孫 菲 孫 欣

反相高效液相色譜法測(cè)定枯草桿菌二聯(lián)活菌顆粒中甜菊糖苷的含量

孫 菲 孫 欣

【摘要】目的 建立反相高效液相色譜（RP-HPLC）法測(cè)定枯草桿菌二聯(lián)活菌顆粒中甜菊糖苷的含量。方法 選用AgiLent Zobax SB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）為色譜柱，線性梯度洗脫，流動(dòng)相為乙腈-0.002 mol/L磷酸溶液；檢測(cè)波長為210 nm；流速1.0 ml/min；進(jìn)樣量10 μl；柱溫30 ℃。結(jié)果 甜菊糖苷的線性范圍為5.160～103.2 g/ml（r=0.9999，n=7）；提取回收率為99.04%（RSD為0.6%，n=6）。結(jié)論 本法操作簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確，可用于枯草桿菌二聯(lián)活菌顆粒的質(zhì)量控制。

【關(guān)鍵詞】枯草桿菌二聯(lián)活菌顆粒；含量測(cè)定；甜菊糖苷；反相高效液相色譜法

雞西市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心，黑龍江雞西 158100

甜菊素又稱甜菊糖或甜菊糖苷，是一種天然的甜味劑，文獻(xiàn)［1-5］報(bào)道其高甜度、低熱量、穩(wěn)定性好、安全性高，且具有降血糖、抑菌等特性，被廣泛應(yīng)用于各類食品、飲料、醫(yī)藥、日化工業(yè)，作為藥用輔料收載在《中國藥典》中?？莶輻U菌二聯(lián)活菌顆粒為兒童專用藥品，適用于因腸道菌群失調(diào)引起的腹瀉、便秘、脹氣、消化不良等。甜菊素作為枯草桿菌二聯(lián)活菌顆粒輔料中的甜味劑，現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)未對(duì)其含量進(jìn)行質(zhì)量控制，反相高效液相色譜（RP-HPLC）法排除了其他成分的干擾，可以準(zhǔn)確地檢測(cè)出枯草桿菌二聯(lián)活菌顆粒中甜菊糖苷的含量，為藥物質(zhì)量控制提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 HP1100高效液相色譜儀（安捷倫公司），HP1100工作站（自動(dòng)進(jìn)樣，紫外檢測(cè)器），METTLER TOLEDO電子天平（XSE 205），JAC-40型超聲波清洗器（功率：300 W，頻率：40 KHz，濟(jì)寧市奧波超聲電器有限公司），UV-2550紫外-可見分光光度計(jì)（蘇州島津）。

1.2 試藥 甜菊糖苷對(duì)照品（20150701，含量98.0%，曲阜圣仁制藥有限公司），市售枯草桿菌二聯(lián)活菌顆粒3批（北京韓美藥品有限公司，批號(hào)：20150531、20150419、20150509），水為娃哈哈純凈水，乙腈（TEDIA）色譜純，甲醇（科密歐）色譜純，磷酸（天津市恒興化學(xué)試劑制造有限公司）分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn) 選用AgiLent Zobax SB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）為色譜柱，流動(dòng)相以乙腈（A）-0.002 mol/L磷酸溶液（B），按照表1比例，進(jìn)行線性梯度洗脫；流速1.0 ml/min；檢測(cè)波長為210 nm；進(jìn)樣量10 μl；柱溫30 ℃。理論板數(shù)以甜菊糖苷計(jì)不低于7000，甜菊糖苷與相鄰峰的分離度均符合要求。

表1 線性梯度洗脫程序

2.2 溶液的制備

2.2.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取甜菊糖苷對(duì)照品21.06 mg（含量98.0%）置20 ml量瓶中，加乙腈-0.002 mol/L磷酸溶液（25：75）適量，超聲使其溶解，加上述溶液稀釋至刻度，作為對(duì)照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備 精密稱取樣品適量（約1 g）置100 ml量瓶中，加乙腈-0.002 mol/L磷酸溶液（25：75）40 ml，超聲提取10 min（功率：300 W，頻率：40 KHz），放置至室溫，加上述溶液稀釋至刻度，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液1.0 ml置20 ml量瓶中，加上述溶液稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液。

2.2.3 陰性對(duì)照溶液的制備 按枯草桿菌二聯(lián)活菌顆粒的處方，不加甜菊素，依法制備陰性樣品，按2.2.2項(xiàng)下供試品溶液制備的方法制備陰性對(duì)照溶液。分別取對(duì)照溶液、供試品溶液、陰性對(duì)照溶液，微孔濾膜濾過，按上述色譜條件，分別進(jìn)樣，色譜圖見圖1。

圖1 對(duì)照品溶液、供試品溶液和陰性對(duì)照溶液HPLC色譜圖（1為甜菊糖苷）

2.3 線性關(guān)系考察 精密量取2.2.1項(xiàng)下的對(duì)照品溶液0.1、0.2、0.4、0.5、0.8、1.0、2.0 ml置20 ml量瓶中，按上述色譜條件，分別進(jìn)樣10 μl，以色譜峰面積Y對(duì)應(yīng)進(jìn)樣濃度X（μg/ml）進(jìn)行回歸分析，可得：甜菊糖苷回歸方程Y=29.27X-2.562，r=0.9999 （n=7），甜菊糖苷在5.160～103.2 μg/ml濃度范圍內(nèi)線性良好。

2.4 精密度實(shí)驗(yàn) 精密量取2.2.1項(xiàng)下的對(duì)照品溶液0.5 ml置20 ml量瓶中，加乙腈-0.002 mol/L磷酸溶液（25：75）至刻度，得濃度為25.80 μg/ml對(duì)照品溶液。搖勻，微孔濾膜濾過，連續(xù)重復(fù)進(jìn)樣5次，每次10 μl，記錄色譜圖峰面積，測(cè)得甜菊糖苷峰面積值的RSD為0.4%（n=5），實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明儀器精密度良好。

2.5 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 精密稱取樣品適量（約1 g），按2.2.2項(xiàng)下方法制備成供試品溶液，分別在供試品溶液配制后的0、2、4、8、12、16、24 h，按上述色譜條件，分別進(jìn)樣10 μl，記錄色譜圖峰面積，測(cè)得甜菊糖苷峰面積的RSD為0.5%（n=7），實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明甜菊糖苷在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.6 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 分別精密稱取同一批號(hào)供試品（批號(hào)：20150531）5份，按2.2.2項(xiàng)下的方法制備供試品溶液，按上述色譜條件，分別進(jìn)樣10 μl，記錄色譜圖峰面積，測(cè)量甜菊糖苷的平均含量為39.28 mg/袋，RSD為0.8%（n=5），實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明方法重復(fù)性較好。

2.7 回收率實(shí)驗(yàn) 精密稱取已知含量的樣品（批號(hào)：20150531）約0.5 g，6份，分別置100 ml量瓶中，另精密稱取甜菊糖苷對(duì)照品相當(dāng)于甜菊糖苷純品20 mg，6份，分別置上述100 ml量瓶中，按2.2.2項(xiàng)下的方法制備溶液，用微孔濾膜濾過，進(jìn)樣10 μl，結(jié)果甜菊糖苷平均回收率為99.04%（RSD=0.6%，n=6），見表2。

表2 甜菊糖苷回收率實(shí)驗(yàn)測(cè)定結(jié)果

2.8 樣品含量測(cè)定 取本品6袋，精密稱定，混勻，研細(xì)，精密稱取本品適量（約相當(dāng)于1 g）按2.2.2項(xiàng)下的方法制備供試品溶液，每一批號(hào)平行制備3份供試品溶液，按上述色譜條件，分別進(jìn)樣10 μl，記錄色譜圖峰面積，根據(jù)峰面積外標(biāo)法計(jì)算3批市售樣品中甜菊糖苷的含量，結(jié)果見表3。

表3 市售枯草桿菌二聯(lián)活菌顆粒含量測(cè)定結(jié)果（n=3）

3 討論

3.1 檢測(cè)波長的選擇 取對(duì)照品溶液在190～500 nm波長范圍內(nèi)進(jìn)行紫外掃描，在210 nm波長處有最大吸收，故檢測(cè)波長設(shè)為250 nm，實(shí)驗(yàn)圖譜基線平穩(wěn)，效果較好。

3.2 色譜選擇 實(shí)驗(yàn)過程中分別考察了AgiLent Zobax SB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）和AgiLent Zobax SB-C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）兩種色譜柱。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，150 mm短柱柱效較250 mm長柱低，且甜菊糖苷保留時(shí)間過短，甜菊糖苷色譜峰和相鄰色譜峰不能有效分離，選用250 mm長柱取得了較好的分離效果。

3.3 流動(dòng)相的考察 實(shí)驗(yàn)過程中分別考察了以甲醇-水、乙腈-水、乙腈-0.002 mol/L磷酸溶液為流動(dòng)相，結(jié)果表明乙腈-0.002 mol/L磷酸溶液為流動(dòng)相，甜菊糖苷色譜峰形最好，且保留時(shí)間適宜。

3.4 文獻(xiàn)［6］報(bào)道了容量法和RP-HPLC法測(cè)定甜菊糖苷含量的比較，表明RP-HPLC法能有效排除干擾，更加客觀準(zhǔn)確。待測(cè)物質(zhì)甜菊糖苷分離出后，采用梯度洗脫能快速洗脫其他物質(zhì)，排除實(shí)驗(yàn)干擾，有效提高分離效率，充分體現(xiàn)RP-HPLC法的高效、準(zhǔn)確、便利等特性。

3.5 甜菊糖苷具有“天然、綠色、安全、保健”等諸多優(yōu)點(diǎn)，文獻(xiàn)［7-8］探討了甜菊素代替蔗糖在中藥制劑中應(yīng)用，在未來的醫(yī)藥發(fā)展中甜菊素作為甜味劑應(yīng)用將更加廣泛。藥用輔料質(zhì)量對(duì)藥品的體內(nèi)溶出、釋放、代謝都起著重要作用，隨著藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的不斷提高和完善，藥品輔料逐漸增加到標(biāo)準(zhǔn)中，因此本法的建立是對(duì)現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)的有效補(bǔ)充和提高。

參考文獻(xiàn)

［1］ 王飛生，葉榮飛，閔建.甜菊糖苷的特性及應(yīng)用［J］.中國調(diào)味品，2009，34（10）：91-95.

［2］ 朱煥鈴，劉景彬，謝印芝.甜菊糖甙的性質(zhì)及在食品中的應(yīng)用［J］.食品研究與開發(fā)，2011，32（11）：189-192.

［3］ 王貴民，董振紅，郝再彬.甜葉菊糖苷的應(yīng)用和安全性的研究進(jìn)展［J］.中國食品添加劑，2007（6）：65-69.

［4］ 婁力行.甜菊糖及其衍生物的研究進(jìn)展［J］.中國糖料，2008（2）：70-72.

［5］ 曹芳，馮文靜，陳明，等.甜菊糖苷降糖作用研究［J］.中國藥物與臨床，2009，9（2）：127-127.

［6］ 劉景彬，劉安軍，戰(zhàn)虎，等.容量法與HPLC法測(cè)定甜菊糖甙含量結(jié)果的比較［J］.食品科技，2009，9（2）：127-127.

［7］ 錢麗明.關(guān)于中藥制劑用甜菊苷替代蔗糖的探討［J］.時(shí)珍國醫(yī)國藥，2005，16（2）：139-139.

［8］ 元新峰，張樹紅.淺談甜菊甙在中藥制劑中的應(yīng)用［J］.中國醫(yī)藥前沿，2008，13（3）：103-103.

Determination of Steviosin in Combine Bacillus Subtilis and Enterococcus Faecium Granules with Multivitamines，live By RP-HPLC

Sun Fei Sun Xin

【Abstract】Objective To establish RP-HPLC method for determination of Steviosin in Combine Bacillus Subtilis and Enterococcus Faecium Granules with Multivitamines，live.Methods Using a column packed with AgiLent Zobax SB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；The mobile phase was acetonitrile-0.002 mol/L H3pO4by gradient elution and the detection wavelength was 210 nm；the flow rate was 1.0ml/min，the injection volume was 10 μl，the column temperature was 30 ℃.Results The Linear response of Steviosin range from 5.160～103.2 μg/ml r=0.9999（n=7）；The average recovery of Steviosin was 99.04%，RSD= 0.6%（n=6）.Conclusion The method is convenient and accurate and can be used for the quality control of Combine Bacillus Subtilis and Enterococcus Faecium Granules with Multivitamines，live.

【Key words】Combine Bacillus Subtilis and Enterococcus Faecium Granules with Multivitamines，live；Determination；Steviosin；RP-HPLC

【中圖分類號(hào)】R927.2

【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】A 【DOI】10.12010/j.issn.1673-5846.2016.06.004

作者簡(jiǎn)介：孫菲（1981.12-），副主任藥師。研究方向：藥品檢驗(yàn)。E-mail：chenlizhu1980@163.com