李　瓊，遲惠英，陳　川

阿爾茨海默病的秀麗隱桿線蟲模型及中醫(yī)藥干預(yù)應(yīng)用進(jìn)展

李瓊，遲惠英，陳川

上海市中醫(yī)老年醫(yī)學(xué)研究所(上海 20031)

摘要：阿爾茨海默病是最常見的神經(jīng)退行性病變，其發(fā)病機(jī)制尚不清楚。秀麗隱桿線蟲具有導(dǎo)致阿爾茨海默病發(fā)病的同源基因等優(yōu)勢被應(yīng)用于阿爾茨海默病機(jī)制的研究中。本研究綜述與阿爾茨海默病有關(guān)的秀麗隱桿轉(zhuǎn)基因線蟲模型，并對中醫(yī)藥干預(yù)其作用及機(jī)制進(jìn)行總結(jié)。

關(guān)鍵詞：阿爾茨海默?。恍沱愲[桿線蟲；轉(zhuǎn)基因模型；中醫(yī)藥

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)是一種與老化相關(guān)的神經(jīng)退行性疾病，其發(fā)病機(jī)制尚不清楚。秀麗隱桿線蟲(Caenorhabditis elegans，C．elegans) 是研究與衰老相關(guān)疾病的良好模型，因其具有導(dǎo)致AD發(fā)病的同源基因等特點(diǎn)被應(yīng)用于AD機(jī)制的研究。

1秀麗隱桿線蟲的概述

Sydney Brenner于1963年首次提出將線蟲作為研究發(fā)育生物學(xué)和神經(jīng)生物學(xué)理想的模式生物[1]。其作為模式生物的優(yōu)點(diǎn)為： ①身長短，養(yǎng)約1 mm，以大腸桿菌為食，易于飼養(yǎng)；②蟲體全身呈透明狀，便于熒光顯微鏡對任一細(xì)胞進(jìn)行觀察；③生命周期短。在實(shí)驗(yàn)室20 ℃的環(huán)境下，從卵發(fā)育到成蟲3 d，平均壽命為3周。④繁殖快并且多產(chǎn)。一只雌雄同體線蟲可以產(chǎn)下300多個后代，經(jīng)雄蟲交配后可以產(chǎn)下1 000多個后代。⑤具有與人類保守性高的神經(jīng)系統(tǒng)。線蟲雌雄同體成蟲有959個體細(xì)胞，雄蟲成蟲有1 031個體細(xì)胞[2]，由302個和391個神經(jīng)元組成雌雄同體成蟲和雄蟲的神經(jīng)系統(tǒng)。其神經(jīng)元細(xì)胞占其體細(xì)胞的37%以上。神經(jīng)元的結(jié)構(gòu)簡單，只有一個或兩個不分叉的突起，形成或接受突觸連結(jié)，但其基本功能與其他哺乳動物相似，并包含多種經(jīng)典的和其他哺乳動物類似的神經(jīng)遞質(zhì)；如：乙酰膽堿、五羥色胺、多巴胺、谷氨酞胺，氨基丁酸和神經(jīng)肽等。這些神經(jīng)遞質(zhì)在神經(jīng)元中的合成、儲存和代謝等過程都與哺乳動物具有高度相似性。⑥具有復(fù)雜的行為學(xué)特征，包括機(jī)械感知和化學(xué)感知，趨化性及趨溫性。⑦生命力頑強(qiáng)，可以在-80 ℃條件下長期凍存，需要時可隨時復(fù)蘇。⑧擁有專業(yè)線蟲網(wǎng)站，可提供查找購買各種線蟲突變品系(http：//www．wormbase．org/)。

2阿爾茨海默病的秀麗隱桿線蟲模型

秀麗隱桿線蟲基因測序已完成，有60%～80%的基因和人類同源，比如APP、 Tau 基因[3-4]。目前，認(rèn)為APP、PS1、PS2、Tau、ApoE4基因與早發(fā)的家族遺傳型AD的發(fā)病有密切關(guān)系[5-9]。除ApoE4在C．elegans中未找到同源基因外，其余基因?qū)?yīng)同源基因分別為apl-1、sel-12、hop-1、ptl-1[10-13]。為了研究AD發(fā)病機(jī)制，細(xì)胞培養(yǎng)模型及嚙齒類動物模型被廣泛應(yīng)用。用PC12細(xì)胞進(jìn)行AD建模，該細(xì)胞與人類神經(jīng)細(xì)胞結(jié)構(gòu)、分泌及功能存在有一定的差異；且多選用Aβ(25～35)片斷添加于細(xì)胞培養(yǎng)液中制備細(xì)胞模型，這與老年斑(senile plaques，SP)中主要組分Aβ40、Aβ42氨基酸片斷也有差別，建立的模型并不能完善地呈現(xiàn)AD疾病的發(fā)生發(fā)展，會限制其進(jìn)一步研究[14]。嚙齒類轉(zhuǎn)基因鼠主要有表達(dá)APP基因或雙轉(zhuǎn)基因PS和APP，這些模型是成功的復(fù)制了AD的病變特征[15-18]。雙轉(zhuǎn)基因動物具有難以培育、容易死亡、價格較為昂貴，成模周期較長的不[19-20]。

線蟲成本低，易于飼養(yǎng)，模型穩(wěn)定，其與人類保守性高，具有AD發(fā)病的同源基因，且便于判斷藥物治療AD有無效果(通過觀察線蟲麻痹率有無改善)。使得其為探究AD的機(jī)制及篩選相關(guān)治療藥物打開了新思路。目前，在線蟲中建立的轉(zhuǎn)基因模型主要有Aβ模型和Tau模型[21]。

2．1 Aβ模型AD是以腦細(xì)胞外沉積的老年斑及細(xì)胞內(nèi)形成的神經(jīng)元纖維纏結(jié)(neurofibrillary tangles，NFTs)[22]為主要病理改變的神經(jīng)退行性疾病。淀粉樣蛋白(amyloid β-protein，Aβ)沉積是SP的核心，其由APP經(jīng)β-分泌酶和γ-分泌酶水解而來。C．elegans體內(nèi)APP同源的基因是apl-1，APL-1蛋白缺乏Aβ肽而且沒有類似的β-分泌酶[12]。1995年，Link[23]首次在肌肉細(xì)胞中建立了由特異性啟動子unc-54控制Aβ表達(dá)的轉(zhuǎn)基因線蟲模型。該模型(CL2006)能夠在細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生人源性的Aβ1-42沉積以及出現(xiàn)機(jī)體進(jìn)行性的麻痹表型，主要用于Aβ毒性和淀粉質(zhì)形成機(jī)制的研究。為了進(jìn)一步研究Aβ肽完整長度的影響，F(xiàn)ay等[24]用Aβ肽第35位上的Cys替換Met，妨礙了淀粉質(zhì)的形成，這個結(jié)果暗示了蛋氨基酸在淀粉質(zhì)的形成過程起著重要作用。

Link等[25]在幼蟲體內(nèi)建立了上調(diào)溫度后其肌肉細(xì)胞表達(dá)Aβ1-42的轉(zhuǎn)基因模型CL4176。CL4176在16℃下是正常的運(yùn)動表現(xiàn)，溫度上調(diào)到25℃導(dǎo)致了線蟲麻痹的發(fā)生[26]。該模型可消除由線蟲衰老造成麻痹的影響。CL2006和CL4176模型Aβ的表達(dá)被限制在肌肉細(xì)胞中，但仍然部分解釋了Aβ表達(dá)和Aβ的毒性的關(guān)系[27]。理論上，在神經(jīng)細(xì)胞過表達(dá)毒性Aβ的模型更接近AD。

Wu等[28]在神經(jīng)細(xì)胞中建立了表達(dá)Aβ1-42轉(zhuǎn)基因模型CL2355。該模型表型的缺點(diǎn)是在趨藥性的行為和5-羥色胺敏感性方面的表現(xiàn)不足，是可用來研究Aβ毒性和神經(jīng)功能之間關(guān)系的模型。Treusch等[29]建立了在谷氨酰胺神經(jīng)元細(xì)胞中表達(dá)Aβ的模型。該模型目前沒有表型，但通過該模型發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞骨架相關(guān)的基因(YAP1802，INP52，SLA1，CRM1，GRR1，KEM1，RTS1)參與了神經(jīng)退行性病變的調(diào)節(jié)。eat-4在谷氨酰胺神經(jīng)元中特異性表達(dá)，將Peat-4：GFP載體轉(zhuǎn)入線蟲獲得轉(zhuǎn)基因線蟲，谷氨酰胺神經(jīng)元被GFP標(biāo)記，該模型證明了谷氨酰胺神經(jīng)元細(xì)胞的丟失量與衰老成正相關(guān)關(guān)系。Goedert等[30]在神經(jīng)細(xì)胞中建立了表達(dá) Aβ1～40A2V的轉(zhuǎn)基因模型，該模型縮短了線蟲的壽命，引起了行為的缺陷和神經(jīng)遞質(zhì)的損傷，對研究突觸體機(jī)能障礙及AβN-末端變異引起的Aβ寡聚體形成增多機(jī)制打開了新思路。Aβ在CL2006、CL4176和CL2355模型中的分布位置詳見圖1。

圖1具體內(nèi)容介紹：Anterior regions of transgenic C．

elegans worms fixed and probed for Aβ．Top panel:

CL2006 adult probed with anti-AβmAb 4G8．

Middle panel:CL4176 3rd stage larvae probed with

anti-Aβ mAb 6E10．Bottom panel: CL2355

adult probed with anti-Aβ mAb 6E10.

Images are overlays of DIC brightfield image

and digitally deconvoluted epifluorescence images．

Size bar=50 mM

摘自：Lublinl AL, Link CDal．Alzheimer’s

disease drug discovery:in vivo screening using

Caenorhabditis elegans as a model for b-

amyloid peptide-induced toxicity[J]．

Drug Discovery Today,2013,1:e116-e119.

圖1Aβ在CL2006、CL4176和CL2355模型中的分布位置

2．2Tau模型Tau蛋白過度磷酸化異常聚集形成NFTs，其對AD病理過程發(fā)生有重要作用。Kraemer等[31]建立了在神經(jīng)細(xì)胞特異性表達(dá)野生型和FTDP(frontotemporal dementia with parkinsonism chromosome，F(xiàn)TDP)突變型(P301L和v337M )的Tau轉(zhuǎn)基因模型，發(fā)現(xiàn)野生和突變Tau過表達(dá)都會出現(xiàn)運(yùn)動不協(xié)調(diào)(uncoordinated movement，UNC) 的表型，UNC會隨著衰老而漸進(jìn)性加重。而且觀察到以磷酸化形式沉積的Tau，并且電鏡下可見軸突擴(kuò)張，呈不規(guī)則的空泡狀。以此模型為基礎(chǔ)，Kraemer等[32]研究sut-1基因和Tau引起的神經(jīng)毒性的關(guān)系。抑制sut-1(編碼RNA和snRNP-相關(guān)蛋白的基因)則減輕突變Tau模型引起的神經(jīng)毒性并且UNC得到改善。Sut-1沒有在人類中發(fā)現(xiàn)同源基因。Guthrie等[33]發(fā)現(xiàn)sut-2(編碼CCCH型鋅指蛋白亞型的基因)存在于從酵母到人類的所有物種中。sut-2的功能抑制減少了V337M Tau轉(zhuǎn)基因突變型Tau的聚合并能夠減緩神經(jīng)退行性病變的發(fā)生。sut基因家族抑制Tau引起的神經(jīng)毒性。后續(xù)的研究發(fā)現(xiàn)MSUT-2是sut-2基因的人類同源基因，在哺乳動物細(xì)胞培養(yǎng)模型中將其敲除，則可改善由Tau引起的病理改變[34]。

Chronis等[35]建立了將v337M突變Tau和F3△K280Tau片斷結(jié)合的Tau轉(zhuǎn)基因模型，該模型表現(xiàn)了Tau的加速聚集和Tau引起的嚴(yán)重神經(jīng)毒性，從而導(dǎo)致了嚴(yán)重受損的運(yùn)動性和神經(jīng)功能障礙的出現(xiàn)。通過建立這個模型，可以證明抑制Tau的聚集可以達(dá)到神經(jīng)保護(hù)的作用。Tomohiro等[36]建立了在感覺神經(jīng)元特異性表達(dá)野生型和FTDP突變型(P301L和R406W) Tau的轉(zhuǎn)基因模型，在感覺神經(jīng)元中Tau高表達(dá)，導(dǎo)致感覺運(yùn)動神經(jīng)元功能下降。生命周期過程中野生型比突變型對感覺刺激的反應(yīng)要靈敏。突變Tau模型表現(xiàn)出異常的神經(jīng)炎癥及微管的變薄、彎曲、丟失。是目前已有的基于線蟲建立的Aβ模型和Tau模型(見圖2)。

圖2　目前已有的基于線蟲建立的Aβ模型和Tau模型

3關(guān)于中醫(yī)藥干預(yù)秀麗隱桿線蟲AD模型的研究及思考

研究發(fā)現(xiàn)，EGb761可以延長線蟲壽命和延遲麻痹的出現(xiàn)[37]，通過降低活性氧( reactive oxygen species，ROS)水平，減少細(xì)胞內(nèi)的自由基，從而抑制Aβ42寡聚體的產(chǎn)生和沉積的作用[38-39]。給mev-1突變體線蟲(Tk22)給予EGb761，其抗氧化能力和熱應(yīng)激能力分別提高33%和11%。說明EGb761可以通過增強(qiáng)抗氧化能力從而抑制Aβ沉積及減輕Aβ引起的神經(jīng)毒性。hsp-16基因在表達(dá)Aβ的轉(zhuǎn)基因線蟲中表達(dá)升高[40]，將hsp-16基因用GFP標(biāo)記，給該轉(zhuǎn)基因線蟲(TJ375)模型給予EGb761后，hsp-16的表達(dá)被抑制[41]。六味地黃丸乙醇提取物(LWDH-EE，主要成分為沒食子酸和芍藥苷)，干預(yù)CL4176線蟲模型，LWDH-EE 通過降低線蟲體內(nèi)ROS的產(chǎn)生；減少線蟲體內(nèi)amy1表達(dá)來改善Aβ引起的神經(jīng)毒性，其對Aβ的沉積不能發(fā)揮干預(yù)作用[42]。盡管EGb761防治 AD 的研究有一定進(jìn)展，但在探討其作用機(jī)制上仍存在不足之處，如EGb761對 Tau 蛋白在AD發(fā)病機(jī)制作用影響的研究尚處于空白。

國內(nèi)外對單味中藥(除EGb761外)、中藥某一有效成分及傳統(tǒng)中藥復(fù)方對AD的防治作用機(jī)制的相關(guān)研究尚處于空白。 針對上述問題，應(yīng)該充分發(fā)揮線蟲模型的優(yōu)勢，應(yīng)用現(xiàn)代生物技術(shù)，探尋中醫(yī)藥領(lǐng)域中未被發(fā)現(xiàn)的具有治療AD的中藥及中藥復(fù)方并研究其機(jī)制，這將是未來研究工作的方向及臨床運(yùn)用的重點(diǎn)。

參考文獻(xiàn)：

[1]Brenner S．The genetics of Caenorhabditis elegans[J]．Genetics，1974，77(1)：71-94．

[2]Sulston JE．Horvitz HR．Post-embryonic celll ineages of the nematode，Caenorhabditis elegans[J]．Dev Biol，1977，56(1)：110-156．

[3]Celegans Sequencing Consortium(1998)．Genome sequence of the nematode C．elegans： a platform for investigating biology[J]．Science，1998，282(5396)：2012-2018．

[4]Shaye DD，Greenwald I．OrthoList：a compendium of C．elegans genes with human orthologs[J]．PLoS One，2011，6(5)：e20085．

[5]Goate A，Chartier-Harlin，Mulla M，et al．Segregation of a missense mutation in the amyloid precursor protein gene with familial Alzheimer’s disease[J]．Nature，1991，349(6311)： 704-706．

[6]Sleegers K，Brouwers N，Ijselinck I，et al．APP duplication is sufficient to cause early onset Alzheimer’s dementia with cerebral amyloid angiopathy[J]．Brain，2006，129(Pc11)： 2977-2983．

[7]Sherrington R，Rogaev EI，Liang Y，et al．Cloning of a gene bearing missense mutations in early-onset familial Alzheimer’s disease[J]．Nature，1995，375(6534)：754-760．

[8]Rogaev EI，Sherrington R，Rogaeva EA，et al．Familial Alzheimer’s disease in kindreds with missense mutations in a gene on chromosome 1 related to the Alzheimer’s disease type 3 gene[J]．Nature，1995，376(6543)：775-778．

[9]Roses AD．Apolipoprotein E and Alzheimer’s disease．The tip of the susceptibility iceberg[J]．Ann N Y Acad Sci，1998，855：738-743．

[10]Daigle I，Li C．a(chǎn)pl-1，a Caenorhabditis elegans gene encoding a protein related to the human beta-amyloid protein precursor[J]．Proc Natl Acad Sci USA，1993，90(24)：12045-12049．

[11]Li X，Greenwald I．HOP-1，a Caenorhabditis elegans presenilin，appears to be functionally redundant with SEL-12 presenilin and to facilitate LIN-12 and GLP-1 signaling[J]．Proc Natl Acad Sci USA，1997，94(22)：12204-12209．

[12]Westlund B，Parry D，Clover R，et al．Reverse genetic analysis of Caenorhabditis elegans presenilins reveals redundant but unequal roles for sel-12 and hop-1 in Notch-pathway signaling[J]．Proc Natl Acad Sci USA，1999，96(5)：2497-2502．

[13]Goedert ML，Baur CP，Ahringer J，et al．PLT-1 a microtubule-associated protein with tau-like repeats from the nematode Caenorhabditis elegans[J]．Cell Sci，1996 109 ( Pt 11)：2661-2672．

[14]晁寧，于會艷，秦斌．借助阿爾茨海默病細(xì)胞模型探討氧化應(yīng)激發(fā)病機(jī)[J]．中國醫(yī)學(xué)前沿雜志，2012，4(10)：51-54．

[15]George-Hyslop P，Haines J，Rogaev E， et al．Genetic evidence for a novel familial Alzheimer’s disease locus on chromosome 14[J]．Nat Genet，1992，2(4)： 330-334．

[16]Sherrington R，Rogaev EI，Liang Y， et al．Cloning of a gene bearing missense mutations in early-onset familial Alzheimer's disease[J]．Nature，1995，375(6543)： 754-760．

[17]Corder EH，Saunders AM，Strittmatter WJ， et al．Gene dose of apolipoprotein E type 4 allele and the risk of Alzheimer’s disease in late onset families[J]．Science，1993，261(5123)： 921-923．

[18]Calhoun ME，Burgermeister P，Phinney AL，et al．Neuronal overexpression of mutant amyloid precursor protein results in prominent deposition of cerebrovascular amyloid[J]．Proc Natl Acad Sci USA，1999，96(24)：14088-14093．

[19]梁琳，李浩，劉劍剛，等．中醫(yī)藥干預(yù)APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因癡呆模型小鼠研究進(jìn)展[J]．中國中西醫(yī)結(jié)合雜志，2013，33(9)：1292-1294．

[20]楊翠翠，李林，張?zhí)m．常用阿爾茨海默病動物模型制備方法及評價[J]．成都醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2013，8(4)：374-378．

[21]楊平．阿爾茨海默病的秀麗隱桿線蟲模型及其應(yīng)用[J]．中國細(xì)胞生物學(xué)學(xué)報(bào)，2010，32(1)：37-42．

[22]Selkoe DJ．Alzheimer’s disease：genes，proteins，and therapy[J]．Physiol Rev，2001，81(2)：741-766．

[23]Link CD．Expression of human beta-amyloid peptide in transgenic Caenorhabditis elegans[J]．Proc Natl Acad Sci USA，1995，92(20)：9368-9372．

[24]Fay DS，F(xiàn)luet A，Johnson CJ，et al．In vivo aggregation of beta-amyloid peptide variants[J]．Neurochem，1998，71(4)，1616-1625．

[25]Link CD，Taft A，Duke K，et al．Gene expression analysis in a transgenic Caenorhabditis elegans Alzheimer’s disease model[J]．Neurobiol Aging，2003，24(3)：397-413．

[26]Dostal V，Link CD．Assaying beta-amyloid toxicity using a transgenic C．elegans model[J]．Vis Exp，2010，44： 2252．

[27]Drake J，Link CD，Butterfield DA．Oxidative stress precedes fibrillar deposition of Alzheimer’s disease amyloid beta-peptide (1-42) in a transgenic Caenorhabditis elegans model[J]．Neurobiol Aging，2003，24(3)：415-420．

[28]Wu Y，Wu Z，Butko P，et al．Amyloid- b-induced pathological behaviors are suppressed by ginkgo biloba extract EGb 761 and ginkgolides in transgenic Caenorhabditis[J]．Neurosci，2006，26(50)：13102-13113．

[29]Treusch S，Hamamichi S,Matlack KE，et al．Functional Links between Ab toxicity，endocytic trafficking，and Alzheimer’s disease risk factors in yeast[J]．Science ，2011，334(6060)：1241-1215．

[30] Diomede DI，F(xiàn)ede G，Romeo M，et al．Expression of A2V-mutated Aβ in Caenorhabditis elegans results in oligomer formation and toxicity[J]. Neurobiol Dis，2014，62：521-532.

[31] Kraemer BC，Zhang B，Leverenz JB，et al．Neurodegeneration and defective neurotransmission in a Caenorhabditis elegans model of tauopathy[J]. Proc Natl Acad Sci USA，2003，100(17)：9980-9985.

[32]Kraemer BC，Schellenberg GD．SUT-1 enables tau-induced neurotoxicity in Celegans[J]．Hum Mol Genet，2007，16(16)：1959-1971．

[33]Guthrie CR，Schellenberg GD，Kraemer BC．SUT-2 potentiates tau-induced neurotoxicity in Caenorhabditis elegans[J]．Hum Mol Genet，2009，18(10)：1825-1838．

[34]Wheeler JM，Guthrie CR，Kraemer BC．The role of MSUT-2 in tau neurotoxicity： a target for neuroprotection in tauopathy[J]．Biochem Soc Trans，2009，38(4)：973-976．

[35]Chronis F，Ghulam Ji P，Jacek B，et al．Inhibition of tau aggregation in a novel Caenorhabditis elegans model of tauopathy mitigates proteotoxicity[J]．Human Molecular Genetics，2012，21(16)：3587-3603．

[36]Tomohiro M，Zhen DK Gengyo A，et al．Progressive neurodegeneration in C．elegans model of tauopathy[J]．Neurobiology of Disease，2005，20(2)：372-383．

[37]Wu Y，Luo Y．Transgenic C．elegans as a model in Alzheimer’s research[J]．Curr Alzheimer Res，2005，2(1)：37-45．

[38]Smith JV，Luo Y．Elevation of oxidative free radicals in Alzheimer’s disease models can be attenuated by Ginkgo biloba extract EGb 761[J]．J Alzheimers Dis，2003，5(4)：287-300．

[39]Wu Y，Wu Z，Butko P，et al．Amyloid beta induced pathological behaviors are suppressed by Ginkgo biloba extract EGb 761 and ginkgolides in transgenic caenorhabditis elegans[J]．J Neurosci，2006，26(50)：13102-13113．

[40]Fay DS，F(xiàn)luet A，Johnson CJ，et al ．In vivo aggregation of beta-amyloid pepetide variants[J]．Neurochem，1998，71(4)：1616-1625．

[41]Strayer A，Wu Z，Christen Y，et al．Expression of the small heat-shock protein Hsp16-2 in Caenorhabditis elegans is suppressed by Ginkgo biloba extract EGb 761[J]．FASEB J，2003，17(15)：2305-2307．

[42]Sangha JS，Sun X，Wally OS，et al．Liuwei Dihuang(LWDH)，atraditional Chinese medicinal formula，protects against β-amyloid toxicity in transgenic Caenorhabditis elegans[J]．PLoS One，2012，7(8)：e43990．

(本文編輯王雅潔)

通訊作者：陳川，E-mail：ch9453@126．com．

中圖分類號：R749R255

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

doi：10．3969/j．issn．1672-1349．2016．01．011

文章編號：1672-1349(2016)01-0038-04

(收稿日期：2015-03-01)