(6):1245-1252.
[15] KILINC D, OZDEMIR O, OZDEMIR S, et al. Alterations in promoter methylation status of tumor suppressor HIC1, SFRP2, and DAPK1 genes in prostate carcinomas[J]. DNA Cell Biol, 2012, 31(5):826-832.
[16] CHEN W Y, ZENG X, CARTER M G, et al. Heterozygous disruption of Hic1 predisposes mice to a gender-dependent spectrum of malignant tumors[J]. Nat Genet, 2003, 33(2):197-202.
Detection of HIC1 promoter methylation in prostate cancer using MSP and BSP methods
SHAN Menglin1,DING Tao2,ZHENG Jianghua1,CHENG Zenghui1,GUO Ying1,XIA Qianlin1(1.Department of Laboratory Medicine,Shanghai Public Health Clinical Center,F(xiàn)udan University,Shanghai 201508,China;2.Department of Urology,the Sixth People's Hospital South Campus,Shanghai Jiao Tong University,Shanghai 200233,China)
[Key words]Methylation specific PCR;Bisulfate sequencing PCR;Prostate cancer;Hypermethylated in cancer 1;Methylation
[Abstract]Background and purpose:Hypermethylated in cancer 1 (HIC1) is silenced in multiple cancer cells and tissues by DNA methylation of epigenetic modification, which may modulate the initiation and progression of tumors. However, there are few reports about this phenomenon in prostate cancer. This study aimed to investigate the status of HIC1 promoter methylation in prostate cancer using methylation methods. Methods:Methylation-specific polymerase chain reaction (MSP) and bisulfate sequencing PCR (BSP) were used to detect the methylation status of HIC1 promoter in prostate cancer cell lines PC3 and C4-2B, prostate normal cell line PrEC, primary Chinese PCa tissues and the respective healthy control cases. HIC1 expression level was respectively determined by reverse transcription-PCR (RT-PCR) and Western blot assays in PC3, C4-2B and PrEC cells treated with 5-Aza-CdR. Results:We found that the percentages of HIC1 promoter methylation were 78.23%, 72.15% and 10.63% in PC3, C4-2B and PrEC cells by MSP analyses. Moreover, the levels of methylated HIC1 promoter in 36 primary Chinese PCa tissues compared with the respective healthy control cases were 80.30% vs 31.56%. Expressions of HIC1 mRNA and protein level were restored in PC3 and C4-2B cells after5-Aza-CdR treatment. Conclusion:These findings demonstrate that HIC1 promoter region is hypermethylated in prostate cancer, which results in silence or downregulation of HIC1. The status of HIC1 methylation can be a valuable marker in the early stage of prostate cancer and a potential therapeutic target.
DOI:10.3969/j.issn.1007-3969.2016.04.002
中圖分類號:R737.25
文獻標(biāo)志碼:A
文章編號:1007-3639(2016)04-0290-07
基金項目:上海市自然科學(xué)基金面上項目(13ZR1435000);上海市科委2014年“科技創(chuàng)新行動計劃”實驗動物研究領(lǐng)域科技支撐重點項目(14140901400);國家自然科學(xué)基金面上項目(81372318);上海市教委科研創(chuàng)新項目(13YZ049);上海市衛(wèi)生局科研課題項目(20124309)。
通信作者:鄭江花 E-mail:zhengjianghua2015@163.com
收稿日期:(2015-07-09修回日期:2015-09-01)