林志鑫,傅君舟△,梁　鳴,崔如健,周道祥,張亞杰

(1.廣州市第一人民醫(yī)院腎內(nèi)科　510000;2.廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院內(nèi)科　510120;3.廣州市越秀區(qū)中醫(yī)醫(yī)院檢驗(yàn)科　510030;4.廣州醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院腎內(nèi)科　510260)

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論著·基礎(chǔ)研究

辛伐他汀對(duì)高糖培養(yǎng)腎小球系膜細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期的影響及機(jī)制*

林志鑫1,傅君舟1△,梁鳴1,崔如健2,周道祥3,張亞杰4

(1.廣州市第一人民醫(yī)院腎內(nèi)科510000;2.廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院內(nèi)科510120;3.廣州市越秀區(qū)中醫(yī)醫(yī)院檢驗(yàn)科510030;4.廣州醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院腎內(nèi)科510260)

[摘要]目的研究辛伐他汀(SIM)對(duì)高糖培養(yǎng)腎小球系膜細(xì)胞(GMC)增殖和細(xì)胞周期的影響，并觀察其炎癥因子和細(xì)胞外基質(zhì)的變化。方法將大鼠GMCs分為4組：低糖組[LG組，葡萄糖(Glu)5.6 mmol/L]，高糖組(HG組， Glu 30 mmol/L)， HG+SIM(10 μg/L)組和HG+SIM(25 μg/L)組。采用4-甲基偶氮四唑藍(lán)(MTT)法檢測(cè)各組細(xì)胞的增殖能力，同時(shí)比較各組細(xì)胞的G0/G1，G2+M期和S期細(xì)胞比例。比較各組細(xì)胞上清液中的轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(TGF-β1)、纖維黏連蛋白(FN)和Ⅳ型膠原(COL4)水平。結(jié)果HG組不同時(shí)刻的吸光度(A)高于HG+SIM(10 μg/L)組、HG+SIM(25 μg/L)和LG組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。LG組的G0/G1期細(xì)胞比例為(35.67±3.38)%，S期細(xì)胞比例為(41.24±5.64)%；HG組的G0/G1期細(xì)胞比例為(25.88±4.02)%，S期細(xì)胞比例為(28.65±1.88)%；HG+SIM(10 μg/L)組的G0/G1期細(xì)胞比例為(28.12±2.01)%，S期細(xì)胞比例為(35.55±2.09)%；HG+SIM(25 μg/L)組的G0/G1期細(xì)胞比例為(31.85±3.52)%，S期細(xì)胞比例為(39.82±2.23)%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。HG組上清液TGF-β1、FN和COL4水平高于HG+SIM(10 μg/L)組、HG+SIM(25 μg/L)和LG組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論SIM可以通過降低TGF-β1水平來抑制GMCs的增殖并調(diào)整細(xì)胞周期，抑制GMCs肥大。

[關(guān)鍵詞]辛伐他??；腎小球系膜細(xì)胞；細(xì)胞增殖；細(xì)胞周期；轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β

糖尿病腎病是糖尿病發(fā)展的長(zhǎng)期并發(fā)癥，患者晚期基底膜增厚、系膜基質(zhì)增加，腎小球?yàn)V過率下降，部分腎小球功能荒廢，患者腎功能下降，出現(xiàn)氮質(zhì)血癥，水腫及高血壓等癥狀[1]。高血糖可以刺激腎小球系膜細(xì)胞增生和肥大，最終引起腎小球?yàn)V過率下降及腎功能減退[2]。目前，他汀類藥物在糖尿病腎病治療中的應(yīng)用得到了臨床的重視[3]。本次研究旨在研究辛伐他汀(SIM)對(duì)高糖培養(yǎng)腎小球系膜細(xì)胞(GMC)增殖和細(xì)胞周期的影響并對(duì)其機(jī)制進(jìn)行探討。

1材料與方法

1.1材料(1)GMC：HBZY-1細(xì)胞由上海蔚通實(shí)業(yè)有限公司提供。(2)藥物：SIM由杭州默沙東制藥有限公司提供，批號(hào)20150201。(3)試劑：RPMI-1640培養(yǎng)基(R1383)、0.5%胰蛋白酶和D-Hank′s 溶液由美國Gibco公司提供，小牛血清(FCS)由上海浦東高橋畜牧廠提供，4-甲基偶氮四唑藍(lán)(MTT)和二甲亞砜(DMSO)均由美國Sigma公司提供，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(TGF-β1)ELISA試劑盒和纖維黏連蛋白(FN)ELISA試劑盒由上海嵐派生物科技有限公司提供，Ⅳ型膠原(COL4)化學(xué)發(fā)光免疫試劑盒由北京盛世中方生物科技有限公司提供。

1.2方法

1.2.1液體配制標(biāo)準(zhǔn)RPMI-1640培養(yǎng)液配制：取RPMI-1640粉劑一袋溶于300 mL三蒸水中，稱取2 g碳酸氫鈉粉末、2 g(11.1 mmol)葡萄糖(Glu)和2.38 g谷氨酰胺粉末溶于上述液體，加三蒸水調(diào)劑體積至1 000 mL，并用0.1 mol/L的碳酸氫鈉和0.1 mol/L的鹽酸溶液調(diào)節(jié)pH至6.9，用濾菌紙濾過后4 ℃保存?zhèn)溆?。低糖RPMI-1640培養(yǎng)液配制：配制高糖培養(yǎng)基時(shí)，取RPMI-1640粉劑一袋溶于300 mL三蒸水中，稱取2 g碳酸氫鈉粉末、1 g(5.6 mmol)Glu、2.38 g谷氨酰胺粉末溶于上述液體，其余方法同標(biāo)準(zhǔn)RPMI-1640培養(yǎng)基的配制。配制高糖培養(yǎng)基時(shí)，取RPMI-1640粉劑一袋溶于300 mL三蒸水中，稱取2 g碳酸氫鈉粉末，5.4 g(30.0 mmol)Glu，2.38 g谷氨酰胺粉末溶于上述液體，其余方法同標(biāo)準(zhǔn)RPMI-1640培養(yǎng)基的配制。

1.2.2細(xì)胞培養(yǎng)及傳代將-80 ℃保存的HBZY-1細(xì)胞于37 ℃水浴快速溶化，用5.0 mL培養(yǎng)基混勻于已融化的細(xì)胞懸液，離心機(jī)1 500 r/min離心3 min。棄上清，再吸取5.0 mL培養(yǎng)基混勻細(xì)胞沉淀，再1 500 r/min離心3 min，棄上清液，細(xì)胞沉淀用5.0 mL培養(yǎng)基混勻加入75 cm2方瓶，另加入14.0 mL培養(yǎng)基。于37 ℃、5% CO2孵育箱中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞長(zhǎng)至70%～80%開始進(jìn)行傳代：棄GMCs原培養(yǎng)液，加入0.25%的胰蛋白酶3～4 mL消化2 min，棄胰蛋白酶溶液。加入10 mL的標(biāo)準(zhǔn)RPMI-1640培養(yǎng)液反復(fù)吹打至細(xì)胞脫落，將制備的細(xì)胞懸液接種于培養(yǎng)基或培養(yǎng)板中繼續(xù)傳代培養(yǎng)。

1.2.3MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，制備細(xì)胞密度為2×105個(gè)/mL的單細(xì)胞懸液，將100 μL的細(xì)胞懸液加入96孔板中。設(shè)置4組，包括：低糖組(LG組，Glu 5.6 mmol/L)18孔，3個(gè)時(shí)間點(diǎn)，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)6個(gè)復(fù)孔，高糖組(HG組， Glu 30 mmol/L)18孔， HG+SIM(10 μg/L)組18孔，HG+SIM(25 μg/L)組18孔，4組實(shí)驗(yàn)并列同時(shí)進(jìn)行。分別檢測(cè)各組細(xì)胞生長(zhǎng)24、48、72 h的細(xì)胞濃度：每孔加入100 μL的5 mg/mL的MTT溶液；將24孔板于37 ℃下孵育4 h，棄去液體，每孔加入500 μL DMSO，振蕩10 min后采用AMR-100酶標(biāo)儀在450 nm處測(cè)吸光度(A)值，根據(jù)A值繪制細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線。

1.2.4細(xì)胞周期檢測(cè)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，制備細(xì)胞密度為2×105個(gè)/mL的單細(xì)胞懸液，將500 μL的細(xì)胞懸液置于12孔板中，細(xì)胞的分組及處理方式同1.4。將各組細(xì)胞于37 ℃、5%CO2孵育箱中培養(yǎng)72 h后進(jìn)行細(xì)胞周期檢測(cè)：抽取上清液，做好標(biāo)記后置于-20 ℃中保存。加入0.25%的胰蛋白酶0.2 mL消化2 min，棄胰蛋白酶溶液，加入0.5 mL的RPMI-1640培養(yǎng)液反復(fù)吹打至細(xì)胞脫落。將單細(xì)胞懸液加入2 mL圓底離心管中，1 500 r/min離心,5 min，棄上清液。加入PBS 1 mL離心洗滌1次，棄上清液。加入2 mL預(yù)冷的70%乙醇，4 ℃固定30 min，或-20 ℃固定過夜。離心，棄上清液。用1×PBS 1 mL洗滌1次，離心。加入含50 mg/L的含RNA酶的500 μL 1×PBS中，37 ℃孵育30 min，離心。用1×PBS 1 mL洗滌1次，離心。用50 g/L碘化丙啶(PI)溶液進(jìn)行避光染色30 min后用流式細(xì)胞儀分析G0/G1、G2+M期和S期細(xì)胞所占的比例。

1.2.5細(xì)胞上清液TGF-β1、FN及COL4檢測(cè)將1.5中制備的細(xì)胞上清液于37 ℃下快速解凍，使用ELISA檢測(cè)上清液中的TGF-β1和FN水平， COL4檢測(cè)采用化學(xué)發(fā)光免疫法。

2結(jié)果

2.1各組細(xì)胞不同時(shí)刻的A值比較HG組上不同時(shí)刻的A值高于HG+SIM(10 μg/L)組、HG+SIM(25 μg/L)和LG組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖1。

圖1　　各組細(xì)胞不同時(shí)刻的A值

2.2各組細(xì)胞的細(xì)胞周期比較各組細(xì)胞的G0/G1、G2+M期和S期細(xì)胞所占的比例差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表1。各組細(xì)胞72 h時(shí)的細(xì)胞形態(tài)見圖2。LG組細(xì)胞呈橢圓形，細(xì)胞質(zhì)多有突出，與周圍細(xì)胞發(fā)生接觸；HG組細(xì)胞呈近圓形，體積增大，突出減少；HG+SIM(10 μg/L)組細(xì)胞呈橢圓形，突出減少，部分細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)空泡；HG+SIM(25 μg/L)組細(xì)胞呈橢圓形，形態(tài)與LG組相比無明顯改變。

A:LG組；B：HG組；C：HG+SIM(10 μg/L)組；D:HG+SIM(25 μg/L)組。

圖2　　各組細(xì)胞72 h的細(xì)胞形態(tài)(×400)

2.3各組細(xì)胞的上清液TGF-β、FN和COL4水平比較各組細(xì)胞的上清液TGF-β1、FN和COL4水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表3。

表3　　各組細(xì)胞的上清液TGF-β1、FN和COL4

3討論

研究發(fā)現(xiàn)，高血糖是糖尿病腎病發(fā)病的重要原因之一：高血糖可以刺激GML增生和肥大，細(xì)胞外基質(zhì)增多，腎小球血管硬化和腎間質(zhì)纖維化，最終引起腎小球?yàn)V過率下降及腎功能減退[4-5]。研究發(fā)現(xiàn)，他汀類藥物在糖尿病腎病的治療中具有一定的價(jià)值，SIM可以延緩糖尿病腎病的進(jìn)展[5]。但他汀類藥物改善糖尿病腎病患者腎功能的機(jī)制目前尚未明確。

本次研究中，HG刺激的3組大鼠GMC的增殖活性明顯高于LG培養(yǎng)的GMC，3組細(xì)胞不同時(shí)刻的A值明顯高于LG組。SIM處理的細(xì)胞增殖能力明顯低于HG組，說明SIM可以抑制GMC的增殖。比較各組細(xì)胞的細(xì)胞周期，72 h后，HG刺激的3組細(xì)胞的G0/G1明顯低于LG組細(xì)胞。研究發(fā)現(xiàn)，高濃度的Glu可以阻礙GML的細(xì)胞周期從G1期至S期的轉(zhuǎn)化，GMC的DNA的合成受阻,而RNA與蛋白質(zhì)的合成增加，導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生肥大。本次研究中，由于HG的刺激，GMC在G0期活化后便停滯于G1期，細(xì)胞不能順利進(jìn)入S期，故G0/G1和S期細(xì)胞比例減少[6-7]。SIM干預(yù)的細(xì)胞G0/G1和S期細(xì)胞比例高于HG組。故SIM可以改善GMC的肥大，且與劑量相關(guān)。

糖尿病患者多伴有脂類代謝的紊亂，他汀類藥物可以通過有效的降低血脂而保護(hù)腎臟[8]。同時(shí)，SIM可以影響多種細(xì)胞因子及生長(zhǎng)因子，調(diào)節(jié)炎癥性細(xì)胞因子的信號(hào)傳導(dǎo)和細(xì)胞增殖及凋亡[9]。本次研究中，HG刺激細(xì)胞的上清液TGF-β1水平明顯高于LG組，而SIM可以降低TGF-β1和細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的水平，且與劑量相關(guān)。TGF-β1在糖尿病腎病發(fā)生發(fā)展中起著重要作用[10]。而HG可能通過形成糖基化終末產(chǎn)物、增加活性氧濃度及增高血管緊張素Ⅱ、活化己糖胺通路等上調(diào)TGF-β1的表達(dá)，該細(xì)胞因子可以通過細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)化途徑促進(jìn)腎小球系膜細(xì)胞合成p27，阻止細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期，導(dǎo)致細(xì)胞肥大[6，11]。同時(shí)，TGF-β1可以促進(jìn)GMC合成細(xì)胞基質(zhì)蛋白，促進(jìn)GMC的增生。

目前，關(guān)于SIM降低TGF-β1水平的機(jī)制尚未研究明確。SIM可能是通過影響細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子及激素的跨膜信號(hào)傳導(dǎo)而抑制TGF-β1基因的表達(dá)。他汀類藥物可以減少法尼酯焦磷酸的合成，從而抑制生長(zhǎng)因子與其受體的結(jié)合，減少p21ras途徑的激活，有效抑制p21ras介導(dǎo)的有絲分裂信號(hào)傳導(dǎo)[12]。同時(shí)，他汀類藥物可以抑制c-fos和c-jun的表達(dá)，減輕細(xì)胞的炎性反應(yīng)[13]。綜上所述，SIM可以通過降低TGF-β1水平來抑制GMC的增殖并調(diào)整細(xì)胞周期，抑制GMCs肥大。

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Effect and mechanism of simvastatin on proliferation and cycle of glomerular mesangial cells cultured in high-concentration glucose*

LinZhixin1,FuJunzhou1△,LiangMing1,CuiRujian2,ZhouDaoxiang3，ZhangYajie4

(1.DepartmentofNephrology,GuangzhouFirstPeople′sHospital,Guangzhou,Guangdong510000,China;2.DepartmentofNephrology,theFirstAffiliatedhospitalofGuangzhouMedicalUniversity,Guangzhou,Guangdong510120,China;3.DepartmentofClinicalLaboratory,YuexiuDistrictTraditionalChineseMedicineHospital,Giamgzhou,Guangdong510030,China;4.DepartmentofNephrology,theSecondAffiliatedhospitalofGuangzhouMedicalCollege,Guangdong,Guangzhou510260,China)

[Abstract]ObjectiveTo study the effect of simvastatin(SIM) on the proliferation and cycle of glomerular mesangial cells(GMCs) cultured in high concentration of glucose,and to observe the variation of inflammation factor and extracellular matrix.MethodsGMCs of rats were divided into 4 groups:low glucose(LG) group(Glu 5.6 mmol/L),High glucose (HG) group(Glu 30 mmol/L)， HG+SIM(10 μg/L)group and HG+SIM group(25 μg/L).Cells′ proliferation activity was tested by MTT,simultaneously compared the ratio of cells in different period (G0/G1,G2+M and M),and levels of TGF-β1,FN and COL4 were compared among different groups.ResultsAbsorbancy (A) of different periods in HG group was higher than that in other 3 groups,difference had statistical significance(P<0.05).In LG group,the ratio of cells in G0/G1 were(35.67±3.38)% while S-stage were(41.24±5.64)%;in HG group,the ratio of cells in G0/G1 were(25.88±4.02)% while S-stage were(28.65±1.88)%；in HG+SIM(10 μg/L)group,the ratio of cells in G0/G1 were(28.12±2.01)% while S-stage cell were(35.55±2.09)%;in HG+SIM(25 μg/L) group,the ratio of cells in G0/G1 were(31.85±3.52)%，while in S-stage were(39.82±2.23)%， the difference had statistical significance(P<0.05).Levels of TGF-β1,FN and COL4 in HG group were higher than those of in HG+SIM(10 μg/L)group,HG+SIM(25 μg/L)group and LG group,the difference had statistical significance(P<0.05).ConclusionBy decreasing TGF-β1 level,simvastatin can inhibit the proliferation of GMCs and regulate the cell cycle,to suppress the hypertrophy of GMCs.

[Key words]simvastatin;glomerular mesangial cells;cell proliferation;cell cycle;transforming growth factor β

doi:10.3969/j.issn.1671-8348.2016.01.009

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81000291)。

作者簡(jiǎn)介：林志鑫(1976-)，副主任醫(yī)師，碩士，主要從事主要從事腎臟疾病，血液透析、腹膜透析方面的研究。△通訊作者，E-mail:fujzhou@163.com。

[中圖分類號(hào)]R587.2

[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A

[文章編號(hào)]1671-8348(2016)01-0024-03

(收稿日期：2015-09-15修回日期：2015-10-20)