房守敏

(西華師范大學生命科學學院，南充　637002)

袖蝶熱激蛋白HSP70的全基因組分析與進化*

房守敏

(西華師范大學生命科學學院，南充637002)

摘要熱激蛋白70(heat shock protein 70，HSP70)是廣泛分布于生物體內(nèi)的重要分子伴侶，在環(huán)境應激和熱適應中起著重要作用。本研究對詩神袖蝶Hsp70s進行了全基因組鑒定，共獲得12個Hsp70s基因，其編碼蛋白分子量均在70 kDa左右。進化分析表明，Hsp70s在分子系統(tǒng)發(fā)生樹中聚為2類，分別為應激誘導型(HSP70)和組成型(HSC70)。詩神袖蝶和果蠅組成型Hsc70s基因存在1∶1的直系同源關系，而應激誘導型Hsp70s則同一物種聚為一枝，表明Hsc70s在詩神袖蝶和果蠅物種分化前業(yè)已發(fā)生基因擴增，而Hsp70s則是物種形成后發(fā)生世系特異擴增而產(chǎn)生的多個拷貝。我們對詩神袖蝶Hsp70s基因在化學感受器官中的表達進行了分析，除HmelHsp68、HmelHsp70A和HmelHsc70-2在化學感受器官中不表達或表達量極低外，其他基因均有明顯的表達信號(FPKM>1)，而且在雌雄個體間具有相似的表達信號。這一研究有助于拓展我們對昆蟲Hsp70s進化和功能的認識。

關鍵詞詩神袖蝶；熱激蛋白70；鑒定；序列分析；表達模式

熱激蛋白(heat shock protein, HSP)是從細菌到動植物中均廣泛存在的一類保守的蛋白質，在環(huán)境應激和熱適應中起著重要作用[1-2]。生物體在應激反應過程中，熱激蛋白能確保新合成的蛋白正確折疊，作為陪伴蛋白與變性蛋白結合，維持它們的折疊狀態(tài)[3]。根據(jù)蛋白分子量大小可以分為：15-30kDa之間的小熱激蛋白small HSPs、HSP60s、HSP70s、HSP90s和HSP110s五大家族[4-7]。Hsp70家族則是一類分子量大小在70 kDa左右的熱激蛋白，是熱激蛋白中重要的家族之一，它分布于所有生物體中，其功能和結構非常保守[8-9]。HSP70包括應激誘導基因(Stress-inducible genes, Hsp70s)和組成型熱激相關蛋白(Constitutive forms-heat shock protein cognates Hsc70s)。在環(huán)境應激中，誘導型Hsp70s可能大量被誘導，以幫助生物體內(nèi)蛋白正確折疊和修復損傷的蛋白，而Hsc70s可能起著持家基因的功能[1，9，10]。

一直以來，Hsp70s被認為是生物體抵抗冷和熱應激的重要組成部分。研究表明，果蠅DmHsp68、DmHsp70A和DmHsp70Ba基因的上調(diào)表達與果蠅經(jīng)受36℃熱應激后的熱耐受性相關[11]。在家蠶經(jīng)歷41℃和 45℃熱應激后，雙向電泳結果顯示一些差異蛋白被鑒定為Hsp70s，并且其表達量上調(diào)了20倍左右[12]。經(jīng)歷熱應激后，Hsp70基因mRNA水平的上調(diào)表達在多種生物中大量報道，如Drosophilamelanogaster[13，14]、D.buzzatii[15]、Anophelesgambiae(Sim et al., 2007)、Chrysomeaeneicollis[16]。近年來，昆蟲經(jīng)歷冷應激也發(fā)現(xiàn)Hsp70s的誘導表達[12,17-19]。因此，Hsp70s的上調(diào)表達與生物冷和熱應激適應性息息相關。

Hsp70s除了在適應極端溫度的應激中起作用外，其他的應激因子(如殺蟲劑)也能誘導Hsp70s的上調(diào)表達[20]。研究發(fā)現(xiàn)，果蠅經(jīng)0.15-1.5ppb敵敵畏(dichlorvos，DV)處理后，精巢中的Hsp70 mRNA被顯著的誘導[14,21]。在Cyprinuscarpio中，經(jīng)chlorpyrifos (CPF)和atrazine/chlorpyrifos處理后，Hsp70mRNA(Genbank accession number: BG933934)也有顯著的上調(diào)。殺蟲劑處理昆蟲后能引起昆蟲體內(nèi)發(fā)生氧化應激和炎癥反應，Hsp70s的上調(diào)表達可能能修復或防止該過程中蛋白的損傷。

袖蝶屬(Heliconius)是一類主要分布在南美洲，少數(shù)分布在美國南部的蝴蝶，其多剌的幼蟲以西番蓮屬(Passiflora)的植物為食[22]。2012年，模式種詩神袖蝶Heliconiusmelpomene的基因組測序完成，主要用于繆勒擬態(tài)(Mullerianmimicry)的形成機制研究[22]。蝴蝶生存的環(huán)境較為豐富，一方面也會面臨冷熱應激的環(huán)境，另一方面環(huán)境中也會存在大量有害物質的污染。因此，本研究重在鑒定其基因組中Hsp70s基因，并與果蠅(Drosophilamelanogaster)進行比較，分析基因的進化特征。2013年，Briscoe等[23]對詩神袖蝶成蟲化學感受組織(觸角、足和口器)進行了轉錄組測序，為我們分析該物種Hsp70s基因的表達模式提供了便利。

1材料與方法

1.1Hsp70s基因的鑒定

根據(jù)Kanani等[24]對黑腹果蠅等物種Hsp70s的系統(tǒng)研究，我們從美國國立生物技術信息中心(NCBI，http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)下載了果蠅的Hsp70s的氨基酸序列。以果蠅Hsp70s為檢索序列與詩神袖蝶預測的蛋白數(shù)據(jù)庫和基因組(http://www.heliconius.org/)作Blastp和tBlastn同源比對。對含有潛在Hsp70s的scaffold序列用FGENESH/FGENESH+(http://linux1.softberry.com/)在線工具重新預測基因。利用在線工具Pfam(http://pfam.sanger.ac.uk/)和SMART(http://smart.embl-heidelberg.de/)分析候選基因是否含有Hsp70s的保守域。HmelHsp70s蛋白的分子量MW/等電點pI及細胞內(nèi)表達定位分別采用http://web.expasy.org/compute_pi/和http://psort.hgc.jp/form2.html預測。

1.2分子系統(tǒng)發(fā)生分析

采用Clusta lx1.8軟件對詩神袖蝶和黑腹果蠅Hsp70s蛋白序列進行多序列比對。利用MEGA6.0[25]構建鄰近系統(tǒng)發(fā)生樹(neighbor-joining phylogentic tree)。序列中的缺失采用partial deletion(70%)刪除，選用Jones-Taylor-Thornton(JTT)模型計算兩兩序列間的遺傳距離。用Bootstrap方法對分子系統(tǒng)發(fā)生樹分支可信度檢驗(重復1000次)。

1.3Hsp70s基因在化學感受組織中的表達

下載詩神袖蝶成蟲化學感受組織(觸角、足和口器)的RNA測序數(shù)據(jù)[23]。去除低質量讀序(reads)和接頭后獲得的clean讀序。用TopHat軟件[26]對每一個樣品的成對讀序分別與詩神袖蝶參考基因組進行比對。利用Cufflinks軟件[27]計算Hsp70s基因的表達水平。表達信號值用FPKM(fragments per lilobase of transcript per million mapped reads)表示，即每百萬個map上的reads中映射到外顯子的每1kb上的reads個數(shù)。采用Cuffdiff程序[28]計算雌雄個體間的差異基因，以錯誤發(fā)現(xiàn)率FDR(False discovery rate)≤0.001和log2(Fold-change) 絕對值≥1為域值。

2結果與討論

2.1詩神袖蝶Hsp70s的全基因組鑒定與進化分析

根據(jù)Kanani等[24]研究，下載了黑腹果蠅Hsp70s的蛋白序列，并在詩神袖蝶預測的蛋白數(shù)據(jù)庫和基因組中同源比對檢索。通過基因預測與結構域分析，最終在詩神袖蝶基因組中共鑒定出12個Hsp70s基因(表1)。由于測序導致基因組部分序列的缺失，即使通過精度較高的基因預測軟件FGENESH/FGENESH+，也無法獲得其中三個基因HMEL015456、HMEL002731和HMEL014751的完整編碼區(qū)序列。對鑒定的Hsp70s編碼蛋白分子量和等電點進行了預測，發(fā)現(xiàn)大部分蛋白的分子量為70 kDa左右，但HMEL006222的分子量較小，僅為52.0kDa。等電點的預測表明，所有的Hsp70s蛋白的pI值小于7.0(表1)。細胞定位結果表明，Hsp70s主要位于細胞質、核質間和內(nèi)質網(wǎng)。

注：檢索號源自http://www.heliconius.org/數(shù)據(jù)庫，分子量和等電點欄“-”表示基因編碼區(qū)序列不完整。

將詩神袖蝶和黑腹果蠅的Hsp70s蛋白序列構建鄰近系統(tǒng)發(fā)生樹(圖1)。結果表明，熱激蛋白70可明確地分為應激誘導型Hsp70s和組成型熱激相關蛋白Hsc70s兩個進化枝，即HSP和HSC(圖1)。根據(jù)黑腹果蠅命名規(guī)則，基于進化分析對詩神袖蝶熱激蛋白70基因進行了命名。結果表明，詩神袖蝶應激誘導型Hsp70s含有3個基因(表1，圖1)，組成型Hsc70s含有8個基因。在果蠅基因組中應激誘導型Hsp70s和組成型Hsc70s的基因數(shù)目分別為7個和6個。組成型Hsc70s更為保守，詩神袖蝶和果蠅間存在明顯的1∶1的直系同源關系，表明大部分組成型Hsc70s在詩神袖蝶和果蠅物種分化形成前已經(jīng)產(chǎn)生。而應激誘導型Hsp70s則不同，詩神袖蝶和果蠅分別聚為兩枝(圖1)，暗示應激誘導型Hsp70s是物種分化形成后通過基因重復的方式產(chǎn)生，分化形成的時間相對較短。相對于果蠅而言，應激誘導型Hsp70s在詩神袖蝶基因組中發(fā)生較少的擴增。

節(jié)點處僅顯示了>50%的Bootstrap值；熱激蛋白70基因前的Hmel表示詩神袖蝶(Heliconiusmelpomene)，Dm表示黑腹果蠅(Drosophilamelanogaster)。黑腹果蠅基因名后為對應的NCBI GenBank檢索號。

圖1　詩神袖蝶和果蠅Hsp70s的鄰近系統(tǒng)發(fā)生樹

2.2詩神袖蝶Hsp70s在化學感受組織中的表達

研究發(fā)現(xiàn)，蝴蝶觸角、足和口器均存在嗅覺和味覺的感受器，因此在覓食、繁殖、趨避等過程中起著重要作用[23]。熱激蛋白70作為一類重要的對環(huán)境(冷、熱)和有害物質(如殺蟲劑等)應激蛋白，具有維持受損蛋白的折疊狀態(tài)等功能。對詩神袖蝶Hsp70s基因在化學感受組織中的表達進行了分析(表2)，初步理解其可能在化學感受組織中維持嗅覺和味覺正常生理功能中的作用。結果表明，除HmelHsp68、HmelHsp70A和HmelHsc70-2在化學感受組織中不表達或表達量極低外，其他基因均有明顯的表達信號(FPKM>1)。另外，實驗發(fā)現(xiàn)所有的基因在雌性和雄性個體觸角和口器具有相近的表達信號值，絕大部分基因在雌性和雄性足中也具有相似的表達信號。Hsp70s基因雌雄無偏好性的表達模式，表明它們在雌雄個體中具有相似的生理功能。但也發(fā)現(xiàn)HmelHsc70-3、HmelHsc70-4和HmelHsc70-5在雌雄成蟲足的表達具有顯著差異，而且均是雄性高于雌性，其內(nèi)在的機制暫不清楚。

目前，熱激蛋白70在果蠅等模式昆蟲中已有大量的研究，證實它們與物體抵抗冷和熱應激相關，其表達也能被其他有毒應激因子(殺蟲劑等)所誘導[20]。由于殺蟲劑進入昆蟲體內(nèi)誘發(fā)氧化應激反應，進而對蛋白產(chǎn)生損傷[29]，熱激蛋白70可能參與維持損傷蛋白或新合成蛋白的正常折疊。但非模式昆蟲的熱激蛋白70研究相對較少，而且對它們在化學感受組織中的表達研究則更少。本研究對詩神袖蝶Hsp70s的全基因組鑒定和化學感受組織中的表達模式分析，有助于拓展我們對昆蟲Hsp70s進化和功能的認識。

表2　詩神袖蝶Hsp70s在嗅覺組織中的表達信號(FPKM)

注：組織后的F表示雌(female)，M表示雄(male)。

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Heat shock protein 70 (HSP70) is widely distributed in organisms, which plays important roles in environmental stresses and heat adaptation. In this study,HeliconiusmelpomeneHsp70s were identified in the whole genome, and 12 Hsp70s were characterized, whose molecular weights were all around 70 kDa. In the phylogenetic tree, heat shock protein 70 proteins were clustered into two group, including stress-induced Hsp70s and constitutive Hsc70s. Relatively, most of the Hsc70s inH.melpomeneandDrosophilamelanogastershowed 1 to 1 orthologous relationship, while stress-induced Hsp70s group clustered within each species, suggesting that Hsc70s were duplicated before speciation ofH.melpomeneandD.melanogaster. We analyzed the expressions of HmelHsp70s family in the chemosensory tissues ofH.melpomeneadults. Except forHmelHsp68,HmelHsp70A andHmelHsc70-2, all the others were expressed in those tissues (FPKM>1). This study might help us understand the evolution and function of Hsp70s in non-model species.

Key wordsHeliconiusmelpomene; Heat shock protein 70; Identification; Sequence analysis; Expression pattern

Genomic Characterization and Evolution of HSP70 inHeliconiusmelpomene

FANG Shou-Min

(CollegeofLifeScience,ChinaWestNormalUniversity,Nanchong,Sichuan637002,China)

ABSTRACT

資助項目：西華師范大學基本科研業(yè)務費專項資金資助(No.13D001)。