張德福，戴建軍，吳彩鳳，張樹山

（上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所；上海市農(nóng)業(yè)遺傳育種重點(diǎn)實驗室/動物遺傳工程研究室，上海201106）

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體細(xì)胞克隆技術(shù)及其存在的問題

張德福，戴建軍，吳彩鳳，張樹山

（上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所；上海市農(nóng)業(yè)遺傳育種重點(diǎn)實驗室/動物遺傳工程研究室，上海201106）

摘 要：闡述了體細(xì)胞克隆技術(shù)在生命科學(xué)和畜牧業(yè)中應(yīng)用的重大價值，該技術(shù)是當(dāng)今生物技術(shù)中最重要的研究領(lǐng)域之一，但還存在著一些問題；詳細(xì)分析、討論了目前克隆技術(shù)存在的問題。

關(guān)鍵詞：克隆技術(shù)；生命科學(xué)；畜牧業(yè)；問題

動物克隆技術(shù)的研究和應(yīng)用是當(dāng)代生命科學(xué)與生物技術(shù)研究的熱點(diǎn)之一，是衡量一個國家生命科學(xué)科研水平的重要標(biāo)志。自首例體細(xì)胞克隆羊誕生以來，克隆技術(shù)以其無可比擬的優(yōu)勢在畜牧業(yè)生產(chǎn)、醫(yī)藥學(xué)研究、再生醫(yī)學(xué)及基礎(chǔ)生物學(xué)研究中發(fā)揮著巨大的作用，具有廣闊的應(yīng)用前景。

自1998年起本實驗室在豬體細(xì)胞克隆技術(shù)上進(jìn)行了深入研究，特別是在利用克隆技術(shù)保存地方豬種種質(zhì)資源及生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因豬方面取得了一批研究成果［1-5］，也對克隆技術(shù)的應(yīng)用前景進(jìn)行了大量的介紹［6-8］；在此過程中也發(fā)現(xiàn)克隆技術(shù)依然存在著一些亟待解決的問題［9-13］。結(jié)合近二十年來本研究團(tuán)隊的相關(guān)研究結(jié)果，本文對目前克隆技術(shù)存在的問題進(jìn)行分析探討，以期為該技術(shù)的進(jìn)一步健康發(fā)展提供借鑒。

1　克隆效率低

克隆技術(shù)目前存在的最大問題是克隆效率低。所謂克隆效率通常是指克隆胚胎（或稱重構(gòu)胚胎）經(jīng)胚胎移植到受體（即代孕母體）后獲得的克隆動物個體比例。有學(xué)者詳細(xì)統(tǒng)計分析了牛、山羊、綿羊和小鼠的克隆效率，牛的克隆效率相對較高為10%—20%，山羊為3%—5%，綿羊為3%—10%，豬為0.5%—3%，小鼠為4%—5%［14］?？寺游锍３３霈F(xiàn)所謂的“三高”，即克隆胎兒流產(chǎn)率高、圍產(chǎn)期死亡率高、新生動物死亡率高，是導(dǎo)致體細(xì)胞克隆效率低下的主要原因。HILL等［15］克隆了13頭牛，4頭于胎兒期流產(chǎn)，3頭于出生時或出生后死亡；WELLS等［16］將988枚克隆胚胎移植到受體后，有133頭克隆牛出生，出生1 d后死亡率高達(dá)21.8%，3月齡內(nèi)死亡率為14.4%，只有63.8%的犢牛存活超過3個月。本實驗室在克隆豬上的研究表明，大部分克隆豬胎兒在妊娠2個月前后發(fā)生流產(chǎn)［9］。

可以看出，從克隆胚胎到克隆胎兒直至克隆新生動物各個階段的發(fā)育都不同程度地受到影響，使克隆效率十分低下，加上克隆動物的生產(chǎn)成本非常昂貴，使克隆技術(shù)的推廣應(yīng)用受到了極大的影響。

2　克隆動物胚胎、胎兒發(fā)育異常

2.1克隆動物胚胎發(fā)育異常

牛克隆胚胎移植后，在妊娠的前3個月內(nèi)，胎兒死亡及流產(chǎn)的比例很高。與體內(nèi)/體外受精胚胎相比，大量的克隆胚胎不能正常發(fā)育。早期胚胎損失發(fā)生的原因較多，如胎兒畸形或胎盤發(fā)育不正常、母體子宮或激素環(huán)境異常、胎兒-母體相互排斥等。有研究者［17］對牛體細(xì)胞克隆胚胎的發(fā)育異常進(jìn)行了較為系統(tǒng)的研究，將牛異常后代綜合癥（AOS，abnormal offspring syndrome）分為4類（表1）。

表1　牛異常后代綜合癥分類Table 1 Category of bovine abnormal offspring syndrome

2.2克隆動物胎兒的巨胎癥

當(dāng)體細(xì)胞克隆胚胎的細(xì)胞核重構(gòu)或重編程不完全時，就會引起基因表達(dá)的異常，從而導(dǎo)致胎盤和胎兒的發(fā)育異常，造成的后果通常是形成巨胎癥（LOS，large offspring syndrome）［18］。在妊娠期，巨胎癥的明顯特征是尿囊增大、乳腺發(fā)育缺失和妊娠期延長等。在出生時，典型的特征是體重特別大、器官大小異常、喪失運(yùn)動神經(jīng)調(diào)節(jié)、大舌頭等。巨胎癥在克隆牛上最為突出，在克隆羊、克隆小鼠中也普遍存在；但在克隆豬上，迄今尚未發(fā)現(xiàn)有此癥狀。

2.3克隆動物胎兒胎盤發(fā)育異常

一般克隆胚胎有30%—50%可以發(fā)育到囊胚期，與體外受精的胚胎沒有太大的差異（30%—40%）。但大部分克隆胚胎在附植后停止發(fā)育，能夠發(fā)育到出生的克隆胚胎僅有1%—5%，遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于體外受精胚胎（30%—60%）［19］。

胎盤發(fā)育異常與克隆胎兒妊娠過程中死亡密切相關(guān)。胎盤是哺乳動物胚胎發(fā)生過程中特有的器官，是母體與胎兒氣體、營養(yǎng)及代謝廢物交換的主要場所；此外胎盤也分泌一些與妊娠相關(guān)的激素、生長因子以及胎兒免疫蛋白等?？寺游锍３３霈F(xiàn)胎盤肥大現(xiàn)象，但可用于母體和胎兒進(jìn)行物質(zhì)交換的部位卻有所減少，致使胎盤功能無法正常發(fā)揮。

胎盤發(fā)育異常是目前克隆動物普遍存在的問題。在克隆小鼠、牛、羊和豬中均有克隆胎兒胎盤發(fā)育異常的報道?？寺∨Ｖ校ケP發(fā)育異常多發(fā)生在胎盤小體上。研究顯示，克隆牛胎兒從30 d到90 d的發(fā)育過程中，胎盤的血管發(fā)育和胎盤子葉數(shù)目都有所減少，一些胎盤含有異常的絨毛上皮和血管化程度低的尿囊。上述胎盤發(fā)育的缺陷是導(dǎo)致克隆牛早期胎兒流產(chǎn)的重要原因［20］。也有研究顯示，克隆牛胎兒胎盤的異常發(fā)育還會引起MHC的異常表達(dá)從而引起母體對克隆胎兒的排斥，大大增加流產(chǎn)率［21］。

3　克隆動物的發(fā)育缺陷

克隆動物死亡率較高，以克隆牛為例，有些新生克隆牛犢初期看似挺健康，但到青年或成年后出現(xiàn)異常。

李世杰等［22］在新生死亡的9頭克隆牛中均發(fā)現(xiàn)器官發(fā)育異常，包括心臟肥大、右心室增大、卵圓孔閉合不全以及瓣膜發(fā)育不全等；肝發(fā)育異常主要表現(xiàn)為肝腫大和充血；肺發(fā)育異常主要表現(xiàn)為出生時肺未充起以及肺形態(tài)發(fā)育異常。徐金霞等［23］也發(fā)現(xiàn)1例死亡克隆牛腦和免疫器官組織異常。另外，由于免疫力和抗體水平低，也增加了克隆動物感染和發(fā)病的可能性，因此新生克隆牛易患腸炎、臍帶感染和呼吸道感染。

RENARD等［24］以耳成纖維細(xì)胞為供體獲得克隆牛，出生1.5個月后死于貧血，尸體解剖發(fā)現(xiàn)脾臟、胸腺和淋巴結(jié)等淋巴組織都沒有得到正常發(fā)育。本實驗室［9］對新生死亡克隆豬的5種組織進(jìn)行詳細(xì)的組織病理學(xué)觀察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：克隆豬肺臟表現(xiàn)為典型的肺不張，肺泡壁有明顯充血；肝臟的肝細(xì)胞形態(tài)異常，肝索紊亂，無典型肝小葉結(jié)構(gòu)；腎臟的腎小球處于不同發(fā)育階段，腎小管管腔尚未形成，僅有腎小管輪廓；另外在獲得的克隆豬中也發(fā)現(xiàn)個別公豬出現(xiàn)隱睪癥狀。

4　克隆效率低下的原因分析

在體細(xì)胞克隆中，供體核來自于高度分化的體細(xì)胞。在分化過程中，體細(xì)胞核獲得了高度特異的DNA和染色質(zhì)的表觀遺傳修飾（epigenetic modification），導(dǎo)致了分化狀態(tài)的細(xì)胞記憶。由于供體核支持克隆胚胎的發(fā)育，因此當(dāng)供體細(xì)胞核放至去核的卵母細(xì)胞后，供體核必須經(jīng)過表觀遺傳修飾的重編程（reprogramming），激活對胚胎早期發(fā)育有重要作用的基因，并抑制與分化相關(guān)基因的表達(dá)，從而獲得發(fā)育的全能性［25］。目前認(rèn)為，供體核的不完全編程導(dǎo)致在發(fā)育過程中有重要的基因沒有表達(dá)或異常表達(dá)，是克隆效率低的主要原因［26］。

為探求新生克隆豬可能的死亡原因以及是否存在不完全的DNA甲基化重編程，本實驗室運(yùn)用亞硫酸氫鹽測序法分別檢測了H19基因和IGF2R基因差異甲基化區(qū)域（DMR）在新生死亡克隆豬和同期正常豬心臟、肝臟、脾臟、肺臟和腎臟中的甲基化狀態(tài)［27］。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，H19基因DMR在克隆豬肺臟中表現(xiàn)為超甲基化，極顯著高于正常豬（95.20%vs 46.80%，P＜0.01），且10個測序克隆中存在2處連續(xù)的全甲基化CpG位點(diǎn)（4—9位，12—S17位），而在其他組織中甲基化差異不顯著（P＞0.05）；IGF2R基因DMR在肝臟中處于超甲基化狀態(tài)，顯著高于正常豬（80.00%vs 39.41%，P＜0.05），而在肺臟中為去甲基化狀態(tài)，極顯著低于正常豬（14.71%vs 66.47%，P＜0.01），在其他組織差異不顯著（P＞0.05）。表明在死亡克隆豬中，H19基因在肺臟和IGF2R基因在肝臟與肺臟中存在不完全的DNA甲基化重編程，這可能是導(dǎo)致克隆動物死亡的原因之一。

為查明本課題組所獲得的2頭克隆豬隱睪發(fā)生的原因，采用相對熒光定量PCR技術(shù)和亞硫酸氫鹽測序法分析檢測了WT1、FGF9、SOX9和INSL3基因在克隆豬隱睪中的表達(dá)量及其啟動子區(qū)CpG位點(diǎn)甲基化狀態(tài)。結(jié)果表明：WT1基因異常表達(dá)、睪丸組織FGF9、INSL3基因DNA甲基化重編程異常，是導(dǎo)致克隆豬發(fā)生隱睪的重要因素［10-11］。進(jìn)一步利用雙向電泳-質(zhì)譜體系的比較蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)進(jìn)行分離和鑒定，并結(jié)合生物信息學(xué)手段對部分差異蛋白進(jìn)行功能分析［28］，發(fā)現(xiàn)克隆巴馬小型豬的心臟蛋白共有11個差異蛋白，其中5個為上調(diào)蛋白，6個為下調(diào)蛋白［12］；肺臟蛋白共有31個差異蛋白，其中23個為上調(diào)蛋白，8個為下調(diào)蛋白［13］。從而在蛋白質(zhì)水平上證實：克隆巴馬小型豬的心肺均存在一定程度的功能失調(diào)。

中國農(nóng)業(yè)大學(xué)李寧教授課題組的相關(guān)研究也顯示，克隆牛的一些功能基因DNA甲基化、組蛋白乙?；及l(fā)生不同程度變化［29-30］。

總的來說，供體細(xì)胞核重編程的異常普遍存在于克隆胚胎和克隆動物中，是引起體細(xì)胞克隆效率低的主要原因。因此，如何提高供體細(xì)胞核的重編程是一個亟待解決的問題。

5　細(xì)胞質(zhì)遺傳問題

眾所周知，動物的遺傳信息主要儲存在核DNA上，但還有微量的遺傳信息包含在線粒體中。線粒體DNA經(jīng)過卵母細(xì)胞胞質(zhì)的分配而呈母系遺傳方式。在體細(xì)胞克隆過程中，供體細(xì)胞通過融合進(jìn)入受體細(xì)胞質(zhì)后，在將核DNA導(dǎo)入卵母細(xì)胞的同時，也把供體細(xì)胞的線粒體DNA隨之帶入。因此克隆胚胎中存在受體和供體兩種來源的線粒體DNA，這兩種來源的線粒體DNA在克隆胚胎隨后發(fā)育過程中的命運(yùn)怎樣？以及對克隆胚胎發(fā)育的潛在影響究竟如何？這些問題已引起有關(guān)研究者的注意［30］。STEINBORN等［31］在體細(xì)胞克隆牛的不同組織中發(fā)現(xiàn)了供體細(xì)胞和受體細(xì)胞線粒體DNA共存的現(xiàn)象，但二者線粒體DNA所占比例從克隆前到克隆后整個發(fā)育過程基本保持不變，供體線粒體DNA約占1%。線粒體DNA的異質(zhì)性似乎并不影響克隆牛的正常發(fā)育，但線粒體DNA與核DNA之間的不協(xié)調(diào)是否是造成克隆胚胎活力低下的原因之一還有待進(jìn)一步研究。

此外，在小鼠和牛的克隆研究中，還發(fā)現(xiàn)細(xì)胞質(zhì)的遺傳物質(zhì)影響克隆后代的表型，如花斑、毛色等；本實驗室在克隆巴馬小型豬上的研究中也發(fā)現(xiàn)，來自同一供體細(xì)胞系的克隆同胞背部花斑不完全一致。這是由供體細(xì)胞線粒體DNA還是由卵子細(xì)胞質(zhì)中的遺傳物質(zhì)引起的目前尚不清楚。

迄今為止，人們雖然在克隆技術(shù)的研究上積累了一些經(jīng)驗，使克隆效率有了一定的提高，但克隆機(jī)理的探明才是解決克隆效率的關(guān)鍵所在。動物克隆技術(shù)是一項系統(tǒng)工程，需要由分子遺傳學(xué)、發(fā)育生物學(xué)、細(xì)胞學(xué)等相關(guān)基礎(chǔ)學(xué)科提供可靠的理論指導(dǎo)與技術(shù)支持［32］，否則很難再進(jìn)一步提高體細(xì)胞克隆效率。目前，許多新興的研究方法如生物芯片、二維凝膠電泳和質(zhì)譜技術(shù)已應(yīng)用于動物克隆機(jī)理的研究之中。通過對表觀遺傳的分析，期望能夠揭示克隆動物表觀遺傳的分子機(jī)制，以進(jìn)一步提高克隆效率。

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（責(zé)任編輯：閆其濤）

Animal somatic cell cloning technique and its problems

ZHANG De-fu，DAI Jian-jun，WU Cai-feng，ZHANG Shu-shan
（Institute of Animal Science and Veterinary Medicine，Shanghai Academy of Agricultural Sciences；Division of Animal Genetic Engineering，Shanghai Key Laboratory of Agricultural Genetics and Breeding，Shanghai 201106，China）

Abstract：Animal somatic cell cloning technique，with its great value in life science and animal husbandry，is one of the most important research fields in current bio-technology.However，there are still some problems.The paper here briefly reviewed and discussed the problems in animal cloning technique in detail.

Key words：Cloning technique；Life science；Animal husbandry；Problems

中圖分類號：S814.8

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1000-3924（2016）03-168-04

DOI：10.15955/j.issn1000-3924.2016.03.33

收稿日期：2016-01-14

基金項目：國家自然科學(xué)基金（31372315）；國家轉(zhuǎn)基因生物新品種培育科技重大專項（2014ZX08006-005、2014ZX08006）；上海市科委農(nóng)業(yè)成果轉(zhuǎn)化專項（123919N0700、133919N1700）

作者簡介：張德福（1963—），男，博士，研究員，研究方向為動物胚胎工程。Tel：021-62200389，F(xiàn)ax：021-62207858，E-mail：zhangdefuzdf@ 163.com.cn