王 舒肖 艷李 哲張利萍郭勁松（.重慶大學城市建設與環(huán)境工程學院，重慶 400044； 2.中國科學院重慶綠色智能技術研究院，重慶 40074； 3.中國科學院水庫水環(huán)境重點實驗室，重慶 40074）

小球藻純種室內(nèi)模擬培養(yǎng)初探

王 舒1肖 艷2，3李 哲2，3張利萍1郭勁松2，3
（1.重慶大學城市建設與環(huán)境工程學院，重慶 400044； 2.中國科學院重慶綠色智能技術研究院，重慶 400714； 3.中國科學院水庫水環(huán)境重點實驗室，重慶 400714）

摘要：實驗以小球藻為藻種，構建室內(nèi)模擬培養(yǎng)裝置，在選定的一組優(yōu)化的光照、溫度和營養(yǎng)鹽濃度條件下，采用間歇培養(yǎng)+連續(xù)培養(yǎng)的方式對其進行單種群培養(yǎng)，模擬藻類生物量積累的過程。將培養(yǎng)期劃分為5個階段，通過分析各階段的光合熒光參數(shù)以及藻細胞內(nèi)C、N、P含量，初探生物量積累過程中藻生理參數(shù)的變化特征，為研究水華的發(fā)生、維持和消退提供一定的參考。結果顯示:調(diào)整期，藻生長不受生境光熱、營養(yǎng)鹽限制，小球藻光合活性較強； 對數(shù)生長期，藻類開始出現(xiàn)光抑制，熱耗散增加，胞內(nèi)N、P含量及N/P值較高； 對數(shù)生長期和穩(wěn)定期，藻同時受光抑制和營養(yǎng)鹽抑制，N和P含量、N/P值均下降； 連續(xù)培養(yǎng)期，營養(yǎng)鹽限制得到緩解，小球藻光合活性開始升高，且藻細胞對N、P營養(yǎng)物吸收能力增強。監(jiān)控藻類生物量積累過程中細胞內(nèi)氮磷下降的“拐點”和細胞內(nèi)元素比例變化可為預測水華的消退提供一定的參考依據(jù)。

關鍵詞：小球藻； 生物量積累； 生理特征； 水華

水華現(xiàn)象是近年來我國水體生態(tài)學研究領域的熱點。水華是指當水體出現(xiàn)富營養(yǎng)狀況，并且在利于藻類生長和聚集的光強、溫度以及氣候等環(huán)境條件下，水體藻類大量繁殖或聚集并達到一定濃度的現(xiàn)象［1］。從單種群生長的角度，水華表現(xiàn)為優(yōu)勢藻在生境中最大化生長以實現(xiàn)生物量積累。普遍認為水華形成的誘因是生境條件改變刺激優(yōu)勢藻生長。如今已有大量［2—5］針對不同生境界因子如光照、溫度和CO2濃度等對藻類生長影響的研究。然而水華是否暴發(fā)，其高生物量是否在一定時期內(nèi)維持，這與藻類自身對生境條件改變所做出的生理響應也有一定的關聯(lián)。

目前關于藻類生長對生境變化的響應機制研究主要有室內(nèi)模擬和野外原位實驗兩種手段。室內(nèi)藻類培養(yǎng)大多采取光照培養(yǎng)箱，通過側(cè)面光照系統(tǒng)和溫控裝置對藻類生長進行觀測，主要用于藻類種群生物量累積等方面的研究，但對于模擬水體光強垂直單向衰弱以及水體紊流擾動等對藻類的影響存在一定的局限性。野外原位實驗極易受到氣候變化的影響，難以通過獨立控制單一因子，定量分析不同生境要素下藻類生長響應機制。

因此，為進一步明晰水華形成過程中藻類細胞生理的調(diào)整特征，研究設計了模擬室內(nèi)試驗裝置，選取小球藻作藻種，采用間歇培養(yǎng)+連續(xù)培養(yǎng)的方式對其進行單種群培養(yǎng)，模擬藻生物量積累的過程，將培養(yǎng)期劃分為間歇1期（1—3d）、間歇2期（4—8d）、間歇3期（9—14d）、稀釋率0.01/d期（15—24d）、稀釋率0.03/d期（25—36d）5個階段，通過對各階段葉綠素熒光參數(shù)以及藻細胞內(nèi)C、N、P含量的分析，初探生物量積累過程中藻類細胞的生理參數(shù)變化特征，為研究水華的形成、維持和消退提供一定的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藻類生物量積累室內(nèi)模擬裝置的構建

本文提出一種可模擬光照在自然水體中垂直分布特性、可在線監(jiān)測或控制其他實驗參數(shù)的藻類培養(yǎng)裝置。模擬裝置的尺寸為40 cm×80 cm× 50 cm（長×寬×高），包括培養(yǎng)液供給系統(tǒng)、培養(yǎng)箱供氣系統(tǒng)、培養(yǎng)箱、培養(yǎng)箱頂部光源陣列與控制系統(tǒng)、在線監(jiān)測系統(tǒng)、培養(yǎng)液出流與取樣裝置、外側(cè)控溫系統(tǒng)等。其結構如圖1—4所示，具有以下突出特點:（1）光源均勻置于培養(yǎng)箱頂部，通過調(diào)節(jié)啟閉燈管的數(shù)量和單根燈管的功率來控制入射的光照強度。光照入射方式同天然水體相同，可以很好的模擬天然水體中光照單向傳遞的現(xiàn)象。（2）培養(yǎng)箱可通過出水口的調(diào)節(jié)，采取不同水深的水樣，實現(xiàn)對藻類生長和藻類垂向運動的研究。（3）培養(yǎng)箱內(nèi)置水下光量子儀，可精確測量不同水深下光照強度的變化特征。（4）培養(yǎng)箱的水浴溫控裝置可以調(diào)節(jié)不同水層的水溫，模擬天然水體中水溫分層的特征。（5）培養(yǎng)箱系統(tǒng)各組件可拆卸，便于清潔和滅菌。（6）通過在線探頭，可以對培養(yǎng)箱內(nèi)藻類生長過程進行精確監(jiān)控，并通過無紙記錄儀自動記錄。（7）培養(yǎng)箱可設置間歇運行、連續(xù)運行、半連續(xù)運行等多重運行模式，通過光照調(diào)節(jié)、水溫調(diào)節(jié)、培養(yǎng)液濃度調(diào)節(jié)等，可模擬不同環(huán)境對藻類生長的影響。其中:1.PVC板材箱體； 2.透明有機玻璃頂板； 3.接種孔； 4.在線監(jiān)測探頭安裝孔； 5.水下光量子儀測量孔； 6.供氣干管； 7.光源陣列； 8.常閉的承插式觀察孔； 9.溫控裝置； 10.出樣口； 11.曝氣支管； 12.曝氣頭； 13.曝氣管槽； 14.培養(yǎng)液進樣管；15.培養(yǎng)液進樣孔； 16.水下光量子探頭固定平臺；17.垂直導軌； 18.溫控材料； 19.PLC控制單元； 20.培養(yǎng)液進樣系統(tǒng)； 21.蠕動泵； 22.光量子儀探頭；23.可拆卸連桿； 24.水下光量子儀光纜； 25.氣泵；26.流量調(diào)節(jié)閥； 27.流量計； 28.空氣過濾器； 29.在線監(jiān)測探頭； 30.探頭PLC控制單元。

1.2 實驗材料

藻種及培養(yǎng) 小球藻（Chlorella sp.FACHB-8）購于中國科學院淡水藻種庫（FACHB-collection）。以BG11為基礎培養(yǎng)基進行常規(guī)培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度（25±1）℃，光照強度25 μmol/（m2·s），光周期12h︰12h。

圖 1 模擬裝置頂部示意圖

圖 2 模擬裝置底部示意圖

圖 3 模擬裝置A-A剖面圖

圖 4 模擬裝置B-B剖面圖

藻液的制備 藻種在使用前先饑餓培養(yǎng)1周，取10 mL藻種于離心管中，以4500 r/min離心15min，棄上清液，加入15 mg/L NaHCO3溶液，用于除去表面吸附的多余的營養(yǎng)鹽，再次離心15min，棄上清，重復2次，藻種的初始密度為1.0×104左右 。從而獲得將被接種于模擬裝置的藻液。

1.3 模擬裝置的運行

實驗通過對裝置的稀釋率調(diào)節(jié)來實現(xiàn)室內(nèi)模擬藻類生物量積累。當稀釋率低于藻類生長速率時，藻類可利用營養(yǎng)物質(zhì)再次進行生物量的累積，從而達到該生境下的最大生物量值。稀釋率是指培養(yǎng)液在模擬裝置內(nèi)平均停留時間的倒數(shù)。計算公式如下:

式中，D（/d）、F（L/d）、V（L）分別表示稀釋速率、培養(yǎng)液輸入流量、藻液體積。

在使用之前先將模擬裝置內(nèi)部清洗并紫外滅菌消毒，然后通過蠕動泵將超純水注入，打開曝氣裝置，將模擬裝置滿負荷運行3—5d，排水，待用。將滅菌后的培養(yǎng)液通過蠕動泵注入模擬裝置內(nèi)，直至液面上升到20 cm處；培養(yǎng)液的供給管路置于箱內(nèi)底部的一側(cè)，沿培養(yǎng)管均勻設置若干小孔，培養(yǎng)液經(jīng)過高溫滅菌后通過密封的硅膠管路由蠕動泵抽入培養(yǎng)箱內(nèi)。接著通過接種孔將培養(yǎng)至對數(shù)生長期的藻液接入培養(yǎng)箱內(nèi)，打開曝氣裝置，使培養(yǎng)箱內(nèi)藻液混合均勻；在實驗中使用的氣體為空氣，由空氣泵通過流量調(diào)節(jié)閥，經(jīng)空氣過濾器過濾后，由與箱體底部的曝氣砂頭通氣支管通入培養(yǎng)箱內(nèi)，氣體的供給一方面用于培養(yǎng)箱內(nèi)水體攪拌，維持水體一定的紊流擾動，另一方面用于補給藻類生長過程中所需的碳源，亦可調(diào)節(jié)箱內(nèi)水體酸堿度，本實驗設置的通氣速率為0.6 L/min。通過頂部光源陣列系統(tǒng)和側(cè)面溫控系統(tǒng)將培養(yǎng)箱的光照強度和溫度分別設定為100 μmol/（m2·s）和25℃，每天8:00開啟，20:00關閉，光周期為12h︰12h。

先通過間歇運行階段，使藻類在特定的生境下歷經(jīng)調(diào)整期和對數(shù)期，隨著營養(yǎng)物的消耗的加劇，最終藻類生物量達到一個穩(wěn)定值，進入穩(wěn)定期。此時模擬裝置開啟連續(xù)培養(yǎng)運行階段，其他條件保持不變，以相同的流量不斷的加入和放出培養(yǎng)液，培養(yǎng)液的放出由箱右側(cè)的出樣口進行，最初稀釋速率設置為0.01/d，運行一段時間后，藻類生物量再次達到一個穩(wěn)定值進入穩(wěn)定期，此時再將稀釋速率調(diào)為0.03/d運行一段時間。在培養(yǎng)期間，取樣時間為每天的9:00—10:00。按照實驗計劃進行指標測試。

1.4 監(jiān)測指標及方法

在線監(jiān)測指標 在線監(jiān)測指標主要有pH、ORP和DO，通過無紙記錄儀每隔30min記錄一次數(shù)據(jù)。通過檢測這3個指標判斷內(nèi)部環(huán)境是否在小球藻生長的適宜范圍內(nèi)，以便能及時進行調(diào)整。

光合熒光動力學參數(shù)指標 實驗采用由德國Walz公司生產(chǎn)的PHYTO-PAM，它的特點是分析快速、靈敏和非破壞性。取水樣2 mL于樣品杯中，放在黑暗環(huán)境中暗適應15min后，放入PHYTOPAM儀器中，分別測出最小熒光F0、最大熒光Fm，其中（Fm-F0）為可變熒光Fv，F(xiàn)v/Fm即為PSⅡ（光系統(tǒng)Ⅱ）的最大光量子產(chǎn)量，反映了藻類的潛在最大光合效率［6］。水樣不經(jīng)過暗適應，PHYTO-PAM測定其Fm′、Fs，通過公式1、公式2可得ΦPSII、NPQ。計算公式如下：

式中:Fm′表示光適應狀態(tài)下所有反應活性中心都關閉并且所有的非光化學過程都處于最優(yōu)態(tài)的熒光產(chǎn)量； Fs表示穩(wěn)態(tài)熒光產(chǎn)量； ΦPSⅡ表示PSⅡ光化學能量轉(zhuǎn)化的有效量子產(chǎn)量； NPQ表示非光化學淬滅，通常作為光適應狀態(tài)下PSⅡ的天線系統(tǒng)將過量的光能耗散為熱能的監(jiān)測指標。

小球藻細胞內(nèi)葉綠素的測定 取4 mL藻液于5 mL離心管中，在溫度25℃、轉(zhuǎn)速6000 r/min下離心5min，吸掉上清液，向所得沉淀中加入4 mL 95%乙醇，于4℃避光提取24h后離心（6000 r/min，4℃，5min）并取上清液，于649 nm和665 nm波長處，以95%乙醇為參比，測定吸光度，葉綠素a計算公式為Chl.a=13.7A665-5.76A649，單位μg/L［7］。

小球藻細胞內(nèi)P、C、N的測定 藻P（CellP）的測定。將直徑為25 mm、孔徑為0.45 μm 的GF/F膜在45℃下灼燒4h，在干燥器中冷卻置室溫后，過濾水樣收集藻細胞，用蒸餾水通過濾膜2—3次去除GF/F膜上的營養(yǎng)鹽。將過濾后含有藻細胞的濾膜置于50 mL具塞比色管中，加蒸餾水至25 mL，將膜淹沒其中后，加入5%過硫酸鉀溶液4 mL。高壓鍋120℃滅菌30min。冷卻至室溫，加蒸餾水至50 mL。使用鉬藍法測定磷酸鹽含量。

藻C（CellC）、藻N（CellN）的測定。將直徑為25 mm、孔徑為0.45 μm的GF/F膜在45℃下灼燒4h，在干燥器中冷卻置室溫后，過濾水樣收集藻細胞，用蒸餾水通過濾膜2—3次去除GF/F膜上的營養(yǎng)鹽。將過濾后含有藻細胞的濾膜于65℃下烘24h后于元素分析儀測定藻細胞內(nèi)C、N含量。

2 結果

目前關于水華的評判標準大多采用的是水體中Chl.a的濃度大于10 μg/L，生物量大于2×104cell/ L［8］這一指標，本論文中水華判斷亦采用此標準。圖 5為裝置內(nèi)小球藻的生長曲線，根據(jù)模擬裝置內(nèi)小球藻的生長曲線以及裝置的不同運行模式，本文將小球藻的培養(yǎng)期劃分為5個階段:間歇1期，1—3d，該時期為小球藻的調(diào)整期； 間歇2期，4—8d，該時期為小球藻的前指數(shù)生長時期； 間歇3期，9—14d，該時期為小球藻后指數(shù)生長時期和穩(wěn)定期； 稀釋率0.01/d期，15—24d，該時期為裝置以稀釋率為0.01/d運行時期； 25—36d，該時期為裝置以稀釋率為0.03/d運行時期。從各階段葉綠素熒光參數(shù)和藻C、N、P含量兩個方面來探討小球藻生物量積累過程中的生理響應。

圖 5 裝置內(nèi)小球藻生長曲線

2.1 模擬裝置內(nèi)在線pH、ORP及DO的監(jiān)控

使用在線pH和ORP控制探頭可實現(xiàn)對培養(yǎng)箱內(nèi)藻類生長過程的精確監(jiān)控。水體pH是一個重要的生態(tài)參量，主要從兩個方面來影響微藻的生長:一方面改變環(huán)境的酸堿度，較強的酸性或堿性均會對藻細胞產(chǎn)生傷害； 另一方面通過影響水體碳酸鹽的平衡以及不同形態(tài)無機碳的分配關系來影響藻類的生長。不同的藻種有不同的pH適應范圍:魚腥藻的適宜pH范圍為8.0—9.0，微囊藻的pH適宜范圍為9.0左右，來萊茵衣藻的最適pH范圍為7.0左右［9］。氧化還原電位（ORP）也是廣泛用于檢測水體水質(zhì)的重要指標，水體中ORP較低時表明還原性物質(zhì)或有機污染物含量高，不利于藻類的生長，但過高的ORP對生物的生長也不利。一般好氧微生物在氧化還原電位為+100 mV以上均可生長，但最適值為+300—+400 mV； 厭氧性微生物只能在較低于+100 mV以下生長。表1為模擬裝置內(nèi)在線監(jiān)測結果。

藻類在生長過程中通過光合作用吸收CO2釋放O2，水體pH含量會升高，同時藻類產(chǎn)生的還原性產(chǎn)物以及水體中溶解氧的降低也會使ORP降低。本實驗的目的是在模擬裝置運行過程中小球藻的生物量達到最大形成水華，故而當水體中pH或ORP過高或過低時，需通過改變曝氣量使得pH和ORP維持在小球藻適宜生長的范圍內(nèi)。有研究表明小球藻的適宜酸堿度為7.0—8.0［10］。模擬裝置運行過程中pH的變幅為7.535—7.648，ORP的變幅為290—430 mV，均在小球藻適宜生長范圍內(nèi)。

2.2 模擬裝置內(nèi)小球藻光合熒光參數(shù)的變化

藻類吸收的光能的用途有三個途徑:光合作用、熱耗散以及熒光。光合熒光動力學參數(shù)反應了小球藻的光合作用的過程和生境要素對光合能力的影響。Fv/Fm在正常生理狀態(tài)下，它是一個穩(wěn)定的值，藻類約為0.65［11］，當藻類受到環(huán)境脅迫時其值開始顯著下降，它常用作研究環(huán)境脅迫對光合作用影響的重要指標。ФPSⅡ表示任一光照下的PSⅡ?qū)嶋H光合能量。有研究表明［12，13］，當藻類受到營養(yǎng)鹽限制時，光合作用能力會下降。NPQ是一種重要的“下游調(diào)節(jié)”機理，當外界條件發(fā)生變化時，通過NPQ的調(diào)節(jié)可以使光化學淬滅保持恒定，但NPQ的調(diào)節(jié)是有限的［14］。它通常作為光適應狀態(tài)下PSⅡ的天線系統(tǒng)將過量的光能耗散為熱能的監(jiān)測指標。

圖 6—9分別為培養(yǎng)期間5個階段Chl.a含量、Fv/Fm、ФPSⅡ及NPQ的變化。

表 1 模擬裝置內(nèi)在線監(jiān)測指標Tab.1 Online indicators during chemist at running

由圖 7可知，整個模擬裝置運行期間，小球藻的光合活性Fv/Fm總體變化幅度不大，但在間歇2期和間歇3期較其他培養(yǎng)階段低。圖 8可知，模擬裝置運行過程中，間歇1期ФPSⅡ均值高于其他培養(yǎng)時期，間歇2期和間歇3期較其他培養(yǎng)階段低。圖 9可知，模擬裝置運行過程中，NPQ均值處于逐漸上升趨勢。

圖 6 不同培養(yǎng)期小球藻Chl.a變化

圖 7 不同培養(yǎng)期小球藻Fv/Fm變化

圖 8 不同培養(yǎng)期小球藻ФPSⅡ變化

葉綠素a能反映水體中小球藻的生物量，模擬裝置運行過程中在間歇1期時，Chl.a均值（圖 6）為（6.600±2.335）μg/L，處于較低水平，該時期藻類處于適應新環(huán)境的調(diào)整期； 光合活性Fv/Fm和PSⅡ電子傳遞的實際量子產(chǎn)量ФPSⅡ較高，均值分別為（0.485±0.035）和（0.412±0.010），說明此時小球藻的光合能力較高，光能被吸收利用轉(zhuǎn)化為化學能的效率較高； 同時NPQ均值為（0.012±0.010），為模擬裝置運行期間最低值（圖 6），說明熱耗散較低，多余的激發(fā)能較少，絕大部分被吸收的光能都用于了光合作用。

圖 9 不同培養(yǎng)期小球藻NPQ變化

間歇2期，Chl.a均值為（31.500±06.450）μg/L，較間歇1時期有了較大的提高，表示小球藻在歷經(jīng)了短暫的調(diào)整期后，細胞大量繁殖迅速進入對數(shù)生長期； 隨著培養(yǎng)箱內(nèi)小球藻密度的增大，水體的透光性減弱，藻類受到光抑制現(xiàn)象，光系統(tǒng)II反應中心P680不能得到有效還原，供體側(cè)P680+累積，光系統(tǒng)II到光系統(tǒng)I的電子傳遞鏈受阻，ФPSⅡ均值為（0.299±0.098），較間歇1期降低； 隨著光合作用的降低，小球藻通過調(diào)節(jié)自身光保護機制，通過非光化學淬滅進行熱耗散，NPQ較高，在電子轉(zhuǎn)移和熱耗散的綜合作用下，光合活性Fv/Fm均值為（0.460± 0.030），也較間歇1期低。

間歇3期，外界培養(yǎng)液的濃度開始降低，小球藻同時消耗細胞內(nèi)源儲存營養(yǎng)物質(zhì)繼續(xù)分裂增殖，培養(yǎng)箱內(nèi)的營養(yǎng)物質(zhì)逐漸成為小球藻生長繁殖的限制因子，藻類達到穩(wěn)定期，Chl.a均值為（48.700± 3.716）μg/L，較間歇2期高，這段時期為對數(shù)生長后期至穩(wěn)定初期； 藻類發(fā)生光合作用時，電子經(jīng)過光系統(tǒng)II傳至光系統(tǒng)I，再傳遞給最終受體NADP+，當藻受到營養(yǎng)限制時，部分電子還會通過Mehler等［15］反應再次回到PSI，從而產(chǎn)生熱耗散，使得ФPSⅡ降低為（0.293±0.018）； 同時NPQ增加，均值為（0.026± 0.001）； 在電子轉(zhuǎn)移和熱耗散的綜合作用下，F(xiàn)v/Fm為（0.462±0.008），較間歇1期低，與間歇2期無顯著差異。

稀釋率為0.01/d期。此時的模擬裝置開始進行連續(xù)培養(yǎng)，新鮮的培養(yǎng)液以稀釋率0.01/d進入培養(yǎng)箱內(nèi)，小球藻生物量繼續(xù)累積，說明稀釋率小于藻類的生長速率，此時Chl.a均值為（64.700±0.256）μg/L，為5個階段最大值； Fv/Fm與ФPSⅡ均值分別為（0.479±0.0176）和（0.346±0.003），較間歇3期升高； 該時期藻類幾乎不受到光抑制現(xiàn)象，光能絕大部分用于光合作用，熱耗散較低，故NPQ均值較低，為（0.024±0.003）。

稀釋率為0.03/d期，培養(yǎng)液以0.03/d稀釋速度進入裝置，藻類開始被沖出培養(yǎng)箱，稀釋率大于藻類的生長速率，Chl.a均值較0.01/d有所降低，為（54.700±5.517）μg/L； 由于該時期藻類亦不受光抑制，光和活性Fv/Fm、ФPSⅡ與NPQ的均值分別為（0.473±0.009）、（0.326±0.039）和（0.023±0.002），較稀釋率0.01/d時期無顯著差異。

有室內(nèi)實驗探究環(huán)境變化對蛋白核小球藻和銅綠微囊藻光合作用的影響時，藻類的光合作用曲線趨勢與本實驗一致［16，17］，當藻類受到光照、溫度或營養(yǎng)鹽限制時，光系統(tǒng)II均會遭到破壞，光合反應活動中心類囊體膜上電子傳遞速率降低，導致實際量子產(chǎn)量ФPSⅡ也降低，同時細胞的ATP合成受阻，在光合作用下降的同時，藻類為了避免過多能量損傷細胞，會啟動自我保護機制，將過多的能量以熱耗散的形式降低，NPQ值增高。

2.3 模擬裝置內(nèi)小球藻細胞內(nèi)C、N、P的變化

C、N、P是藻類的主要組成元素。C是細胞的骨架元素，也是構成藻類細胞內(nèi)葉綠素a和碳水化合物的主要組成元素。不少國內(nèi)外學者研究表明［18，19］藻細胞內(nèi)C與葉綠素a之間存在顯著的正相關關系。N和P是生物體必須的基本元素，N的主要去處是合成藻類蛋白質(zhì)以及一系列參與催化作用的酶，P是核酸、生物膜和ATP等大分子物質(zhì)的重要組成成分，C、N、P對藻類的光合作用、呼吸作用和酶調(diào)節(jié)等方面均起重要作用。在小球藻培養(yǎng)過程中，模擬裝置內(nèi)小球藻細胞C、N、P的變化如表 2所示。

從表 2可以看出，模擬裝置運行過程中，細胞碳的吸收總體趨勢是上升的，這是由于隨著細胞的分裂增殖，Chl.a以及碳水化合物等大分子物質(zhì)合成需求較高，故而對C的需求也較高。

表 2 模擬裝置內(nèi)小球藻細胞內(nèi)C、N、P的變化Tab.2 Values of CellC，CellN，CellP of Chlorella during chemostat running

細胞N、P的變化趨勢與細胞C有一定的差異。Ketchum［20］在研究硅藻對水體中N、P營養(yǎng)物質(zhì)的吸收時發(fā)現(xiàn)藻細胞內(nèi)普遍存在“營養(yǎng)庫”，即在合適條件下可過量儲存某些營養(yǎng)元素，當環(huán)境中營養(yǎng)物濃度較低時，過量積累在藻細胞內(nèi)的營養(yǎng)物質(zhì)可以維持藻類繼續(xù)分裂增殖，緩解藻類種群數(shù)量因外界環(huán)境營養(yǎng)物的缺乏而產(chǎn)生較大動蕩。在本實驗中小球藻在饑餓培養(yǎng)后歷經(jīng)間歇1期的調(diào)整期，到間歇2期前對數(shù)增長期時，細胞內(nèi)N、P含量迅速升高，這是由于在此期間Chl.a含量較低，營養(yǎng)相對較為充分，藻細胞快速吸收并存儲過量的N、P。到了間歇3期，由于藻生物量的不斷增長，此時期的Chl.a均值為間歇培養(yǎng)期中最大值，水體中營養(yǎng)物的濃度不能充分維持小球藻生長，藻細胞的生長開始受到抑制，細胞內(nèi)N和P的含量，這時藻開始消耗細胞內(nèi)存儲的N、P，故該時期細胞內(nèi)N、P含量開始降低，此期間胞內(nèi)N、P含量達到最小值（圖10）。Janse等［21］研究表明藻類對N、P的吸收速率與細胞內(nèi)N、P累積量有關，細胞內(nèi)N、P含量越低，吸收速率越大。本文中稀釋率0.01/d期，模擬裝置開啟連續(xù)運行，新培養(yǎng)液的流入，營養(yǎng)鹽限制得到緩解，藻細胞又開始吸收儲存N、P營養(yǎng)物，細胞內(nèi)N、P含量較間歇3期大幅上升，但略低于間歇2期，Chl.a濃度也小幅度上升，達到5個時期的最大值。稀釋率0.03/d，Chl.a值最終維持在45 μg/L左右，藻內(nèi)N、P含量但與間歇3期，與稀釋率0.01/d期相差不大。

培養(yǎng)期間小球藻細胞內(nèi)CellN/CellP變化范圍在6—23。Klausmeier等［22］人指出藻類在營養(yǎng)鹽充裕條件下達到最大生長速率時細胞內(nèi)CellN/CellP為最優(yōu)N/P，當藻類受光照或營養(yǎng)鹽等限制時，該值下降。模擬裝置運行期間，間歇2期小球藻的生長速率達到最大值，該時期的N/P為小球藻在該生境下能達到的最優(yōu)氮磷比，為22.77； 間歇3期，此時的Chl.a濃度為間歇培養(yǎng)期中 最大值，藻類生長受到營養(yǎng)鹽限制時，細胞為了維持生長，開始消耗內(nèi)源氮磷營養(yǎng)物質(zhì)，而在營養(yǎng)鹽受限的條件下，胞內(nèi)N比P消耗快，CellN/CellP下降，這與國外許多研究的結果是一致的［23，24］。到了稀釋率0.01/d期，新培養(yǎng)液的流入，營養(yǎng)鹽得到了補充，藻細胞內(nèi)N/P比上升，Chl.a濃度小幅度上升。0.03/d期是chla濃度略低于0.01/d期，N/P比與0.01/d期相差不大 ，遠高于間歇3期。

圖 10 培養(yǎng)期間CellN/CellP變化

綜上可以發(fā)現(xiàn)，在藻生物量積累過程中，Chl.a濃度不斷增大，水體中營養(yǎng)鹽的含量逐漸降低，以至不能充分維持藻細胞的增長，藻會開始通過消耗內(nèi)源存儲的營養(yǎng)鹽來維持期生長繁殖，此時藻類細胞內(nèi)N、P含量和N/P比迅速降低。然而，細胞內(nèi)源物質(zhì)也消耗殆盡時，在沒有外源營養(yǎng)鹽加入的情況下持續(xù)一段時間，藻細胞生長進入衰亡期。也就是說，在藻類快要進入負增長期前，細胞內(nèi)N、P含量和N/P持續(xù)下降，在降到某一個值時，我們把這個值處稱為拐點，營養(yǎng)鹽嚴重的限制了藻的生長，藻細胞生長進入衰亡期。

野外藻類水華的形成是由適宜的光照、溫度以及水體中充裕的營養(yǎng)鹽等原因造成，隨著藻類大量生長繁殖，水體中營養(yǎng)鹽的含量逐漸降低，當藻類細胞內(nèi)氮磷等營養(yǎng)元素開始降低時，說明此時水體的營養(yǎng)鹽含量已經(jīng)無法維持藻類的生長，藻類需通過消耗細胞內(nèi)儲存的內(nèi)源營養(yǎng)物質(zhì)維持其生長繁殖，當細胞內(nèi)源物質(zhì)也消耗殆盡時，水體水華開始消退。因此監(jiān)控藻類生物量富集過程中細胞內(nèi)氮磷下降的“拐點”和細胞內(nèi)元素比例變化可為預測水華消退的提供一定的參考依據(jù)。

3 結論

（1）調(diào)整期，藻生長不受生境光熱、營養(yǎng)鹽限制，小球藻光合活性較強； 對數(shù)生長前期，藻類開始受到光抑制現(xiàn)象，光合活性下降，熱耗散增加，同時藻進行胞內(nèi)N、P儲存，胞內(nèi)N、P、N/P較高； 對數(shù)生長后期和穩(wěn)定期，水體中營養(yǎng)鹽不足以維持藻生長，藻開始消耗胞內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)，N、P、N/P均下降，藻同時受光抑制和營養(yǎng)鹽抑制； 連續(xù)培養(yǎng)期時，稀釋率為0.01/d時細胞豐度最大，營養(yǎng)鹽限制得到緩解，小球藻光合活性又開始升高，同時藻細胞對N、P營養(yǎng)物吸收能力增強。（2）在小球藻生物量積累過程中，生境資源隨著生物量的增大而不斷減少，當光熱或營養(yǎng)物條件受限時，藻類光合活性下降，細胞內(nèi)N、P含量亦協(xié)同發(fā)生變化。因此，監(jiān)控藻類生物量積累過程中氮磷下降的“拐點”和細胞內(nèi)元素比例變化可為預測水華消退提供一定的參考依據(jù)。（3）為進一步探索水華的形成、消退和維持機制，可多選取藻種，通過模擬裝置設置不同的生境梯度進行藻生物量積累的過程模擬。

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PRELIMINARY RESEARCH ON CULTIVATED SIMULATION OF CHLORELLA UNDER AXENIC CULTURE

WANG Shu1，XIAO Yan2，3，LI Zhe2，3，ZHANG Li-Ping1and GUO Jin-Song2，3
（1.Faculty of Urban Construction and Environmental Engineering，Chongqing University，Chongqing 400044，China； 2.Chongqing Institute of Green and Intelligent Technology，Chinese Academy of Sciences，Chongqing 400714，China； 3.State Key Laboratory of Water Resources and Hydropower Engineering Science，Chongqing 400714，China）

Abstract:The current study explored physiological characteristics of Chlorella cultivated under axenic culture in the designed simulator with a set of optimized parameters，including light intensity，temperature and nutrient concentrations，by mainly measuring intracellular contents of C，N，P and photosynthesis fluorescent parameters.The experiment employed the “Batch culture+ Continuous culture” cultivated mode to simulate the formation of algal bloom，and the cultivation period was divided into five phases according to the growth curve.Results showed that Chlorella had highly photosynthetic activity，and the growth was not inhibited by light intensity，temperature and nutrient concentration during adjustment phase.While in exponential phase，the growth of Chlorella was inhibited by light intensity，and heat dissipation was enhanced and intracellular contents of C，N and C/N ratio were high.At stable period，Chlorella was simultaneously inhibited by light intensity and nutrient concentration，and intracellular contents of N，P and N/P ration decreased.In continuous culture phase，when nutrient limitation was mitigated，both photosynthetic activity and the nutrient absorption ability of Chlorella were enhanced.This implied that monitoring the “turning point” of intracellular nutrients and changes in intracellular element ratio provided a reference basis on the study of the formation，persistence and fade of algal bloom.

Key words:Algal bloom； Biomass accumulation； Chlorella； Physiological characteristics

中圖分類號：Q94-331

文獻標識碼：A

文章編號：1000-3207（2016）03-0580-09

doi:10.7541/2016.78

收稿日期：2015-07-10；

修訂日期：2015-12-11

基金項目：國家自然科學基金項目（51309220）； 重慶市基礎科學和前沿技術研究專項重點項目（cstc2015jcyjBX0006）資助［Supported by the National Natural Science Foundation of China（No:51309220）； the Chongqing Natural Science Program（cstc2015jcyjBX0006）］

作者簡介：王舒（1990—），女，廣西桂林人； 碩士研究生； 主要研究方向為藻類學。E-mail:Wangshu2008Y@hotmail.com

通信作者：肖艷，E-mail:yxiao@cigit.ac.cn