曾林川，鄧慧敏，陳 君，竇茗瀚，徐 冶.吉林醫(yī)藥學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院，吉林 吉林 303；.吉林醫(yī)藥學(xué)院醫(yī)學(xué)科研實(shí)驗(yàn)室，吉林 吉林 303

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Ca2+在順鉑誘導(dǎo)人卵巢癌SKOV3細(xì)胞自噬反應(yīng)中的作用

曾林川1，鄧慧敏2，陳 君2，竇茗瀚2，徐 冶2
1.吉林醫(yī)藥學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院，吉林 吉林 132013；2.吉林醫(yī)藥學(xué)院醫(yī)學(xué)科研實(shí)驗(yàn)室，吉林 吉林 132013

［摘要］背景與目的：Ca2+在維持細(xì)胞生物活性方面扮演著很重要的角色，其在細(xì)胞內(nèi)的儲(chǔ)存、釋放和攝取主要受內(nèi)質(zhì)網(wǎng)調(diào)節(jié)，細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度的穩(wěn)態(tài)是維持細(xì)胞生物能量代謝、蛋白質(zhì)折疊和分泌的基礎(chǔ)條件。本研究探討Ca2+在順鉑誘導(dǎo)SKOV3細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激-自噬反應(yīng)中的作用機(jī)制。方法：取人卵巢癌SKOV3細(xì)胞系為研究對(duì)象，按以下步驟分組：① 探討順鉑誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與自噬反應(yīng)，用6 μg/mL的順鉑處理SKOV3細(xì)胞0、6、12和24 h；② 了解順鉑和毒胡蘿卜內(nèi)酯（thapsigargin，TG）誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激釋放的Ca2+與自噬的關(guān)系，分別用TG和順鉑處理SKOV3細(xì)胞0、9和12 h；③ 探究Ca2+對(duì)自噬的作用機(jī)制，分成對(duì)照組、順鉑組、TG組、BAPTA-AM組、順鉑聯(lián)合BAPTA-AM組和TG聯(lián)合BAPTA-AM組。用蛋白［質(zhì)］印跡法（Western blot）檢測內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白GRP78和自噬標(biāo)志性蛋白LC3蛋白的表達(dá)水平；用Fluo-4鈣離子熒光探針檢測細(xì)胞質(zhì)中的Ca2+濃度變化；間接免疫熒光染色后，用共聚焦顯微鏡檢測LC3蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果：SKOV3細(xì)胞經(jīng)6 μg/mL順鉑作用6 h時(shí)GRP78灰度值（1.393±0.004）與其對(duì)照組（0.679±0.011）相比顯著提高（t=113.2，P=0.000），在12 h時(shí)LC3灰度值（0.072±0.002）與其對(duì)照組（0.038±0.000）相比顯著提高（t=25.5，P=0.000）。間接免疫熒光結(jié)果顯示，順鉑（6 μg/mL）組和TG（3 μmol/L）組隨作用時(shí)間的延長，細(xì)胞內(nèi)LC3熒光斑點(diǎn)會(huì)逐漸增多，并伴隨著細(xì)胞質(zhì)Ca2+濃度上升。后經(jīng)鈣離子絡(luò)合劑BAPTA-AM干預(yù)后，細(xì)胞內(nèi)LC3熒光強(qiáng)度進(jìn)一步增強(qiáng)。Westren blot結(jié)果顯示，順鉑組LC3灰度值（0.039±0.000）小于順鉑聯(lián)合BAPTA-AM組（0.071±0.001），TG組（0.035±0.001）小于TG聯(lián)合BAPTA-AM組（0.065±0.001），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.000）。結(jié)論：順鉑誘導(dǎo)SKOV3細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和自噬的發(fā)生，并伴隨著細(xì)胞質(zhì)內(nèi)Ca2+濃度的上升。絡(luò)合細(xì)胞質(zhì)內(nèi)Ca2+能增強(qiáng)順鉑誘導(dǎo)的自噬反應(yīng)。

［關(guān)鍵詞］順鉑；Ca2+；內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激；自噬

Correspondence to：XU YeE-mail：xuye_9707@163.com

卵巢癌是臨床上常見的婦科惡性腫瘤之一，發(fā)病率高居女性最常見癌癥的第3位，嚴(yán)重威脅女性的生命健康。由于卵巢癌早期沒有具體的臨床癥狀，再加上很多女性忽視了定期體檢，造成絕大多數(shù)女性到卵巢癌晚期才被發(fā)現(xiàn)［1-2］。目前，卵巢癌在我國的死亡率高達(dá)3.13/10萬［3］。臨床上治療卵巢癌的主要手段是化療，順鉑是臨床上治療癌癥的主要化療藥物之一，它的主要抗癌機(jī)制是抑制癌癥細(xì)胞的DNA復(fù)制過程［4］。已有研究報(bào)道，順鉑在誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞凋亡過程中促發(fā)了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和自噬，抑制自噬增加了卵巢癌細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性［5］。

自噬是細(xì)胞吞噬自身蛋白質(zhì)或細(xì)胞器并使之包被進(jìn)入囊泡，最終與溶酶體融合降解其內(nèi)容物的過程，自噬在細(xì)胞器的更新、體內(nèi)蛋白質(zhì)的平衡和細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定方面發(fā)揮著主要的作用。同時(shí)，自噬也是程序性細(xì)胞死亡的一種形式。因此，自噬是細(xì)胞內(nèi)的一把雙刃劍，但自噬在細(xì)胞內(nèi)的作用以前者為主［6］。最近，越來越多的文獻(xiàn)表明，Ca2+在自噬發(fā)生過程中發(fā)揮重要的作用［7-8］。Ca2+是細(xì)胞的重要第二信使之一，在維持細(xì)胞代謝、增殖、分化和凋亡過程中發(fā)揮著重要的作用。細(xì)胞內(nèi)的Ca2+濃度依賴于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中Ca2+的釋放和細(xì)胞外Ca2+的攝入。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激會(huì)誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度的增高和自噬的增強(qiáng)［9-10］。本文旨在探討Ca2+在順鉑誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞發(fā)生自噬中的作用。

1　材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

本研究所用的人卵巢癌細(xì)胞株SKOV3購自中國科學(xué)院，RPMI 1640培養(yǎng)基和胎牛血清由Hyclone公司提供，BAPTA-AM、鈣離子探針Fluo-4和順鉑均購自美國Sigma公司，LC3B抗體、GRP78抗體和β-actin抗體均購自美國Santa Cruz公司，PVDF膜（0.45 μm）購自Millipore公司。其他試劑為進(jìn)口或國產(chǎn)分析純。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)

人卵巢癌細(xì)胞株SKOV3用含10%胎牛血清、青霉素（100 U/mL）和鏈霉素（100 U/mL）的RPMI 1640培養(yǎng)液培養(yǎng)，置于37℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每天換液1次，待細(xì)胞生長至對(duì)數(shù)生長期時(shí)，用0.25%胰酶進(jìn)行消化，按1∶4比例進(jìn)行傳代，待細(xì)胞傳至第3代后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)分組：① 探討順鉑誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與自噬的關(guān)系，按順鉑給藥時(shí)間分成0、6、12和24 h 4組；② 觀察順鉑和毒胡蘿卜內(nèi)酯（thapsigargin，TG）誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激釋放的Ca2+與自噬的關(guān)系，分別檢測0、9和12 h 3個(gè)時(shí)間點(diǎn)；③ 探討Ca2+對(duì)自噬的影響，實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組、順鉑組、TG組、BAPTA-AM組、順鉑聯(lián)合BAPTA-AM組和TG聯(lián)合BAPTA-AM組。每次實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3Fluo-4檢測細(xì)胞質(zhì)內(nèi)Ca2+

將SKOV3細(xì)胞用不含乙二胺四乙酸的胰蛋白酶消化，收集總細(xì)胞。計(jì)數(shù)后，按每孔5×104個(gè)細(xì)胞鋪在24孔板內(nèi)，放置在恒溫培養(yǎng)箱中過夜。第2天，細(xì)胞長至80%密度，實(shí)驗(yàn)組分為順鉑（6 μg/mL）和TG（3 μmol/L）9、12 h兩組和無藥物作用的陰性對(duì)照組，每組設(shè)3個(gè)對(duì)照組。吸出每孔藥物，并加入D-Hanks液洗3次，然后各加入稀釋后的Fluo-4（5 μmol/L）。30 min后用D-Hanks液洗3次，處理完后在激光掃描共聚焦顯微鏡下觀察并取圖分析。

1.4間接免疫熒光法檢測自噬標(biāo)志性蛋白LC3

高壓消毒后無菌蓋玻片置于24孔板中，取細(xì)胞密度1×105/mL，每孔500 μL接種過夜，第2天，細(xì)胞長至80%密度，實(shí)驗(yàn)組分別用順鉑6 μg /mL處理9、12 h，同時(shí)設(shè)置未加順鉑的陰性對(duì)照組。棄去培養(yǎng)基，加入200 μL固定液（4%多聚甲醛）作用10 min，吸去固定液加0.01 mol/L 的PBS洗滌后，爬片固定后經(jīng)0.1%的PBS-Triton作用5 min，用0.01mol/L的PBS洗滌，非免疫山羊血清封閉30 min，加入預(yù)混的一抗4 ℃過夜，用0.01mol/L的PBS洗滌，加入預(yù)混的熒光二抗Alexa Fluor 488抗兔的IgG抗體作用30 min，用0.01 mol/L的PBS洗滌，抗熒光淬滅劑封片，用激光共聚焦顯微鏡觀察并取圖分析。

1.5蛋白［質(zhì)］印跡法（Western blot）檢測

通過Western blot檢測人卵巢癌SKOV3細(xì)胞中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和自噬反應(yīng)中相關(guān)蛋白的表達(dá)。提取細(xì)胞總蛋白，不同的藥物處理后，經(jīng)消化收集到離心管中，175×g離心取上清液轉(zhuǎn)移到1.5 mL離心管中，進(jìn)一步混勻，4 ℃，900×g再次離心。吸凈上清液，每管加入200～300 μL 的RIPA蛋白裂解液（含1%PMSF），超聲5 s左右打碎基因組后4 ℃放置45 min（以上全程冰上操作）。Bradford法測蛋白濃度，-20 ℃?zhèn)溆?。取待測樣本按30～60 μg上樣，10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳常規(guī)電泳、半干轉(zhuǎn)膜法將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉、一抗4 ℃過夜，二抗溫育2 h，用0.01 mol/L的PBS洗膜3次，1次15 min，2次5 min，加ECL顯色液進(jìn)行顯影結(jié)果。數(shù)據(jù)采用天能圖像分析系統(tǒng)以及Quantity One軟件進(jìn)行分析。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2　結(jié)果

2.1順鉑誘導(dǎo)SKOV3細(xì)胞內(nèi)GRP78表達(dá)和LC3的活化

用順鉑6 μg/mL處理SKOV3細(xì)胞0、6、12和24 h。Western blot檢測結(jié)果表明，順鉑能夠誘導(dǎo)SKOV3細(xì)胞GRP78和LC3高表達(dá)，且GRP78表達(dá)增強(qiáng)早于LC3，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，圖1）。

2.2順鉑誘導(dǎo)SKOV3細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)內(nèi)Ca2+水平的增加和LC3的活化

根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，用共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞質(zhì)中Fluo-4所標(biāo)記的Ca2+熒光，通過間接免疫熒光法檢測自噬標(biāo)記蛋白LC3。結(jié)果顯示，TG和順鉑處理9 h后，SKOV3細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度增強(qiáng)，表明細(xì)胞質(zhì)中的Ca2+水平增加；與此同時(shí)，LC3熒光結(jié)果顯示，細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)熒光斑點(diǎn)，說明順鉑和TG在誘導(dǎo)自噬的活化過程中，可能與細(xì)胞質(zhì)中Ca2+濃度變化有關(guān)（圖2）。2.3BAPTA-AM增強(qiáng)順鉑和TG所誘導(dǎo)LC3的表達(dá)免疫熒光結(jié)果顯示，10 μmol/L BAPTA-AM作用于SKOV3細(xì)胞后出現(xiàn)LC3熒光小斑點(diǎn)。分別用6 μg/mL順鉑和3 μmol/L TG聯(lián)合鈣離子絡(luò)合劑BAPTA-AM時(shí)，LC3的綠色熒光要明顯強(qiáng)于各自的單獨(dú)作用組（圖3）。此外，采用Western blot對(duì)順鉑和TG的單獨(dú)作用組及各自聯(lián)合鈣離子絡(luò)合劑后的LC3蛋白表達(dá)結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果顯示，LC3的蛋白表達(dá)情況與LC3免疫熒光結(jié)果一致，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，圖4）。

圖1　Western blot檢測順鉑對(duì)SKOV3細(xì)胞GRP78、LC3蛋白表達(dá)的影響Fig. 1　　Western blot detection of the expression of GRP78 and LC3 in SKOV3 cells treated with 6 μg/mL cisplatin

圖2　共聚焦顯微鏡觀察順鉑和TG處理不同時(shí)間后SKOV3細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)中Ca2+濃度變化和LC3蛋白的表達(dá)Fig. 2　　Observation of the distribution of Ca2+and LC3 in the cytoplasm of SKOV3 cells treated with 6 μg/mL cisplatin or 3 μmol/L TG for 0，9，and 12 h by confocal microscopy

圖3　免疫熒光染色檢測順鉑、TG、BAPTA-AM及聯(lián)合用藥組中LC3蛋白的表達(dá)情況Fig. 3　　Immunofuorescence staining for the LC3 expressions in SKOV3 cells treated with cisplatin，TG and/or BAPTA-AM

（×1 200）

圖4　Western blot檢測順鉑、TG、BAPTA-AM以及聯(lián)合用藥組中LC3蛋白的表達(dá)情況Fig. 4　　Western blot analysis for the protein expressions of LC3Ⅱ/LC3Ⅰin SKOV3 cells treated with cisplatin，TG and/or BAPTA-AM

3　討論

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與自噬之間復(fù)雜的調(diào)控機(jī)制，具有促進(jìn)細(xì)胞存活和死亡的雙向選擇效應(yīng)［11-12］。通過揭秘內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與自噬復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)，有可能提高化療藥物的治療效果和克服腫瘤的耐藥性［13-14］。GRP78作為一種內(nèi)質(zhì)網(wǎng)伴侶蛋白，在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激狀態(tài)下會(huì)高表達(dá)，被視為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)的標(biāo)志性蛋白［15］。細(xì)胞發(fā)生自噬時(shí)，參與自噬體形成的LC3蛋白活化，由LC3-Ⅰ轉(zhuǎn)化為脂質(zhì)化的LC3-Ⅱ。LC3-Ⅱ/ LC3-Ⅰ比值的多少在某種程度上反映了細(xì)胞的自噬活性［16］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，順鉑作用SKOV3細(xì)胞6 h時(shí)，GRP78蛋白就已經(jīng)明顯上調(diào)，然而，LC3蛋白的表達(dá)發(fā)生12 h左右。這說明順鉑能誘導(dǎo)SKOV3細(xì)胞發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和自噬反應(yīng)，且自噬的發(fā)生可能是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激所介導(dǎo)的下游效應(yīng)。

已有研究表明，刺激內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)的Ca2+進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)會(huì)促發(fā)自噬反應(yīng)的活化［17-18］，如維生素D3、離子霉素和三磷酸腺苷，TG誘導(dǎo)細(xì)胞中的Ca2+水平升高，通過激活Ca2+/鈣調(diào)蛋白依賴激酶β使下游AMPK興奮而誘導(dǎo)自噬。也有研究顯示，Ca2+進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)具有抑制自噬活化的作用［19］，如Xestospongin B/siRNA阻滯劑，抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的Ca2+釋放通道1，4，5-三磷酸肌醇受體后，會(huì)促發(fā)自噬。L型鈣通道阻滯劑通過抑制鈣蛋白酶活性也能誘導(dǎo)自噬。以上資料表明，鈣信號(hào)對(duì)自噬活化起著重要的調(diào)節(jié)作用，但是具體的作用機(jī)制一直存在爭議。這可能是由于探究的腫瘤細(xì)胞種類不同及技術(shù)條件限制，導(dǎo)致很多機(jī)制都未被闡明所引起的。隨著對(duì)細(xì)胞內(nèi)鈣信號(hào)檢測手段的完善，我們選擇目前靈敏度較高的Fluo-4作為鈣離子探針，檢測細(xì)胞質(zhì)中的Ca2+濃度的變化，運(yùn)用國際公認(rèn)的標(biāo)準(zhǔn)Ca2+絡(luò)合工具藥BAPTA-AM，探究順鉑誘導(dǎo)SKOV3內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的自噬反應(yīng)與細(xì)胞質(zhì)中的Ca2+濃度波動(dòng)的關(guān)系，并以TG作為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激模型組。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，單獨(dú)順鉑或TG可以誘導(dǎo)SKOV3發(fā)生自噬，在聯(lián)合鈣離子絡(luò)合劑BAPTA-AM后，自噬標(biāo)志性蛋白LC3的表達(dá)明顯上調(diào)。這說明緩沖順鉑和TG所誘導(dǎo)的細(xì)胞質(zhì)中的Ca2+上升后，能夠增強(qiáng)其下游的自噬反應(yīng)。這一過程可能與溶酶體的功能有關(guān)，由于絡(luò)合細(xì)胞質(zhì)中的Ca2+，使得溶酶體對(duì)自噬體的降解被抑制，從而抑制了自噬的降解［20］。也有可能是由于絡(luò)合了細(xì)胞質(zhì)中的Ca2+，使得進(jìn)入線粒體內(nèi)的Ca2+減少，導(dǎo)致通過線粒體內(nèi)呼吸鏈的電子流減少，三磷酸腺苷生成被抑制，激活下游AMPK途徑誘導(dǎo)的自噬反應(yīng)等［21］。

綜上所述，順鉑能誘導(dǎo)SKOV3細(xì)胞發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和自噬反應(yīng)，并伴隨著細(xì)胞質(zhì)中的Ca2+濃度上升，絡(luò)合細(xì)胞質(zhì)中的Ca2+，增強(qiáng)其下游自噬反應(yīng)的強(qiáng)度，說明細(xì)胞質(zhì)中的Ca2+對(duì)自噬的發(fā)生具有抑制效應(yīng)。這一結(jié)果有助于進(jìn)一步探索Ca2+對(duì)自噬的調(diào)節(jié)機(jī)制，為腫瘤的治療及藥物開發(fā)提供新的思路。

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The effect of cytoplasmic Ca2+on cisplatin-induced autophagy in ovarian carcinoma SKOV3 cells and its mechanism

ZENG Linchuan1，DENG Huimin2，CHEN Jun2，DOU Minghan2，XU Ye2（1.School of Public Health，Jilin Medical University，Jilin 132013，Jilin Province，China；2.Medical Research Laboratory，Jilin Medical University，Jilin 132013，Jilin Province，China）

［Key words］Cisplatin；Ca2+；ER Stress；Autophagy

［Abstract］Background and purpose：Ca2+plays a very important role in the maintenance of cell biological functions. The storage，release and uptake capacity of Ca2+is controlled by endoplasmic reticulum （ER）. Ca2+homeostasis is essential for cellular energy metabolism and proper protein folding. This study aimed to investigate the effect of cytoplasmic Ca2+on cisplatin induced ER stress-mediated autophagy in ovarian carcinoma SKOV3 and its underlying mechanism. Methods：The ovarian cancer SKOV3 was used as a study object. The experiment consisted of three parts：① To explore the possible relationship between cisplatin-induced ER stress and autophagy，SKOV3 cells were treated with cisplatin for 0，6，12 and 24 h，respectively；② To explore the possible relationship between ER stress induced Ca2+efux and autophagy，SKOV3 cells were treated with cisplatin for 0，9 and 12 h，respectively，and TG was used asa positive control；③ To explore the effects of blocking calcium efux on autophagy，SKOV3 cells were divided into control group，cisplatin group，TG group，BAPTA-AM group，cisplatin combined with BAPTA-AM group and TG combined with BAPTA-AM group. Western blot was used to detect the protein levels of GRP78 and LC3. Fluo-4 calcium fluorescent probe was used to examine cytoplasmic Ca2+levels. Confocal microscopy was used to detect LC3 level by immunoflurescence staining. Results：Compared to control group （0.679±0.011），GRP78 was significantly accumulated at 6，12 and 24 h after cisplatin treatment and reached the maximum value at 6 h （1.393±0.004，P=0.000）. Similarly，compared to control group （0.038±0.000），LC3 puncta were clearly seen after cisplatin treatment and reached the maximum value at 12 h （0.072±0.002，P=0.000）. Using confocal microscopy，we found that cisplatin and TG increased LC3 punctate accumulation and cytoplasmic Ca2+levels in a time-dependent manner. Immunofluorescent method showed that treatment with cisplatin combined with BAPTA-AM or TG combined with BAPTA-AM increased LC3 punctate accumulation induced by cisplatin or TG. The results of Western blot showed that cisplatin combined with BAPTA-AM （0.071±0.001） or TG combined with BAPTA-AM （0.065±0.001） significantly increased LC3Ⅱ/LC3Ⅰ ratio induced by cisplatin （0.039±0.000，P=0.000） or TG （0.035±0.001，P=0.000）. Conclusion：Cisplatin induces intracellular ER stress and autophagy in SKOV3 cells，accompanied by increased cytoplasmic Ca2+levels. Chelating cytoplasmic Ca2+enhances cisplatin-induced autophagy.

DOI：10.3969/j.issn.1007-3969.2016.04.005

中圖分類號(hào)：R737.31

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1007-3639（2016）04-0313-07

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（81372793）；吉林省教育廳十三五科技項(xiàng)目（2016237）；2014吉林省大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)項(xiàng)目（2014001）。

通信作者：徐 冶 E-mail：xuye_9707@163.com

收稿日期：（2015-04-24修回日期：2015-06-07）