李 狀，張 瑋，王 琪，陽志軍，李 力廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院婦瘤科，廣西 南寧 530021

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沉默二氫葉酸還原酶基因?qū)β殉舶┘毎w外生物學(xué)行為的影響

李 狀，張 瑋，王 琪，陽志軍，李 力
廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院婦瘤科，廣西 南寧 530021

［摘要］背景與目的：二氫葉酸還原酶（dihydrofolate reductase，DHFR）在卵巢上皮癌鉑類耐藥細胞中高表達。該研究旨在探討DHFR基因沉默對卵巢癌細胞體外生物學(xué)行為的影響，為卵巢癌鉑類耐藥的治療奠定基礎(chǔ)。方法：設(shè)計DHFR基因靶向的發(fā)夾狀siRNA，篩選出最佳siRNA沉默片段，構(gòu)建攜帶有目的基因的慢病毒載體細胞即轉(zhuǎn)染組（DHFR-pGCSIL-SKOV3細胞）及陰性對照組細胞（pGCSIL-SKOV3細胞）。采用流式細胞儀檢測3組細胞在不同的順鉑質(zhì)量濃度（2.5、5.0、10.0和20.0 μg/mL）下不同時間段（24、48及72 h）的凋亡情況以及IC50順鉑質(zhì)量濃度（4.4 μg/mL）的周期變化；采用高效液相色譜法檢測不同順鉑質(zhì)量濃度（2.5、5.0和7.5 μg/mL）不同時間段（24和48 h）藥物作用后3組細胞內(nèi)的順鉑濃度。采用透射電鏡觀察IC50順鉑質(zhì)量濃度（4.4 μg/mL）3種細胞的超微結(jié)構(gòu)變化。結(jié)果：將退火后的雙鏈寡核苷酸片段連接到pGCSIL/GFP載體，測序結(jié)果正確。轉(zhuǎn)染SKOV3細胞后，蛋白［質(zhì)］印跡法（Western blot）鑒定干擾效果。在給藥24、48和72 h后，DHFR-pGCSIL-SKOV3、pGCSIL-SKOV3及SKOV3三組細胞的凋亡率隨著順鉑質(zhì)量濃度（2.5、5.0、10.0和20.0 μg/mL）的上升而升高，DHFR-pGCSIL-SKOV3細胞給藥48和72 h后的凋亡率明顯高于pGCSIL-SKOV3及SKOV3細胞，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。3組細胞在IC50順鉑質(zhì)量濃度（4.4 μg/mL）給藥24和48 h后，轉(zhuǎn)染組G0/G1期細胞比例較陰性及空白對照組明顯增多，G2/M、S期則反之；而給藥72 h后，3組細胞以G2/M及S期為主，轉(zhuǎn)染組低于陰性及空白對照組。采用高效液相法檢測細胞內(nèi)順鉑質(zhì)量濃度時，轉(zhuǎn)染組在2.5和5.0 μg/mL順鉑質(zhì)量濃度給藥24和48 h后，其細胞內(nèi)順鉑濃度均明顯高于對照組。轉(zhuǎn)染組在7.5 μg/mL順鉑質(zhì)量濃度給藥24 h后，其細胞內(nèi)順鉑濃度均明顯低于對照組細胞，在48 h后卻又高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.034，P=0.014）。未給藥時，轉(zhuǎn)染組細胞的微絲明顯多于對照組，線粒體亦改變明顯。IC50（4.4 μg/mL）給藥24和48 h后3組細胞均未見微絲；而給藥72 h后微絲明顯增多，且排列紊亂。結(jié)論：成功構(gòu)建攜帶DHFR基因的pGCSIL干擾慢病毒載體的卵巢癌細胞。通過對DHFR下調(diào)后耐藥性能研究得知，DHFR的下調(diào)與經(jīng)過鉑類藥物作用的體外卵巢癌細胞的藥物耐藥性有一定的聯(lián)系，卵巢癌細胞中下調(diào)DHFR基因可以考慮作為多藥耐藥的逆轉(zhuǎn)機制。

［關(guān)鍵詞］pGCSIL/GFP載體；二氫葉酸還原酶；高效液相色譜法；凋亡；透射電子顯微術(shù)

Correspondence to：LI LiE-mail：LiLi@gxmu.edu.cn

卵巢癌是女性生殖器官常見的腫瘤之一，發(fā)病率僅次于子宮頸癌和子宮體癌而列居第3位，但其卻是婦科腫瘤中死亡率最高的惡性腫瘤。由于卵巢癌發(fā)病隱匿，大部分患者確診時已為晚期（FIGO分期，Ⅲ期和Ⅳ期）［1］。目前卵巢癌的最佳治療方案是外科手術(shù)和以鉑類和紫杉醇為基礎(chǔ)的化療。但因化療耐藥，晚期患者的5年生存率僅為25%～30%。本課題組先前采用熒光標記差異顯示PCR法篩選鑒定和驗證鉑類耐藥和非耐藥卵巢上皮癌細胞間差異表達基因時也發(fā)現(xiàn)，鉑類耐藥和非耐藥卵巢上皮癌細胞間二氫葉酸還原酶（dihydrofolate reductase，DHFR）存在差異表達，且鉑類敏感卵巢上皮癌細胞在體外被誘導(dǎo)成耐藥細胞后其DHFR表達明顯上調(diào)［2］。DHFR是一種利用還原型輔酶Ⅱ還原二氫葉酸產(chǎn)生四氫葉酸的氧化還原酶。其相對分子質(zhì)量約為20 000，是催化葉酸還原成四氫葉酸的酶。四氫葉酸形成過程分2步進行，由同一個酶催化，四氫葉酸作為一碳單位載體，為嘌呤核苷酸從頭合成和胸嘧啶核苷酸合成等提供一碳單位。葉酸缺乏可能導(dǎo)致DNA損傷、不穩(wěn)定和DNA甲基化畸形狀態(tài)，這在腫瘤發(fā)生過程中起重要作用。葉酸的代謝障礙也可能與卵巢癌的發(fā)生有關(guān)［3］。葉酸主要包括葉酸受體、DHFR和四氫葉酸還原酶。葉酸受體是一種糖基磷脂酰肌醇錨定膜蛋白，可介導(dǎo)細胞外葉酸進入細胞內(nèi)［4］，是目前抗腫瘤治療研究的重要靶點［5］，而DHFR是葉酸受體的下游。高海德等［6］觀察到雙突變DHFR基因（酶活性增高）對大劑量甲氨蝶呤化療小鼠骨髓細胞具有保護作用。此外，有文獻報道DHFR基因在白血病耐藥細胞株、人骨肉瘤耐藥細胞株及耐藥乳腺癌細胞株等腫瘤耐藥細胞株中高表達，并且在腫瘤多藥耐藥中發(fā)揮著一定的作用［7-9］。

本課題組在前期卵巢組織的熒光定量PCR的實驗中，了解到DHFR基因可能在卵巢癌鉑類耐藥過程中起著重要的作用［2］。為進一步探討其對卵巢癌細胞耐藥性的影響，我們考慮選用穩(wěn)定表達的載體來進行細胞功能性實驗，而慢病毒載體目前是有效、可靠的轉(zhuǎn)基因方法，且應(yīng)用廣泛，故選用pGCSIL/GFP慢病毒載體作為DHFR干擾載體，為今后進一步的基因功能研究和動物實驗打下良好的基礎(chǔ)。為進一步探討DHFR與卵巢癌多藥耐藥之間的關(guān)系，我們構(gòu)建了高拷貝DHFR-pGCSIL重組慢病毒干擾載體，并通過流式儀器檢測不同時間段不同藥物濃度的凋亡周期，采用透射電鏡觀察細胞超微結(jié)構(gòu)，采用高效液相檢測細胞內(nèi)外鉑類藥物濃度的變化；同時也為后續(xù)研究卵巢癌細胞的多藥耐藥機制實驗做了良好的鋪墊。

1　材料和方法

1.1材料來源

細胞及質(zhì)粒來源：SKOV3細胞為本實驗室保存。pGCSIL慢病毒系統(tǒng)、包膜質(zhì)粒pHelper1.0和包裝質(zhì)粒pHelper2.0均購自上海吉凱有限公司。

主要試劑：改良型1640培養(yǎng)液和胎牛血清均購自美國Gibco公司，LipofectamineTM2000購自美國Invitrogen公司，一抗（兔抗羊HPSE蛋白多克隆抗體）和二抗（辣根酶標記兔抗羊IgG）均購自美國Santa Cruz公司，GAPDH（甘油醛-3-磷酸脫氫酶）內(nèi)參多抗購自上?？党缮锕荆蛲鲈噭┖蠦D PharmingenTMPE Annexin V Apoptosis Detection Kit Ⅰ及周期試劑盒BD CycletestTMPlus DNA Reagent Kit均購自美國BD公司，AgeI、EcoRI、T4 DNA ligase及buffer均購自美國NEB公司。

1.2方法

1.2.1重組質(zhì)粒的構(gòu)建

設(shè)計DHFR基因靶向的發(fā)夾狀siRNA，篩選出最佳siRNA沉默片段，合成單鏈DNA寡核苷酸，引物退火形成雙鏈DNA寡核苷酸即shRNA，將退火后的shRNA模板與酶切回收后的線性慢病毒載體pGCSIL相連接，經(jīng)過DH-5a菌體的轉(zhuǎn)化，提取陽性克隆進行測序。將測序結(jié)果進行BLAST比對，同源性為100%。重組質(zhì)粒命名為DHFR-pGCSIL。

1.2.2質(zhì)粒DNA細胞轉(zhuǎn)染

DHFR-pGCSIL（pGCSIL）、pHelper1.0及pHelper2.0三種質(zhì)粒質(zhì)量比為4∶3∶2，將SKOV3細胞以每孔3×105接種于6孔培養(yǎng)板。第2天，細胞貼壁生長匯合至70%～80%時進行轉(zhuǎn)染，具體操作按脂質(zhì)體LipofectamineTM2000說明書進行。實驗分為3組：實驗組（攜帶有重組質(zhì)粒DHFR-pGCSIL基因的SKOV3細胞組）、陰性對照組（攜帶有空載pGCSIL病毒的SKOV3細胞組）及空白對照組（親本SKOV3細胞組）。采用流式細胞儀分選帶有DHFR-pGCSIL基因的SKOV3細胞。

1.2.3蛋白［質(zhì)］印跡法（Western blot）檢測3組細胞中DHFR蛋白表達

用放射免疫沉淀試驗裂解液裂解細胞，13 987.5×g離心5 min后取上清液抽提細胞總蛋白。用10%的十二烷基硫酸鈉-聚苯烯酰胺凝膠電泳分離蛋白質(zhì)，隨后電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維膜，5%脫脂奶粉洗滌緩沖液封閉，抗體溫育過夜，洗膜，然后用HRP標記的二抗常規(guī)溫育1 h，搖床脫色10 min，進行化學(xué)發(fā)光反應(yīng)。將膠片進行掃描或拍照，以β肌動蛋白（β-actin）為內(nèi)參照，用凝膠圖像處理系統(tǒng)分析目標帶的相對表達水平。

1.2.4四甲基偶氮唑鹽（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）比色法檢測3組細胞生長曲線

將3組細胞培養(yǎng)至匯合度達80%左右，0.25%胰酶消化后，制成單個細胞懸液，按每孔8×103個細胞數(shù)接種于96孔板，每孔總體積為200 μL；在CO2體積分數(shù)為5%、37 ℃的環(huán)境中培養(yǎng)24 h；24 h后3組細胞以1.25、2.5、5.0、10.0、20.0和40.0 μg/mL質(zhì)量濃度梯度加順鉑化療藥物，分別培養(yǎng)24、48和72 h。每孔加入MTT溶液20 μL，37 ℃溫育4 h，吸棄上清液，每孔加入二甲基亞砜150 μL，吹打混勻使甲臜充分溶解，將所有溶液移至另一孔板；選擇492 nm波長的酶聯(lián)免疫檢測儀測定各孔的吸光度（D）值，記錄結(jié)果，繪制生長曲線。

1.2.5流式細胞儀檢測不同藥物濃度、不同時間段的凋亡變化

將3組細胞培養(yǎng)至匯合度達80%～90%左右，0.25%胰酶消化后，制成單個細胞懸液，按每孔5×105個細胞數(shù)接種于6孔板，每孔總體積為2 mL，24 h細胞貼壁后每種細胞按2.5、5.0、10.0和20.0 μg/mL質(zhì)量濃度梯度加順鉑化療藥物，分別培養(yǎng)24、48和72 h后，按照凋亡試劑盒說明書進行操作，流式細胞儀進行檢測。

1.2.6流式細胞儀檢測IC50順鉑濃度作用不同時間段的周期變化

將3組細胞培養(yǎng)至匯合度達80%～90%左右，0.25%胰酶消化后，制成單個細胞懸液，按每孔1×106個細胞數(shù)接種于6孔板，每孔總體積為2 mL；24 h細胞貼壁后每種細胞按IC50質(zhì)量濃度（4.4 μg/mL）加順鉑化療藥物，分別培養(yǎng)24、48和72 h。按照周期試劑盒說明書進行細胞處理，最后將樣品放入流式儀器檢測，每種細胞檢測1×104個細胞，Multicycle軟件分析細胞周期比例。

1.2.7高效液相檢測順鉑作用不同濃度、不同時間段的細胞內(nèi)外的鉑類藥物濃度變化

將預(yù)先培養(yǎng)的生長良好的3組細胞懸液（含細胞1×107個）加入25 cm2的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)24 h，加入2.5、5.0和7.5 μg/mL的順鉑質(zhì)量濃度培養(yǎng)不同的時間（如0、24和48 h等），每個濃度及每個時間點培養(yǎng)3瓶。實驗操作方法與李維鳳等［10］的處理方法一致。按相應(yīng)色譜條件測定峰面積，以峰面積對含量作線性回歸，DDP質(zhì)量濃度在0.1～1.0 μg/mL范圍內(nèi)r=0.99，回歸方程Y=1.24×10-5X-6.41×10-3。

1.2.8電鏡觀察IC50濃度順鉑作用不同時間段的超微結(jié)構(gòu)變化

將3組細胞培養(yǎng)至75 cm2的培養(yǎng)瓶，待細胞匯合度達90%～100%左右時分別將每種細胞加入篩選后的IC50順鉑質(zhì)量濃度（4.4 μg/mL）藥物刺激24、48和72 h后，0.25%胰酶消化細胞，將離心管內(nèi)的細胞懸液離心（167.7×g，10 min）成團；3%戊二醛固定液固定過夜；1%鋨酸固定液再固定1 h；丙酮∶醋酸異戊酯（1∶1）脫水10 min以及酒精逐層梯度脫水；環(huán)氧樹脂618包埋制備成半超薄切片1 μm；在透射電鏡下觀察細胞超微結(jié)構(gòu)，并拍照攝片，分析各組細胞超微結(jié)構(gòu)的變化情況。

1.3統(tǒng)計學(xué)處理

2　結(jié)果

2.1重組質(zhì)粒的構(gòu)建

用pGCSIL/GFP載體的通用引物，以提取的質(zhì)粒為模板進行PCR反應(yīng)，擴增出目的基因全長823 bp。經(jīng)BLAST比對，同源性達100%。序列為CCGGAAGTCTAGATGATGCCTTAAACT CGAGTTTAAGGCATCATCTAGACTTTTT TTG（圖1）。

2.2流式細胞儀分選轉(zhuǎn)然后的目的細胞及Western blot檢測3組細胞中DHFR的含量

將攜帶有DHFR基因的病毒顆粒感染SKOV3細胞，大量培養(yǎng)后采用流式細胞儀進行熒光細胞的分選，分選率為65.8%。將成功分選的攜帶有DHFR基因的SKOV3細胞大量培養(yǎng)后進行驗證并進行灰度值的檢測。SKOV3灰度值/DHFR-pGCSIL-SKOV3灰度值=0.25/0.11=2.4倍，表明細胞轉(zhuǎn)染成功（圖2、3，表1）。

圖1　DHFR-pGCSIL重組質(zhì)粒載體的構(gòu)建及測序圖Fig. 1　　The construction of DHFR-pGCSIL recombinant plasmid vector and sequence diagram

圖2　流式細胞儀分選SKOV3目的細胞Fig. 2　　Sorting of SKOV3 cells by fow cytometry

圖3　Western blot檢測3組不同SKOV3細胞DHFR表達量Fig. 3　　Detection of DHFR expression in　SKOV3 cells of three diferent groups by Western blot

表1　Western blot檢測3組不同的SKOV3細胞中DHFR的灰度值Tab. 1　　Detection of DHFR grey value in SKOV3 cells of three diferent groups by Western blot

2.3MTT比色法檢測DHFR-pGC-SIL-SKOV3、pGCSIL-SKOV3及SKOV3三組細胞的生長曲線

MTT比色法檢測，根據(jù)各個時間點所測得的D492 nm繪制出生長曲線，并計算出3組細胞的IC50順鉑質(zhì)量濃度分別為4.4、5.5和4.9 μg/mL。

2.4流式細胞儀檢測不同藥物質(zhì)量濃度、不同時間段的凋亡變化

在給藥24、48和72 h后，DHFR-pGCSILSKOV3、pGCSIL-SKOV3及SKOV3細胞的凋亡率隨著順鉑質(zhì)量濃度（2.5、5.0、10.0和20.0 μg/mL）的增加而升高。pGCSIL-SKOV3 及SKOV3細胞的凋亡率差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.977）。在給藥24 h后，不超過5.0 μg/mL時，3種細胞的凋亡率基本相同，差異無統(tǒng)計學(xué)意義；＞5.0 μg/mL時，DHFR-pGCSILSKOV3細胞的凋亡率明顯高于其他2組細胞（P=0.035，P=0.028）。pGCSIL-SKOV3及SKOV3細胞的凋亡率差異無統(tǒng)計學(xué)意義。在給藥48 h后，3種細胞在順鉑質(zhì)量濃度小于5.0 μg/mL時，DHFR-pGCSIL-SKOV3細胞的凋亡率明顯低于其他2組細胞（P=0.003）；在不小于5.0 μg/mL的順鉑質(zhì)量濃度中，DHFR-pGCSILSKOV3細胞的凋亡率明顯高于pGCSIL-SKOV3 及SKOV3細胞（P=0.036，P=0.009，P=0.047）。在給藥72 h后，DHFR-pGCSIL-SKOV3細胞各個藥物濃度的凋亡率明顯高于其他2組細胞（P=0.023，P=0.034，P=0.012，P=0.000）；pGCSIL-SKOV3及SKOV3細胞之間的凋亡率差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05，表2）。

2.5流式細胞儀檢測IC50順鉑質(zhì)量濃度（4.4 μg/ mL）不同時間段的周期變化

3組細胞在IC50順鉑質(zhì)量濃度（4.4 μg/mL）給藥后24、48 h時，轉(zhuǎn)染組G0/G1期細胞比例較陰性及空白對照組明顯增多（P=0.044），G2/M、S期則相反（P=0.008，P=0.005）；而給藥后72 h時，3組細胞以G2/M及S期為主，轉(zhuǎn)染組低于陰性及空白對照組（P=0.037，P=0.019，表3）。

2.6高效液相檢測不同藥物質(zhì)量濃度、不同時間段的細胞內(nèi)外的鉑類藥物濃度變化

未給藥時，DHFR-pGCSIL-SKOV3、pGCSIL-SKOV3及SKOV3細胞內(nèi)順鉑含量相同；3組不同順鉑質(zhì)量濃度（2.5、5.0和7.5 μg/mL）時，轉(zhuǎn)染組在藥物作用24 h時，在2.5、5.0 μg/mL順鉑濃度給藥后其細胞內(nèi)順鉑濃度均明顯高于對照組（P=0.006，P=0.034）；在7.5 μg/mL順鉑濃度給藥后其細胞內(nèi)順鉑濃度卻明顯低于對照組（P=0.034）；而在藥物作用48 h時，其細胞內(nèi)順鉑濃度均明顯高于對照組（P=0.043，P=0.032，P=0.014）。轉(zhuǎn)染組隨著藥物濃度的增加其細胞內(nèi)順鉑藥物濃度減少，對照組則與藥物刺激濃度并不呈依賴性關(guān)系（圖4，表4）。

表2　不同順鉑質(zhì)量濃度作用不同時間后3組細胞的凋亡率比較Tab. 2　　Comparison of apoptosis rates in 3 groups after diferent cisplatin concentrations at diferent time（%，±s）

表2　不同順鉑質(zhì)量濃度作用不同時間后3組細胞的凋亡率比較Tab. 2　　Comparison of apoptosis rates in 3 groups after diferent cisplatin concentrations at diferent time（%，±s）

Group　DHFR-pGCSIL-SKOV3　SKOV3　pGCSIL-SKOV3　P24hvalue　P48hvalue　P72hvalue 24 h　48 h　72 h　24 h　48 h　72 h　24 h　48 h　72 h 2.5 μg/mL　5.32±0.24 15.30±1.32 46.11±0.68 5.06±0.22 20.20±1.46 29.00±1.23 7.16±0.49 23.27±1.3522.25±1.16 1.023 0.003 0.023 5.0 μg/mL　9.90±0.49 40.02±0.79 60.84±1.48 10.63±0.49 37.12±2.08 46.03±2.01 11.01±0.87 35.26±1.3844.16±1.87 0.098 0.036 0.034 10.0 μg/mL 22.83±0.44 57.09±0.89 80.26±1.32 12.83±0.85 47.16±1.45 66.40±1.68 12.07±1.22 49.55±2.0262.85±1.89 0.035 0.009 0.012 20.0 μg/mL 41.42±1.05 69.35±1.35 90.42±1.47 27.46±1.01 64.12±2.63 83.12±2.07 26.52±1.13 64.89±2.8182.97±2.28 0.028 0.047 0.000

表3　IC50順鉑質(zhì)量濃度（4.4 μg/mL）作用不同時間后3組細胞的周期比較Tab. 3　　Comparison of cell cycles in 3 groups induced by IC50cisplatin concentration （4.4 μg/mL） at diferent time（%，±s）

表3　IC50順鉑質(zhì)量濃度（4.4 μg/mL）作用不同時間后3組細胞的周期比較Tab. 3　　Comparison of cell cycles in 3 groups induced by IC50cisplatin concentration （4.4 μg/mL） at diferent time（%，±s）

Group　G0/G1S G2/M 24 h　48 h　72 h　24 h　48 h　72 h　24 h　48 h　72 h DHFR-pGCSIL-SKOV3　62.60±0.44 55.48±1.43 2.34±0.24 30.49±0.89 44.30±1.12 60.94±0.78　4.91±0.88 0.22±0.11 36.72±1.03 SKOV3　57.03±0.99 37.29±1.01 0.96±0.21 31.11±1.31 62.67±0.59 36.14±0.81 11.86±0.64 0.04±0.31 62.90±1.24 pGCSIL-SKOV3　56.59±0.89 38.97±0.93 0.24±0.18 29.70±0.92 55.77±1.21 26.81±0.93 13.71±0.68 5.25±0.78 72.95±1.19 P value　0.044　0.022　0.004　0.057　0.005　0.019　0.008　0.001　0.037

圖4　高效液相色譜法標準曲線色譜圖的建立Fig. 4　　The establishment of chromatogram standard curve by high performance liquid chromatography

表4　不同順鉑質(zhì)量濃度作用不同時間3組細胞的細胞內(nèi)順鉑濃度比較Tab. 4　　Comparison of cisplatin concentrations in vivo in 3 groups at diferent cisplatin concentrations and at diferent time［ρB/（μg·mL-1），±s］

表4　不同順鉑質(zhì)量濃度作用不同時間3組細胞的細胞內(nèi)順鉑濃度比較Tab. 4　　Comparison of cisplatin concentrations in vivo in 3 groups at diferent cisplatin concentrations and at diferent time［ρB/（μg·mL-1），±s］

Item 2.5 μg/mL　5.0 μg/mL　7.5 μg/mL 0 h　24 h　48 h　24 h　48 h　24 h　48 h DHFR-pGCSIL-SKOV3　0.331±0.013 2.458±0.012 1.770±0.023　1.992±0.031　1.843±0.025　0.693±0.031　1.741±0.022 SKOV3　0.923±0.022 1.721±0.021 1.196±0.023　1.031±0.032　1.149±0.028　1.104±0.019　1.265±0.025 pGCSIL-SKOV3　0.902±0.019 1.168±0.025 1.135±0.021　1.560±0.033　1.228±0.025　1.170±0.027　0.437±0.035 P value　1.453　0.006　0.043　0.034　0.032　0.034　0.014

2.7采用透射電鏡檢測不同時間段的IC50順鉑質(zhì)量濃度的3組細胞超微結(jié)構(gòu)變化

IC50（4.4 μg/mL）給藥24和48 h后，3組細胞的微絲均少見，DHFR-pGCSIL-SKOV3細胞在24 h后可見線粒體腫脹、脊消失、空泡化、萎縮，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴張明顯，有聚集的核糖體，未見高爾基體，48 h時其有些線粒體溶解消失，且出現(xiàn)大量的白色囊泡；而pGCSIL-SKOV3及SKOV3細胞在24和48 h后內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴張少見，線粒體結(jié)構(gòu)改變不明顯，甚至有2～3個高爾基體存在。DHFR-pGCSIL-SKOV3細胞在72 h后，微絲明顯聚集、增多，線粒體結(jié)構(gòu)亦消失；而pGCSIL-SKOV3及SKOV3細胞微絲排列紊亂，線粒體形態(tài)多樣化（圖5，表5）。

圖5　采用透射電鏡檢測不同時間段的IC50順鉑質(zhì)量濃度（4.4 μg/mL）的細胞超微結(jié)構(gòu)變化Fig. 5　　A transmission electron microscope was used to observe cell ultrastructure changes in three groups at IC50cisplatin concentration （4.4 μg/mL） in diferent periods

表5　采用透射電鏡檢測不同時間段的IC50順鉑質(zhì)量濃度（4.4 μg/mL）3組細胞的超微結(jié)構(gòu)變化Tab. 5　　Cell ultrastructure changes in 3 groups at IC50cisplatin concentration （4.4 μg/mL） in diferent periods detected by transmission electron microscope

3　討論

近年來，多藥耐藥成為化療失敗的主要原因之一。如何逆轉(zhuǎn)多藥耐藥已經(jīng)成為當今腫瘤治療的研究熱點。臨床研究證實，順鉑與紫杉醇的聯(lián)合化療是治療卵巢癌的一線化療藥物。卵巢癌的治療主要以腫瘤細胞減滅術(shù)及輔以化療為主，基因治療已逐步興起。采用RNAi干擾相關(guān)的多藥耐藥基因已經(jīng)成為多數(shù)學(xué)者的研究對象。直接轉(zhuǎn)染合成的siRNA雖然能特異性抑制哺乳動物細胞內(nèi)同源基因的表達，但細胞內(nèi)siRNA很容易被降解。因此，這種方法不能實現(xiàn)穩(wěn)定的RNA干擾。相比之下，質(zhì)粒載體或病毒載體就能在細胞內(nèi)長時間、穩(wěn)定地生成siRNA。但質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)染哺乳動物細胞的效率不如病毒載體，尤其無法轉(zhuǎn)染非分裂相細胞。所以，本實驗選擇了一種更有效的干擾方法即慢病毒RNA干擾的表達載體。在此基礎(chǔ)上進行一系列相關(guān)的耐藥性功能實驗。

DHFR是葉酸代謝過程中的關(guān)鍵酶，同時也是抗腫瘤、抗菌及抗炎的靶點藥物。目前已經(jīng)有大量研究關(guān)于DHFR基因在瘧疾、乳腺癌及巨幼細胞性貧血癥等疾病治療中的相關(guān)作用。通過本課題組的前期研究發(fā)現(xiàn)卵巢癌順鉑耐藥性增強時，其DHFR基因表達量增加。此結(jié)果與乳腺癌多藥耐藥的研究、骨肉瘤多藥耐藥的研究及急性淋巴細胞白血病的耐藥性研究均一致。Malisa等［11］研究發(fā)現(xiàn)，DHFR基因的三重突變及DHPS的雙重突變對磺胺嘧啶及乙嘧啶治療瘧疾的效果有著重要意義，DHFR突變可能是引起磺胺嘧啶及乙嘧啶耐藥的主要原因之一。Cario等［12］研究發(fā)現(xiàn)，由DHFR純合子突變引起的DHFR缺乏導(dǎo)致巨幼細胞貧血癥及腦部葉酸缺乏導(dǎo)致嚴重的神經(jīng)疾病，DHFR對于維持腦脊液及紅細胞中葉酸水平是有必要的，即使血漿中已經(jīng)有足夠的葉酸以及葉酸供應(yīng)。Zhu等［13］研究發(fā)現(xiàn)，DHFR表達增加的主要機制在于轉(zhuǎn)錄活化子激活所導(dǎo)致的。Banka等［14］研究分析表明，葉酸可以糾正由DHFR缺乏癥導(dǎo)致的腦葉酸水平、貧血和血細胞改變的癥狀，同時為DHFR和腦四氫生物蝶呤的新陳代謝之間的聯(lián)系提供了證據(jù)，進一步提示了葉酸在神經(jīng)病學(xué)上的角色，包括抑郁癥、阿本海姆癥及帕金森病。Sun等［15］研究發(fā)現(xiàn)，敲除DHFR基因后對斑馬魚在心臟發(fā)展形成過程中其重要因子有消極影響，而過表達的DHFR對其則有積極作用，其主要是通過調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄水平影響細胞增殖和凋亡。Klinghoffer等［16］研究通過慢病毒載體轉(zhuǎn)染小干擾片段DHFR基因來調(diào)節(jié)β-連環(huán)素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑受體抑制劑GSK3，其機制可能為DHFR抑制劑引起的甲基化突變的協(xié)同作用，從而使DHFR及GSK3雙重抑制劑來治療慢性炎性反應(yīng)。

在給藥24、48和72 h后，DHFR-pGCSILSKOV3、pGCSIL-SKOV3和SKOV3細胞的凋亡率隨著順鉑質(zhì)量濃度（2.5、5.0、10.0和20.0 μg/ mL）的增加而升高，且DHFR-pGCSIL-SKOV3細胞給藥48及72 h后的凋亡率明顯高于pGCSILSKOV3及SKOV3細胞。凋亡是一個細胞的主動死亡過程，其有利于機體環(huán)境的穩(wěn)定，而腫瘤細胞卻可通過抑制凋亡來實現(xiàn)自我保護，以利于生存。細胞凋亡能力能夠直接影響化療藥物的效應(yīng)。因此，本實驗的凋亡結(jié)果表明，DHFR基因下調(diào)后，細胞的凋亡率增加，藥物的敏感性增加。DHFR可以通過誘導(dǎo)凋亡來抑制SKOV3細胞增殖，并能部分逆轉(zhuǎn)細胞的多藥耐藥性。由于凋亡調(diào)控的復(fù)雜性，誘導(dǎo)其凋亡的機制可能與上調(diào)凋亡相關(guān)蛋白，上調(diào)Fas/Fasl、c-myc基因，下調(diào)survivin基因表達，以及線粒體膜電位下降等有關(guān)。3組細胞在IC50順鉑濃度（4.4 μg/mL）給藥后24 h時，轉(zhuǎn)染組G0/G1期細胞比例較陰性及空白對照組明顯增多，表明細胞增殖減慢，說明沉默DHFR基因后，卵巢癌SKOV3細胞增殖明顯受到抑制。給藥后48 h，G2/M、S期細胞比例增加，細胞增殖加快，而給藥72 h時，3組細胞以G2/M及S期為主，轉(zhuǎn)染組低于陰性及空白對照組，表明卵巢癌SKOV3細胞在沉默DHFR基因后，對順鉑的敏感性增加。這表明敲除DHFR基因加強了順鉑對細胞周期的阻滯作用，尤其是G2/M期，細胞周期的正常運行被擾亂，其連續(xù)性中斷，藥物使細胞周期的運行停滯在S和G2/M期，使通過G2/M監(jiān)測點進入下一個細胞周期的細胞減少，從而抑制了細胞的增殖。采用高效液相檢測細胞內(nèi)順鉑濃度時，當2.5和5.0 μg/mL順鉑質(zhì)量濃度作用3種不同處理的卵巢癌細胞時，DHFR-pGCSIL-SKOV3細胞在給藥24和48 h后，其細胞內(nèi)順鉑濃度均明顯高于pGCSIL-SKOV3及SKOV3細胞，表明敲除DHFR基因的細胞能夠使順鉑更容易進入體內(nèi)，明顯提高了靶細胞內(nèi)的藥物濃度，并且藥物進入的時間較快也較早，能迅速達到高峰濃度。而DHFR-pGCSIL-SKOV3細胞在7.5 μg/mL順鉑濃度給藥24 h后，其細胞內(nèi)順鉑濃度均明顯低于pGCSIL-SKOV3及SKOV3細胞，而在48 h后卻又高于pGCSIL-SKOV3及SKOV3細胞。這表明當藥物濃度較大時，敲除DHFR基因使SKOV3細胞泵出順鉑減少，增強了對細胞的殺傷作用。而高濃度順鉑給藥48 h時，由于藥物濃度較大且作用時間較長，細胞內(nèi)藥物代謝能力增加，導(dǎo)致細胞內(nèi)藥物濃度降低。在順鉑刺激過程中，細胞中的線粒體及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)改變亦比較明顯，可能順鉑是通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)-線粒體機制殺傷細胞以治療腫瘤，李培等［17］研究三氧化二砷主要通過線粒體途徑誘導(dǎo)藥物敏感的白血病K562細胞凋亡，而通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)一線粒體聯(lián)合途徑誘導(dǎo)耐藥性白血病K562/ADM細胞凋亡。這與馬艷云等［18］的研究結(jié)果相一致。李云春等［19］研究發(fā)現(xiàn)，順鉑通過恢復(fù)p53的功能，誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡，起到抑制腫瘤生長的作用。同時，柳友清等［20］研究順鉑誘導(dǎo)凋亡的機制結(jié)果與馬艷云等［18］的研究一致。根據(jù)上述文獻研究，本實驗的凋亡機制可能亦與p53途徑有關(guān)，但由于本實驗并沒有檢測內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體及p53信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的相關(guān)蛋白和基因的表達，因此，DHFR基因干擾后在順鉑誘導(dǎo)后其對藥物敏感性增加的具體機制尚不清楚。

通過對DHFR下調(diào)后耐藥性功能研究得知，DHFR的下調(diào)與經(jīng)過鉑類藥物作用的體外卵巢癌細胞的藥物敏感性有一定的聯(lián)系，一般DHFR下調(diào)后，其藥物敏感性增加，在一定濃度范圍內(nèi)，順鉑的作用隨藥物濃度的增加而提高，達到一定濃度后，這種遞增效應(yīng)減弱或消失，說明順鉑作用濃度有飽和效應(yīng)。其G2/M期阻滯作用隨用藥時間的延長而增強，以用藥72 h最顯著。在順鉑有效濃度范圍內(nèi)，適當延長藥物的作用時間可能會減少耐藥性的產(chǎn)生或可成為逆轉(zhuǎn)耐藥的方法之一。卵巢癌細胞中下調(diào)DHFR基因可以考慮作為多藥耐藥的逆轉(zhuǎn)機制，細胞的凋亡周期均參與到多藥耐藥機制的研究中，其具體機制如何，需深入進一步研究。

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Efect of down-regulation of dihydrofolate reductase on biological function of ovarian cancer cells in vitro

LI Zhuang，ZHANG Wei，WANG Qi ，YANG Zhijun，LI Li （Department of Gynecology Oncology，Tumor Hospital of Guangxi Medical University，Nanning 530021，Guangxi Province，China）

［Key words］pGCSIL/GFP vector；Dihydrofolate reductase；High performance liquid chromatography；Apoptosis；Transmission electron microscopy

［Abstract］Background and purpose：Dihydrofolate reductase （DHFR） is expressed highly in platinum-resistant ovarian cancer. This study aimed to explore the relationship between the silence of DHFR gene and platinum drug resistance in ovarian cancer，and lay the foundation for the treatment of platinum-resistant ovarian cancer. Methods：To design targeting hairpin siRNA of DHFR gene，the optimal siRNA silent sequence was selected，and lentiviral vector carrying DHFR gene was constructed successfully，named DHFR-pGCSIL-SKOV3 cell. Flow cytometry was used to detect the cell apoptosis of DHFR-pGCSIL-SKOV3 cells，pGCSIL-SKOV3 cells and SKOV3 cells incubated in various concentrations of cisplatin （2.5，5.0，10.0 and 20.0 μg/mL） at different time points （24，48 and 72 h），and cell cyclechanges of these cells at IC50cisplatin concentration （4.4 μg/mL）. High performance liquid chromatography was used to test intracellular concentration of cisplatin at different induction concentration of cisplatin （2.5，5.0 and 7.5 μg/mL） and various time points （24 and 48 h）. Ultrastructural changes of these cells at concentration of cisplatin IC50（4.4 μg/mL）were observed by transmission electron microscope. Results：After annealing double-strand nucleotide was connected to pGCSIL/GFP vector，sequencing result was correct. SKOV3 cell were transfected with virus particles followed by Western blot detection of interference effect. Flow cytometry was used to detect apoptosis in three groups of cells，and increased apoptosis rate was found at the raised cisplatin concentration （2.5，5.0，10.0 and 20.0 μg/mL） at 24，48 and 72 h in DHFR-pGCSIL-SKOV3，pGCSIL-SKOV3 and SKOV3 cells. The apoptosis rate in DHFR-pGCSIL-SKOV3 was significantly higher than that in pGCSIL-SKOV3 and SKOV3 cells at 24 and 48 h （P＜0.05）. Flow cytometry was adopted to test cells cycle of 3 groups at different time period under IC50cisplatin concentration （4.4 μg/mL），the results indicated that G0/G1phase cell rate of DHFR-pGCSIL-SKOV3 was much more than the others，of which G2/M and S phase cell rates were on the contrary. While at 72 h，3 groups were mainly G2/M and S phase cell rates，DHFR-pGCSIL-SKOV3 was lower than the others. High performance liquid chromatography method was used to detect intracellular cisplatin concentration at 24 and 48 h after the cells were incubated at various concentrations of cisplatin （2.5 and 5.0 μg/mL）. The results showed the intracellular cisplatin content of DHFR-pGCSIL-SKOV3 cell was significantly higher than that of pGCSIL-SKOV3 and SKOV3 cells. However，after incubation at cisplatin concentration of 7.5 μg/mL，the intracellular cisplatin content of DHFR-pGCSIL-SKOV3 cell was significantly lower than that of pGCSIL-SKOV3 and SKOV3 cells at 24 h，while higher than pGCSIL-SKOV3 and SKOV3 cells at 48 h （P=0.034，P=0.014）. We observed ultrastructural changes of three different cell lines induced by IC50cisplatin concentration（4.4 μg/mL） at different time points by the electron microscope. We found that the microfilaments were increased and gathered together and mitochondrial structure was also changed obviously without the drug. However，there was rare microfilament in three groups of cells at 24 and 48 h，while at 72 h，obviously increased inordinate microfilaments were observed. Conclusion：We successfully constructed pGCSIL lentivirus interference carrier carrying DHFR gene. The research indicates that down-regulation of DHFR gene is related to cisplatin drug resistance in ovarian cancer. The results laid the foundation for us to investigate the molecular mechanisms of multidrug-resistance in tumor.

DOI：10.3969/j.issn.1007-3969.2016.04.004

中圖分類號：R737.31

文獻標志碼：A

文章編號：1007-3639（2016）04-0303-10

基金項目：國家自然科學(xué)基金資助項目（30960404 ）；廣西科學(xué)研究與技術(shù)開發(fā)計劃課題（桂科攻14124004）；廣西自然科學(xué)基金（2014jjAA40673）。

通信作者：李 力 E-mail：LiLi@gxmu.edu.cn

收稿日期：（2015-07-09修回日期：2015-09-04）