孫璐明于孟君陳亞東陳學杰劉 洋仇雪梅沙珍霞（.大連海洋大學水產(chǎn)與生命學院，大連 6023； 2.中國水產(chǎn)科學研究院黃海水產(chǎn)研究所農(nóng)業(yè)部海洋漁業(yè)可持續(xù)發(fā)展重點實驗室，青島 26607； 3.青島海洋科學與技術(shù)國家實驗室海洋漁業(yè)科學與食物產(chǎn)出過程功能實驗室，青島 266200； 4.上海海洋大學水產(chǎn)與生命學院，上海 20306）

半滑舌鰨AKT-ineracting protein基因的克隆及免疫應(yīng)答表達分析

孫璐明1，2于孟君1，2陳亞東2，3陳學杰2，4劉 洋1仇雪梅1沙珍霞2，3
（1.大連海洋大學水產(chǎn)與生命學院，大連 116023； 2.中國水產(chǎn)科學研究院黃海水產(chǎn)研究所農(nóng)業(yè)部海洋漁業(yè)可持續(xù)發(fā)展重點實驗室，青島 266071； 3.青島海洋科學與技術(shù)國家實驗室海洋漁業(yè)科學與食物產(chǎn)出過程功能實驗室，青島 266200； 4.上海海洋大學水產(chǎn)與生命學院，上海 201306）

摘要：研究克隆了半滑舌鰨Cynoglossus semilaevis膜蛋白AKT-interacting protein（AKTIP）基因，研究了其在健康組織中的表達模式、鰻弧菌（Vibrio anguillarum）感染后免疫組織和不同病原物刺激外周血淋巴細胞中的表達特征。通過常規(guī)克隆和RACE技術(shù)，獲得的半滑舌鰨AKTIP基因全長cDNA序列為1224 bp，其中包括5′-UTR為116 bp，3′-UTR為117 bp和完整的ORF序列891 bp，編碼296個氨基酸，預測蛋白質(zhì)的等電點（PI）為9.12，分子量是33.74 kD； 同源比對發(fā)現(xiàn)半滑舌鰨AKTIP的氨基酸序列在不同物種之間具有較高的保守性； 熒光實時定量PCR（qRT-PCR）檢測到半滑舌鰨各個組織中均有AKTIP基因的表達，在卵巢中表達量最高； 鰻弧菌感染半滑舌鰨后，AKTIP基因在肝、鰓、血液、腸、頭腎和脾中均上調(diào)表達； 病原模擬物PGN、LPS、poly I:C和WGP刺激半滑舌鰨外周血淋巴細胞均誘導AKTIP基因下調(diào)表達。研究表明半滑舌鰨AKTIP基因參與了機體免疫反應(yīng)，為給半滑舌鰨免疫防御技術(shù)的研究提供理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：半滑舌鰨； AKT-interacting protein基因； 基因克??； 免疫應(yīng)答； 基因表達

AKT-interacting protien（AKTIP），又稱蛋白激酶B相互作用蛋白，是PI3K（磷酸肌醇3-激酶）/ PDK1（3-磷酸肌醇依賴性蛋白激酶）/ Akt信號通路中第一個被發(fā)現(xiàn)的支架蛋白［1，2］，參與PI3K/PDK1/ Akt信號通路的調(diào)控，是介導Akt與其上游激酶PDK1相互作用的橋梁［3，4］，在動物細胞信號轉(zhuǎn)導中具有重要的作用，并參與許多生物學過程，如胚胎發(fā)育、細胞的增殖、分化、凋亡、免疫防御等［5］。有文獻報道AKTIP也可以通過活化NF-kB 參與免疫調(diào)節(jié)［6］。到目前為止，僅有數(shù)篇關(guān)于AKTIP的研究文獻，大多集中在哺乳動物和人中，但對AKTIP免疫方面的研究還不透徹，在魚類中至今沒有關(guān)于AKTIP的任何報道。

半滑舌鰨（Cynoglossus semilaevis）是我國重要的海水養(yǎng)殖魚類，病害問題特別是弧菌病對半滑舌鰨養(yǎng)殖業(yè)造成嚴重的經(jīng)濟損失［7］。對半滑舌鰨免疫機制的研究有助于病害問題的解決。本研究擬對AKTIP基因的鑒定、表達及在免疫反應(yīng)中的應(yīng)答模式進行分析，以期為半滑舌鰨病害防御提供理論參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

半滑舌鰨購自日照東鑫現(xiàn)代漁業(yè)技術(shù)研究所，魚為1.5齡左右，平均體重220 g，平均體長30.6 cm。實驗前將魚在24℃水箱中暫養(yǎng)7d，消除環(huán)境脅迫。鰻弧菌（Vibrio anguillarum）由本實驗室保存，外周血淋巴細胞由本實驗室分離獲得。

1.2 樣品采集

取3條健康半滑舌鰨進行健康組織收集，分別采集后腎、腦、胃、脾、頭腎、心臟、鰓、血、肌肉、皮膚、肝、腸、卵巢13種組織，立即投入液氮中冷凍，然后轉(zhuǎn)移至-80℃分別保存，以備RNA提取。

鰻弧菌感染方法參照Sha等［8］略作修改:設(shè)實驗組和對照組，實驗組用3.18×105CFU/g（半致死劑量，LD50）對半滑舌鰨進行腹腔注射，對照組參照實驗組注射與體重相應(yīng)劑量的PBS注射。在注射后0、6h、12h、24h、48h和72h各取3尾魚，取鰓、肝、腸、頭腎、脾、血液6種免疫組織，并立即投入液氮中，隨后將其轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱中分別保存，用于提取總RNA。

分別用病原模擬物脂多糖（LPS）、肽聚糖（PGN）、多聚胞甘酸（poly I:C）和葡聚糖（WGP）刺激6孔細胞培養(yǎng)板中接種的半滑舌鰨外周血淋巴細胞，使終濃度分別為50、100、50和50 μg/mL，PBS組設(shè)為對照組，每個實驗重復3次。感染30min后收集細胞懸液，1000 r/min離心5min去除包含感染源的培養(yǎng)基，用Hank's緩沖液反復洗滌細胞，繼續(xù)用新鮮DMEM培養(yǎng)基重懸細胞進行培養(yǎng)。分別收集感染0、2h、6h、12h和24h后的淋巴細胞到相應(yīng)的離心管中。離心后倒掉培養(yǎng)基并加入1 mL Trizol試劑（Invitrogen，美國），然后儲存在-80℃冰箱中，以備提取總RNA。

1.3 總RNA提取及cDNA的合成

使用試劑盒（Tiangen，中國）提取半滑舌鰨不同組織樣本的總RNA。提取方法參照試劑盒說明書。體外培養(yǎng)的外周血淋巴細胞RNA提取采用Trizol試劑提取。總RNA使用Agilent 2100生物分析儀（Applied Biosystems，美國）檢測其質(zhì)量和濃度，RNA的完整性用瓊脂糖凝膠電泳法檢測。按照PrimeScriptTM RT reagent Kit（Perfect Real Time）（TaKaRa，大連）試劑盒合成cDNA，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 半滑舌鰨AKTIP基因cDNA序列的獲得

通過對半滑舌鰨轉(zhuǎn)錄組和基因組數(shù)據(jù)進行生物信息學分析，篩選了AKTIP基因部分cDNA序列，并對該序列設(shè)計了兩對特異性引物P1、P2和P3、P4（表 1），以半滑舌鰨總cDNA為模板，進行PCR擴增，擴增產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，純化連接轉(zhuǎn)化后，對產(chǎn)生的陽性克隆進行測序。在克隆獲得的序列3′端設(shè)計RACE（Rapid-Amplification of cDNA Ends）引物P5（表1）和巢式特異性引物P6（表1），使用Clontech公司的SMARTTerTMRACE cDNA Amplification Kit 試劑盒獲得該基因的3′端序列，將克隆的序列進行拼接獲得AKTIP基因的cDNA全長序列。

1.5 生物信息學分析

對克隆獲得的cDNA進行BLASTX（http:// www.ncbi.nlm.nih.gov）比對，利用ORF Finder軟件（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html）預測該基因的ORF，利用Expasy軟件（http://www.expasy.org/）預測其氨基酸序列，蛋白的理化特性預測使用Protparam（http://au.expasy.org/tools/protparam.html），采用Clustal X軟件對不同物種AKTIP 基因推導的氨基酸序列進行多序列比對分析，利用MEGA 5.1構(gòu)建進化樹。

1.6 半滑舌鰨AKTIP基因?qū)崟r定量分析

表 1 PCR擴增所用的特異性引物Tab.1 Specific primers used in this study

采用實時定量PCR方法檢測AKTIP基因的表達特征?；贏KTIP保守區(qū)設(shè)計定量特異引物P7、P8（表 1），用半滑舌鰨18S rRNA基因作為內(nèi)參（表1）。在ABI PRISM 7500實時定量擴增儀上進行PCR反應(yīng)，每個樣品設(shè)置3個生物學重復。健康組織中是相對肝組織做的相對定量分析，采用2-△△Ct法計算，Ct值取3個平行的平均值。使用SPSS 17.0軟件對實時定量PCR檢測結(jié)果的數(shù)據(jù)進行單因素方差分析和Duncan多重比較統(tǒng)計分析，P<0.05為顯著差異。

2 結(jié)果

2.1 半滑舌鰨AKTIP基因克隆及其序列特征

半滑舌鰨AKTIP基因經(jīng)過幾輪PCR擴增獲得，將兩對特異性引物P1、P2和P3、P4擴增克隆出的兩段序列和RACE獲得的序列經(jīng)過拼接，獲得AKTIP基因完整的cDNA序列，全長為1224 bp，其中包含5′-UTR為116 bp，3′-UTR為117 bp和完整的開放閱讀框（ORF）序列891 bp，GC含量是47.7%，共編碼296個氨基酸。預測的AKTIP蛋白質(zhì)等電點（PI）為9.12，分子量是33.74 kD。

2.2 半滑舌鰨AKTIP系統(tǒng)進化分析

通過BLAST比對，發(fā)現(xiàn)半滑舌鰨AKTIP氨基酸序列與大西洋鮭（Salmo salar）（NP_00113339 4.1）、斑馬魚（Danio rerio）（NP_956399.1）、非洲爪蟾（Xenopus laevis）（NP_001086693.1）、紅原雞（Gallus gallus）（NP_001005838.1）、美洲鷲（Cathartes aura）（KFP53204.1）、大鼠（Rattus norvegicus）（NP_001011926.1）、小鼠（Mus musculus）（NP_00 1289197.1）、恒河猴（Macaca mulatta）（AFJ71 159.1）、人（Homo sapiens）（NP_001012398.1）的 AKTIP氨基酸序列相似性分別為89%、88%、77%、77%、77%、76%、76%、76%和75%。利用MEGA5.1軟件對上述各個物種的AKTIP氨基酸序列進行比對構(gòu)建了系統(tǒng)進化樹（圖 1）。結(jié)果表明，AKTIP被分為兩個大的分支，半滑舌鰨與大西洋鮭（NP_001133394.1）、斑馬魚（NP_956399.1）AKTIP聚為一支，兩棲類非洲爪蟾（NP_001086693.1）與紅原雞（NP_001005838.1）、大鼠（NP_0010 11926.1）和人（NP_001012398.1）等的AKTIP聚為一支，但哺乳動物、鳥類和兩棲類又按親緣關(guān)系遠近都聚成相應(yīng)的亞類。

2.3 AKTIP基因在半滑舌鰨健康組織表達特異性分析

采用實時定量PCR方法分析了AKTIP基因在半滑舌鰨不同健康組織中的表達特征（圖 2）。結(jié)果顯示:AKTIP基因在健康半滑舌鰨的后腎、腦、胃、脾、頭腎、心臟、鰓、血、肌肉、皮膚、肝、腸、卵巢組織中均有表達，表達量由低到高，AKTIP的相對表達量在卵巢組織（17.01）中最高，其次是腸（1.24）和肝（1.02），在后腎和腦中的表達量低（后腎0.21、腦0.24）。AKTIP在不同組織中表達存在組織差異性。

2.4 AKTIP在半滑舌鰨感染鰻弧菌后免疫組織中的表達特征

圖 1 AKTIP基因家族氨基酸序列的系統(tǒng)進化樹

鰻弧菌感染半滑舌鰨后可誘導AKTIP在免疫組織中的表達變化，在PBS對照組和感染組感染0、6h、12h、24h、48h、72h后，AKTIP在肝臟、腸、頭腎、脾臟、血液和鰓6種組織中的表達水平如圖 3所示。AKTIP在腸中的表達量為6h最低，隨后迅速升高，48h是0的1.5倍，總體趨勢為先降低又升高再降低； 在脾中表達峰值出現(xiàn)在鰻弧菌感染后48h，是初始表達量的1.77倍，其總體表達趨勢為隨著感染時間表達量先降低又升高隨后下降； 在鰓中的表達變化是6h降到最低，然后一直升高，72h達到最高，其表達量是初始值的2.77倍； 在血中表達量是隨著感染時間表達量表現(xiàn)為先下降后升高，在24h出現(xiàn)最高值，是0表達量的1.3倍，然后又降低；在頭腎中也是隨著感染時間延長表達量先降低后升高，12h表達極低然后迅速升高，在24h出現(xiàn)峰值后又降低，24h表達量是初始值的2.24倍； 肝中AKTIP在12h的表達量極低，最后在72h達到峰值，其表達量是初始表達量的5.33倍。以上數(shù)據(jù)表明，鰻弧菌感染半滑舌鰨后，可誘導AKTIP在腸、脾、血、鰓、肝臟和頭腎中表達上調(diào)。

圖 2 AKTIP基因在半滑舌鰨健康組織中的實時定量表達

2.5 AKTIP在半滑舌鰨外周血淋巴細胞中的表達

病原模擬物LPS、poly I:C、PGN、WGP分別刺激半滑舌鰨外周血淋巴細胞后，AKTIP基因的實時定量表達結(jié)果如圖 4所示，LPS對其誘導的表達趨勢為:先是持續(xù)下降，在12h稍有升高，然后再下降，24h的表達量是0 的0.28倍； 在PGN的誘導下表現(xiàn)2h先降低，其表達量是0的0.71倍，然后有緩慢升高，但總體是下降趨勢； Poly I:C的誘導表達表現(xiàn)為先略有升高，2h的表達量與0相當，然后持續(xù)下降，24h 的表達量是0的0.40倍； WGP的誘導表達趨勢為:先降低，從6h后趨于平緩，6h的表達量是0的0.59倍?？傮w上，四種病原模擬物LPS、poly I:C、PGN、WGP對AKTIP在半滑舌鰨淋巴細胞中的誘導表達趨勢非常相似，都呈下調(diào)表達。

3 討論

AKTIP是PI3K/PDK1/Akt信號通路的支架蛋白，AKTIP可直接或通過與PDK1的相互作用間接作用于蛋白激酶B（PKB/Akt），通過增強Akt的磷酸化調(diào)節(jié)Akt的活性，從而參與PI3K/PDK1/Akt信號通路的調(diào)控［4］，AKTIP作為Akt活性的調(diào)控蛋白，在PI3K/PDK1/Akt信號通路的調(diào)控中起關(guān)鍵性作用；有研究表明AKTIP也參與動物的多種免疫防御過程［5］，通過磷酸化Akt活化IkB激酶（IKKα），使NF-κB從細胞質(zhì)中釋放出來進入細胞核內(nèi)，實現(xiàn)對下游基因的調(diào)控，從而參與調(diào)節(jié)大量關(guān)鍵的生理過程，如細胞增殖［9］、凋亡［10］、固有免疫和適應(yīng)性免疫［11，12］?？梢夾KTIP通過調(diào)節(jié)Akt活性參與免疫防御等多種生物學過程。但是到目前為止，AKTIP的確切作用機制還沒有被闡明。

本研究首先克隆獲得半滑舌鰨AKTIP的cDNA全長，并利用實時定量PCR檢測AKTIP在半滑舌鰨健康組織、感染后的各個組織和感染后淋巴細胞中的表達譜，以期為探討AKTIP在半滑舌鰨機體中的免疫機制提供理論依據(jù)。研究結(jié)果表明AKTIP在半滑舌鰨各個健康組織中均有表達，在卵巢中的表達最高，在肝和腸中的表達相對其他組織也較高，推測其可能在免疫調(diào)控以及免疫細胞的發(fā)育中發(fā)揮及其重要的作用。鰻弧菌感染半滑舌鰨72h內(nèi)，AKTIP在肝、腸、鰓、頭腎、血和脾組織中均出現(xiàn)上調(diào)表達的情況，說明AKTIP在病原入侵后參與了機體的免疫應(yīng)答，半滑舌鰨被鰻弧菌感染后為了維持細胞活性，可能大量合成AKTIP基因抵抗細胞凋亡； 或者磷酸化Akt激活NF-κB的信號轉(zhuǎn)導途徑，參與免疫反應(yīng)和炎癥反應(yīng)各階段許多分子的調(diào)控［13］，這與Nakamura 等［14］研究結(jié)果相一致；LPS、PGN、poly I:C和WGP感染半滑舌鰨外周血淋巴細胞均誘導AKTIP下調(diào)表達，但PGN刺激后，AKTIP基因的變化幅度不大，poly I:C和WGP刺激引起的變化相當，LPS誘導AKTIP基因表達變化倍數(shù)最大，說明外周血淋巴細胞AKTIP基因?qū)Σ煌拿庖咛娲锏拿庖邞?yīng)答具有特異性。

圖 3 鰻弧菌感染半滑舌鰨后AKTIP在腸、脾、血、鰓、頭腎和肝臟不同免疫組織不同時間點的相對表達水平

AKTIP在半滑舌鰨各個組織均有表達，病原以及革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌和真菌等模擬物刺激后，其在免疫組織和免疫細胞中均出現(xiàn)差異表達，說明AKTIP在半滑舌鰨機體免疫中具有一定的重要作用。綜上所述，AKTIP參與了病原感染半滑舌鰨后機體免疫相關(guān)基因的調(diào)節(jié)，本研究為探討AKTIP在半滑舌鰨機體內(nèi)重要的免疫作用機制奠定了理論基礎(chǔ)。但總體來說在病原和模擬物處理后AKTIP基因的表達變化并不是很顯著，推測AKTIP基因在半滑舌鰨中只是間接參與了免疫應(yīng)答反應(yīng)，其在免疫中的作用機制有待進一步探討研究。

圖 4 AKTIP在PGN、LPS、poly I:C和WGP刺激半滑舌鰨淋巴細胞中的表達

參 考 文 獻：

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AKT-INTERACTING PROTEIN GENE CLONING AND ITS EXPRESSION PROFILE IN RESPONSE TO PATHOGEN INFECTION IN HALF SMOOTH TONGUE SOLE（CYNOGLOSSUS SEMILAEVIS）

SUN Lu-Ming1，2，YU Meng-Jun1，2，CHEN Ya-Dong2，3，CHEN Xue-Jie2，4，LIU Yang1，QIU Xue-Mei1and SHA Zhen-Xia2，3
（1.College of Fishers and Life Sciences，Dalian Ocean University，Dalian 116023，China； 2.Key Laboratory for Sustainable Development of Marine Fisheries，Ministry of Agriculture，Yellow Sea Fisheries Research Institute，Chinese Academy of Fishery Sciences，Qingdao 266071，China； 3.Laboratory for Marine Fisheries and Aquaculture，Qingdao National Laboratory for Marine Science and Technology，Qingdao 266200，China； 4.College of Fishers and Life Sciences，Shanghai Ocean University，Shanghai 201306，China）

Abstract:AKT-interacting protien（AKTIP）is a kind of membrane protein，involvimg in the regulation of PI3K/PDK1/Akt pathway.AKTIP gene is still unknown in fish.In the present study，AKTIP gene of Cynoglossus semilaevis was first cloned and full length of cDNA was 1224 bp in size，including 5′-untranslated region（UTR）of 116 bp，3′-UTR of 117 bp and a complete open reading frame（ORF）of 891 bp，encoding 296 amino acids.Theoretical isoelectric point（PI）of predicted protein was 9.12 and molecular weight was 33.74 kD.Homologous comparison showed that the amino acids sequence of AKTIP in C.semilaevis had a high identity with those of other species.The AKTIP gene was expressed in all tested tissues in the health C.semilaevis and the highest expression was in the ovary.In order to investigate the expression patterns of the AKTIP gene in immune response，the specific expression of AKTIP was performed after Vibrio anguillarum infection and in peripheral blood lymphocytes with different pathogens stimulated.The results showed that the expression of AKTIP gene was up-regulated in the liver，gill，blood，intestinal，head kidney and spleen after V.anguillarum infection.While the AKTIP gene expression in peripheral blood lymphocytes was down-regulated after PGN，LPS，WGP and poly I:C stimulation.The research revealed that AKTIP gene involved in C.semilaevis immune response.These results provide the evidence to explore AKTIP defense mechanism and to control C.semilaevis disease in the further study.

Key words:Cynoglossus semilaevis； AKT-interacting protein； Gene clone； Immune response； Gene expression

中圖分類號：Q522

文獻標識碼：A

文章編號：1000-3207（2016）03-0467-07

doi:10.7541/2016.62

收稿日期：2015-09-17；

修訂日期：2016-01-19

基金項目：國家“863”高技術(shù)研究發(fā)展計劃（2012AA10A401-4）； 國家自然科學基金（31172439）資助［Supported by the National High Technology Research and Development Program of China（863 Program）（2012AA10A401-4）； the National Natural Science Foundation of China（31172439）］

作者簡介：孫璐明（1990—），女，山東臨沂人； 碩士研究生； 主要從事生物化學與分子生物學研究。E-mail:sunluming9966@163.com

通信作者：沙珍霞，女，研究員； 主要從事魚類分子免疫學、基因組學和細胞生物學研究。E-mail:shazx@ysfri.ac.cn