王　茂，何彥霏，劉　丹，樊　皎，蘇　青,2△

1.成都醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院(成都　610083)；2.成都中醫(yī)藥大學(xué)(成都　610075)

殼聚糖創(chuàng)面噴霧劑處方篩選及對(duì)大鼠創(chuàng)傷愈合作用的研究*

王茂1，何彥霏1，劉丹1，樊皎1，蘇青1,2△

1.成都醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院(成都610083)；2.成都中醫(yī)藥大學(xué)(成都610075)

【摘要】目的篩選殼聚糖傷口護(hù)理膜處方，并評(píng)價(jià)其促進(jìn)創(chuàng)傷愈合的效果。方法采用酸堿性、透氣性和成膜性為評(píng)價(jià)指標(biāo)，L9 (34) 正交表進(jìn)行正交試驗(yàn)，篩選出殼聚糖創(chuàng)面噴霧劑最佳處方。制備SD大鼠創(chuàng)傷模型，以存活率、創(chuàng)面愈合時(shí)間、創(chuàng)面愈合率評(píng)價(jià)其促進(jìn)傷口愈合的能力。結(jié)果篩選出的最佳處方組成為：殼聚糖0.1 g、乳酸0.05 mL、水20 mL和乙醇10 mL。實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組和空白組恢復(fù)創(chuàng)傷當(dāng)天體質(zhì)量的時(shí)間分別為(7.14±1.21) d、(7.00±1.15) d和(10.00±2.45) d，與空白組相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.018和P=0.013)；實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組和空白組創(chuàng)面愈合時(shí)間分別為(11.17±0.75) d、(12.33±0.82) d和(14.00±0.89) d，與空白組相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.012和P=0.038)；與空白組相比，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組在傷后各時(shí)間點(diǎn)的創(chuàng)面愈合率均明顯提高(P<0.05)。結(jié)論自制殼聚糖創(chuàng)面噴霧劑能明顯縮短傷口愈合時(shí)間，促進(jìn)創(chuàng)面愈合。

【關(guān)鍵詞】殼聚糖；處方篩選；創(chuàng)傷；愈合

殼聚糖(chitosan)是甲殼素的脫乙酰產(chǎn)物，是迄今所發(fā)現(xiàn)的唯一天然堿性多糖，具有良好的生物相容性和可降解性，還具有抗菌、消炎、止血、減少創(chuàng)面滲出、促進(jìn)創(chuàng)傷組織再生、修復(fù)、愈合等作用，是促進(jìn)各類創(chuàng)面愈合的理想材料之一[1-2]。本研究研制了殼聚糖創(chuàng)面噴霧劑，該制劑噴灑于創(chuàng)面后可形成透氣保濕的隔離膜，保護(hù)創(chuàng)面并形成濕性環(huán)境，同時(shí)還具有抗?jié)B出、防粘連、止血、抗感染和促進(jìn)傷口愈合等作用，尤其適合人體腔道等難以包扎部位的傷口治療。本研究對(duì)殼聚糖創(chuàng)面噴霧劑處方進(jìn)行優(yōu)化，篩選出最優(yōu)處方，并評(píng)價(jià)其促進(jìn)創(chuàng)面愈合的能力。

1材料和方法

1.1材料

1.1.1試劑與儀器藥品穩(wěn)定性試驗(yàn)箱購(gòu)自重慶永生實(shí)驗(yàn)儀器廠，殼聚糖購(gòu)自上海伯奧生物科技有限公司，乳酸購(gòu)自成都市科龍化工試劑廠，烏拉坦購(gòu)自成都市科龍化工試劑廠。

1.1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SD大鼠21只，雌、雄各半，體質(zhì)量(240±10) g，由四川大學(xué)華西醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供(動(dòng)物合格證號(hào)：川實(shí)動(dòng)管質(zhì)第70號(hào))。

1.2方法

1.2.1殼聚糖創(chuàng)面噴霧劑制備 稱取處方量殼聚糖于燒杯中，加入定量乳酸和水，攪拌至溶解，加入無(wú)水乙醇和水至全量，裝入噴瓶中。使用前于烘箱85 ℃滅菌1 h，室溫放置24 h，如此反復(fù)滅菌3次即得。

1.2.2處方篩選評(píng)價(jià)指標(biāo)測(cè)定與計(jì)算微酸環(huán)境能抑制創(chuàng)面細(xì)菌生長(zhǎng)，創(chuàng)面pH值4.5～6.5對(duì)傷口愈合有利。酸堿性評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)為：酸堿性得分(A)=0(pH值<4.5或pH值>6.5)，酸堿性得分=10(4.5≤pH值≤6.5)。

精密移取5 mL乙酸乙酯于稱量瓶中，用稱量紙覆蓋瓶口，將 0.1 mL噴霧劑均勻涂抹于稱量紙上，稱重。另取同規(guī)格稱量瓶同法操作，但不涂抹噴霧劑。將以上兩組稱量瓶同時(shí)置于恒溫恒濕箱中靜置24 h(溫度為25 ℃，相對(duì)濕度為32%)后取出稱重，計(jì)算各自的失重，以二者失重的比值作為透氣性評(píng)價(jià)指標(biāo)(B)。

預(yù)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)個(gè)體差異對(duì)皮膚成膜時(shí)間影響較大，因此通過(guò)室溫和皮膚成膜時(shí)間兩個(gè)指標(biāo)綜合評(píng)價(jià)。將稱量紙覆蓋于稱量瓶口(50 mm×30 mm，直徑×高度)并固定，精密移取0.1 mL噴霧劑至稱量紙上涂抹均勻，立即置于恒溫恒濕箱中靜置，記下時(shí)間為T1，待噴霧劑揮干成膜后記下時(shí)間為T2，(T2-T1)即為室溫成膜時(shí)間(C)。精密移取0.1 mL噴霧劑均勻涂抹于人體手背，記下時(shí)間為t1，待噴霧劑揮發(fā)成膜后記下時(shí)間為t2，(t2-t1)即為皮膚成膜時(shí)間(D)。

1.2.3創(chuàng)傷造模與分組大鼠用烏拉坦腹腔注射麻醉后，四肢固定，去除背部毛發(fā)(注意不要損傷皮膚)。在大鼠背部脊柱一側(cè)1 cm處標(biāo)記一個(gè)直徑為1.8 cm的圓為造模區(qū)，酒精消毒，用鑷子將皮膚提起沿標(biāo)記剪去皮膚，造成一個(gè)全層皮膚切除開(kāi)放創(chuàng)面，深達(dá)肌肉。造模后，大鼠隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組(予以殼聚糖創(chuàng)面噴霧劑)、對(duì)照組(予以立見(jiàn)傷口護(hù)理膜噴霧劑)和空白組，每組各7只。實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組每日定時(shí)以距離大鼠創(chuàng)面15 cm噴霧給藥，每次噴灑3次，給藥量約為0.3 mL，空白組不做任何處理。溫度為21 ℃，濕度為55%的環(huán)境下使用無(wú)菌墊料單籠喂養(yǎng)，以做切口當(dāng)天記為0天，次日記為第1天， 觀察各項(xiàng)指標(biāo)。

1.2.4創(chuàng)面愈合率首次給藥后第4、8、12天用稱量紙覆蓋于創(chuàng)面上描記創(chuàng)面大小，掃描，用Image J軟件進(jìn)行分析取得面積數(shù)據(jù)，計(jì)算創(chuàng)面愈合率= (原始創(chuàng)面面積一未愈合創(chuàng)面面積)/原始創(chuàng)面面積×100%。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2結(jié)果

2.1正交試驗(yàn)篩選處方

為優(yōu)化殼聚糖、乳酸、水和乙醇在處方中的組成，以綜合評(píng)價(jià)為參考指標(biāo)，采用L9(34) 正交表安排實(shí)驗(yàn)，根據(jù)前期預(yù)實(shí)驗(yàn)，每個(gè)因素選擇3個(gè)水平(表1)。

表1　處方篩選正交實(shí)驗(yàn)

由正交試驗(yàn)結(jié)果和方差分析可知，4種因素中對(duì)綜合性能影響的大小順序?yàn)?殼聚糖>水>乙醇>乳酸，最優(yōu)處方為：A1B1C2D3；按最優(yōu)處方進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，所得處方各性能指標(biāo)皆優(yōu)(表2和表3)。

表2　正交試驗(yàn)結(jié)果

表3　方差分析表

注：F0.1(2,2)=9, F0.05(2,2)=19, F0.01(2,2)=99

2.2創(chuàng)傷愈合情況及存活率

造模后大鼠基本情況良好，第1天精神沉郁，活動(dòng)少，第2天開(kāi)始逐漸恢復(fù)正常，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組均比空白組活躍，恢復(fù)更快。創(chuàng)傷初期所有大鼠體質(zhì)量均急速下降，之后逐漸回升，實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組和空白組分別在(7.14±1.21) d、(7.00±1.15) d和(10.00±2.45) d恢復(fù)創(chuàng)傷當(dāng)天體質(zhì)量，與空白組相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.018和P=0.013)。實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組全部存活，存活率為100%；空白組死亡1只，存活率為83.33%，3組存活率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.354)。

2.3創(chuàng)面愈合時(shí)間

實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組和空白組創(chuàng)面愈合時(shí)間分別為(11.17±0.75) d、(12.33±0.82) d和(14.00±0.89) d。與空白組相比，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組傷口愈合時(shí)間明顯縮短，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.012和P=0.038)。

2.4創(chuàng)面愈合率

與空白組相比，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組在各時(shí)間點(diǎn)的創(chuàng)面愈合率均明顯提高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的創(chuàng)面愈合率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(表4)。

表4　各組創(chuàng)面愈合率

注：與空白組相比，*P<0.05

3討論

殼聚糖作為一種陽(yáng)離子多糖，具有抗菌、消炎、止血、減少創(chuàng)面滲出和促進(jìn)創(chuàng)傷組織再生、愈合等作用，是促進(jìn)創(chuàng)面愈合的理想材料之一。目前不少研究[3-6]將殼聚糖制備成膜劑、凝膠劑和敷料等用于創(chuàng)面愈合的治療，本研究將其制備成噴霧劑，處方簡(jiǎn)單，使用方便，尤其適合人體腔道等難以包扎部位的傷口治療，為殼聚糖新制劑開(kāi)發(fā)提供參考。

殼聚糖噴霧劑促進(jìn)創(chuàng)面愈合的原因?yàn)樗茉谄つw表面形成一層黏稠的液膜，該液膜能抵抗外界細(xì)菌感染，并形成濕性環(huán)境[7-8]，促進(jìn)傷口愈合。本研究采用酸堿性，成膜性和透氣性三個(gè)指標(biāo)綜合考察其質(zhì)量，為完善該制劑的質(zhì)量評(píng)價(jià)提供參考。

測(cè)量透氣性時(shí)，揮發(fā)溶劑考察了乙酸乙酯、乙醇、水、乙醚以及正丁醇等。由于處方中有水和乙醇，為避免相互影響，故排除水和乙醇；乙醚揮發(fā)性強(qiáng)，但對(duì)人有毒；正丁醇毒性較小，但揮發(fā)性不強(qiáng)；乙酸乙酯無(wú)毒，易揮發(fā)，符合要求。另外實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)處方中的殼聚糖在高溫下容易分解變性，故選擇低溫間歇滅菌方式。

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Formulation Optimization and Pharmacodynamics Research of Chitosan Wound Sprays

WangMao1,HeYanfei1,LiuDan1,FanJiao1,SuQing1,2△.

1.SchoolofPharmacy,ChengduMedicalCollege,Chengdu610083,China;2.SchoolofPharmacy,ChengduUniversityofTraditionalChineseMedicine,Chengdu610075,China

【Abstract】ObjectiveTo develop an optimal prescription of chitosan wound sprays and to study its efficacy in promoting wound healing. MethodsL9 (34) orthogonal table was used to screen optimal prescription with pH, permeability and film-forming properties as evaluation indicators. SD rat would model was prepared and its ability to promote wound healing was evaluated in terms of survival rate, healing time, healing rate, etc. ResultsThe optimal formulation consisted of chitosan 0.1 g, lactic acid 0.05 mL, water 20 mL and ethanol 10 mL. The time of body weight recovery in experimental group, control group and blank group were (7.14±1.21) d, (7.00±1.15) d and (10.00±2.45) d respectively. Compared with blank group, the differences were statistically significant (P=0.018, P=0.013). The recovery time of experimental group, control group and blank group were (11.17±0.75) d, (12.33±0.82) d and (14.00±0.89) d respectively. Compared with blank group, the differences were statistically significant (P=0.012 and P=0.038). Compared with the blank group, the wound healing rate of experimental group and control group were obviously improved in 4, 8 and 12 d, the differences were statistically significant (P<0.05). ConclusionThe self-made chitosan wound sprays can significantly shorten the healing time and promote wound healing.

【Key words】Chitosan; Prescription screening; Wound; Healing

doi:10.3969/j.issn.1674-2257.2016.01.005

*基金項(xiàng)目：省級(jí)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目(No：201313705015)；成都醫(yī)學(xué)院“大學(xué)生創(chuàng)新實(shí)驗(yàn)計(jì)劃”( No：CXXS201320)；四川省教育廳重點(diǎn)項(xiàng)目(No：14ZA0232)

通信作者：△蘇青，E-mail:suqing@cmc.edu.cn

【中圖分類號(hào)】R641

【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】A

網(wǎng)絡(luò)出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/51.1705.R.20160221.2059.050.html

·論著·