曾黎瓊韓蓉蓉，，段玉云陳　玲文亦芾李娥賢姜　飛，

（1云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)與種質(zhì)資源研究所，云南省農(nóng)業(yè)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，農(nóng)業(yè)部西南作物基因資源與種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南昆明 650223；2云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，云南昆明 650201；3西南大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，重慶 400715）

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不同鉀水平下花魔芋差異表達(dá)基因分析

曾黎瓊1韓蓉蓉1，2，3段玉云1陳玲1文亦芾2李娥賢1姜飛1，2

（1云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)與種質(zhì)資源研究所，云南省農(nóng)業(yè)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，農(nóng)業(yè)部西南作物基因資源與種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南昆明 650223；2云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，云南昆明 650201；3西南大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，重慶 400715）

摘 要：為了探索魔芋對(duì)不同水平鉀素營(yíng)養(yǎng)的反應(yīng)機(jī)制，提取施用低、中、高水平硫酸鉀5 d后的富源花魔芋葉片總RNA，合成了cDNA，采用優(yōu)化的cDNA-SRAP技術(shù)體系分析了在低鉀、中鉀、高鉀水平下富源花魔芋葉片的差異表達(dá)基因，并對(duì)其進(jìn)行了生物信息學(xué)分析。結(jié)果顯示：29對(duì)引物組合共擴(kuò)增出507條基因片段，其中差異片段126條。相對(duì)于中鉀處理，低鉀、高鉀處理的差異片段包括抑制型表達(dá)片段19條，誘導(dǎo)型表達(dá)片段14條，上調(diào)表達(dá)型片段29條，下調(diào)表達(dá)型片段64條。選取表達(dá)量高的13條差異片段進(jìn)行回收測(cè)序，并在NCBI上進(jìn)行BLAST比對(duì)，共比對(duì)出9條差異片段的同源序列，其中4條與已知功能基因（谷氨酰胺酰-tRNA 合成酶、β-ATP合成酶、GTP結(jié)合蛋白、核苷酸還原酶）有較高同源性，5條與假定基因或預(yù)測(cè)基因同源性較高，剩余序列未找到同源序列，可能是一些新的魔芋與鉀營(yíng)養(yǎng)吸收利用相關(guān)的基因，具體功能還有待于進(jìn)一步研究。

關(guān)鍵詞：富源花魔芋；cDNA-SRAP；基因表達(dá)；鉀水平

曾黎瓊，女，研究員，專業(yè)方向：農(nóng)作物生物技術(shù)，E-mail：liqiongzeng@sina.com

魔芋（Amorphophallus konjac）是天南星科魔芋屬多年生草本植物，球莖富含葡甘露聚糖，是我國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)作物，在食品、醫(yī)藥、環(huán)保、化工、建筑等領(lǐng)域有著廣泛的用途。富源花魔芋是云南魔芋生產(chǎn)中的主栽品種，段玉云等（2015）研究表明，富源花魔芋是一種喜鉀作物，對(duì)鉀素營(yíng)養(yǎng)有較強(qiáng)的吸收能力，鉀素營(yíng)養(yǎng)水平影響其產(chǎn)量和品質(zhì)。

SRAP （sequence-related amplified polymorphism）即相關(guān)序列擴(kuò)增多態(tài)性，該技術(shù)操作簡(jiǎn)便、重復(fù)性好，近年來廣泛應(yīng)用于植物遺傳多樣性分析、分子遺傳圖譜構(gòu)建、重要性狀基因定位、親緣關(guān)系鑒定、分子標(biāo)記輔助選育等方面（Yves et al．，2010；Muhammad et al．，2011；盧超 等，2014）。cDNASRAP技術(shù)目前已在甘蔗（吳建明 等，2010）、蠟梅（趙凱歌 等，2012）、棉花（陳沙沙 等，2013）、甘藍(lán)（張?jiān)葡?等，2014）等作物的基因表達(dá)分析中得到應(yīng)用，成為了一種新的轉(zhuǎn)錄基因組學(xué)研究工具。本試驗(yàn)以云南魔芋主栽品種富源花魔芋為材料，利用cDNA-SRAP技術(shù)研究在低鉀、高鉀脅迫下展葉期富源花魔芋基因表達(dá)差異性，為篩選和鑒定富源花魔芋鉀高效吸收利用基因、認(rèn)識(shí)魔芋鉀營(yíng)養(yǎng)吸收利用的分子機(jī)制以及魔芋的生物技術(shù)育種奠定基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

供試富源花魔芋：采自云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)與種質(zhì)資源研究所溫室，種植方式為盆栽。試驗(yàn)藥劑：RNAprep Pure多糖多酚植物總RNA提取試劑盒、FastQuant cDNA第一鏈合成試劑盒、Marker DL 2000購(gòu)于天根生化科技（北京）有限公司；dNTP、Taq聚合酶購(gòu)于Thermo公司；引物（表1）由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，其他一般試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。主要試驗(yàn)儀器：離心機(jī)（Eppendorf 5417R），DNA擴(kuò)增儀（Biometra Tprofessional PCR儀），電泳儀（北京六一DYY-6C型號(hào)），凝膠成像系統(tǒng)（Syngene GeneGenius），紫外分光光度計(jì)（Thermo NanoDrop 2000分光光度計(jì)）。

表1 引物序列

1.2試驗(yàn)方法

試驗(yàn)于2014年4月20日在云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)與種質(zhì)資源研究所溫室中進(jìn)行富源花魔芋盆栽種植，根據(jù)段玉云等（2015）對(duì)富源花魔芋不同時(shí)期植株含鉀量及其對(duì)鉀肥利用效率的分析研究結(jié)果，本試驗(yàn)選擇在富源花魔芋生長(zhǎng)（基質(zhì)培）至展葉期時(shí)，澆施高（K2SO4施用量為6.6 g·株-1）、中（K2SO4施用量為4.4 g·株-1）、低（K2SO4施用量為2.2 g·株-1）不同水平硫酸鉀，每處理重復(fù)3次，每重復(fù)5株，5 d后每個(gè)處理分別采集5株植株復(fù)葉的中部葉片，液氮速凍后于-70 ℃保存。

1.2.1RNA的提取和cDNA的合成 采用RNAprep Pure多糖多酚植物總RNA提取試劑盒提取花魔芋葉片總RNA，利用超微紫外分光光度計(jì)測(cè)定RNA濃度，用濃度為1%的瓊脂糖凝膠電泳分析其純度；用FastQuant cDNA第一鏈合成試劑盒合成cDNA第一鏈。嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行操作。

1.2.2cDNA-SRAP反應(yīng)體系的建立 采用單因素變量分析方法分別對(duì)cDNA用量、Mg2+濃度、引物濃度、dNTP濃度和Taq酶用量進(jìn)行cDNA-SRAP反應(yīng)體系的優(yōu)化，優(yōu)化時(shí)選用ME4/EM4引物組合。在20 μL的反應(yīng)體系中：cDNA用量梯度設(shè)為50、100、150、200 ng；Mg2+濃度梯度設(shè)為1.5、2.0、2.5、3.0 mmol·L-1；引物濃度梯度設(shè)為0.2、0.3、0.4、0.5 μmol·L-1；dNTP濃度梯度設(shè)為0.15、0.20、0.25、0.30 mmol·L-1；Taq酶用量分別為0.5、1.0 、1.5、2.0 U。cDNA-SRAP PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃ 4 min；94 ℃ 45 s，33 ℃ 45 s，72 ℃ 45 s 5個(gè)循環(huán)；94 ℃ 45 s，50 ℃ 45 s，72 ℃ 45 s 30個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸5 min。反應(yīng)結(jié)束后4 ℃保存，擴(kuò)增產(chǎn)物采用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.2.3花魔芋差異表達(dá)基因的cDNA-SRAP分析

用優(yōu)化的cDNA-SRAP反應(yīng)體系對(duì)低鉀、中鉀、高鉀3個(gè)處理的富源花魔芋樣品進(jìn)行分析。cDNASRAP PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序同1.2.2。擴(kuò)增產(chǎn)物采用6%聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)。

1.2.4差異片段的克隆、測(cè)序分析 將差異片段從聚丙烯酰胺凝膠上切下回收，加入30 μL ddH2O，室溫放置24 h后取10 μL作為模板再次進(jìn)行PCR擴(kuò)增，所用引物和程序與最初反應(yīng)相同。采用1%瓊脂糖凝膠檢測(cè)產(chǎn)物是否與原片斷大小相同，選取與原片段大小相同的目的條帶的PCR產(chǎn)物送生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。

2　結(jié)果與分析

2.1花魔芋RNA的質(zhì)量和cDNA質(zhì)量

花魔芋RNA的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示（圖1）：低鉀、中鉀、高鉀3種處理樣品的RNA 28S、18S帶型清晰整齊、完整性好，經(jīng)測(cè)定RNA的OD260/280值均在1.8～2.0之間，說明提取的RNA純度高、質(zhì)量好。

圖1 花魔芋RNA瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果

用cDNA第一鏈合成試劑盒合成了花魔芋cDNA第一鏈，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果顯示：低鉀、中鉀、高鉀3種處理樣品在100～2 000 bp之間均有彌散帶，說明合成的cDNA質(zhì)量好。

2.2花魔芋cDNA-SRAP反應(yīng)體系的建立

根據(jù)單因素變量分析法優(yōu)化cDNA-SRAP反應(yīng)體系結(jié)果可知，花魔芋最佳的cDNA-SRAP反應(yīng)體系（20 μL）為：cDNA模板用量150 ng，Mg2+濃度為2.0 mmol·L-1，引物濃度為0.3 μmol·L-1，dNTP濃度為0.25 mmol·L-1，Taq酶用量為1.0 U。

2.3不同鉀水平下花魔芋的差異表達(dá)基因分析

以低鉀、中鉀、高鉀3種處理樣品合成的cDNA為模板，用建立的最佳反應(yīng)體系進(jìn)行SRAPPCR擴(kuò)增。如圖2所示，分別以ME4/EM3、ME4/EM4、ME4/EM5、ME4/EM6為引物，低鉀、中鉀、高鉀3種處理共擴(kuò)增出差異條帶13條。試驗(yàn)所用的29對(duì)引物組合共擴(kuò)增出507條片段，其中差異片段126條。相對(duì)中鉀處理，低鉀、高鉀處理的差異片段包括抑制型表達(dá)片段19條，誘導(dǎo)型表達(dá)片段14條，上調(diào)表達(dá)型片段29條，下調(diào)表達(dá)型片段64條。

圖2 花魔芋cDNA-SRAP聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果

2.4差異表達(dá)基因片段的序列分析

選取條帶亮、表達(dá)量高的13條差異片段進(jìn)行回收測(cè)序，測(cè)序結(jié)果在NCBI上進(jìn)行BLAST同源性比對(duì)分析，共比對(duì)出9條差異片段的同源序列（表2），其中4條差異表達(dá)核苷酸序列與已知功能基因（谷氨酰胺酰-tRNA 合成酶、β-ATP合成酶、GTP結(jié)合蛋白、核苷酸還原酶）有較高同源性，5條序列與假定基因或預(yù)測(cè)基因同源性較高，剩余序列未找到同源序列，可能是一些新的魔芋與鉀營(yíng)養(yǎng)相關(guān)基因，具體功能有待進(jìn)一步研究。

表2 花魔芋差異表達(dá)基因片段的同源性分析

3　結(jié)論與討論

cDNA-SRAP是一種無需任何序列信息即可進(jìn)行差異表達(dá)研究的新技術(shù)，通過一對(duì)引物對(duì)開放讀碼框（ORFs）進(jìn)行擴(kuò)增，正向引物為17個(gè)堿基，其中的CCGG序列目的是與位于富含GC區(qū)域的開放讀碼框中的外顯子進(jìn)行特異結(jié)合；反向引物為18個(gè)堿基，其中的AATT序列可以對(duì)富含AT的內(nèi)含子區(qū)域和啟動(dòng)子區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增。SRAP產(chǎn)生共顯性標(biāo)記的效率遠(yuǎn)大于其他標(biāo)記技術(shù)，而且步驟較少，操作相對(duì)簡(jiǎn)單，成本較低，花費(fèi)時(shí)間少。cDNA-SRAP技術(shù)在棉花（陳沙沙 等，2013）、甘蔗（吳建明 等，2010）、甘藍(lán)（張?jiān)葡?等，2014）、蠟梅（趙凱歌 等，2012）等作物基因表達(dá)分析中的應(yīng)用，證明了此技術(shù)是行之有效的。

富源花魔芋是云南魔芋生產(chǎn)上的主栽品種。段玉云等（2015）的研究發(fā)現(xiàn)，展葉期富源花魔芋對(duì)適量鉀素營(yíng)養(yǎng)有很好的吸收利用效率。施用適量鉀素營(yíng)養(yǎng)有利于提高葉片葉綠素、可溶性蛋白和可溶性糖含量，增強(qiáng)了葉片SOD、 CAT、 POD活性，降低了魔芋葉片MDA含量，對(duì)魔芋抗氧化酶系統(tǒng)以及膜脂過氧化系統(tǒng)有一定的生理效果，增強(qiáng)了魔芋植株抵抗逆境和抗衰老的能力，進(jìn)而影響了葉片的光合作用和同化產(chǎn)物的合成、轉(zhuǎn)化和運(yùn)輸，從而獲得了魔芋的高產(chǎn)（待發(fā)表）。本試驗(yàn)利用優(yōu)化的cDNA-SRAP技術(shù)最終得到花魔芋最佳cDNA-SRAP反應(yīng)體系（20 μL）：cDNA模板150 ng、Mg2+濃度為2.0 mmol·L-1、引物濃度0.3 μmol·L-1、dNTP濃度0.25 mmol·L-1、Taq酶用量1.0 U，并初步分析了展葉期施用不同量硫酸鉀5 d后富源花魔芋葉片的差異表達(dá)基因，表明不同鉀水平下富源花魔芋的基因表達(dá)存在差異，這些差異表達(dá)基因的具體功能有待于進(jìn)一步分析研究。

下一步可以通過與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序等分析結(jié)果的比較篩選以及生物信息學(xué)的分析研究，結(jié)合RTPCR、RACE等技術(shù)對(duì)得到的新候選基因轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行時(shí)空表達(dá)研究和全長(zhǎng)序列克隆，為認(rèn)識(shí)魔芋鉀吸收利用的分子機(jī)制和魔芋鉀高效吸收利用基因的發(fā)掘奠定基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)

陳沙沙，樊洪泓，關(guān)蕾，林毅，蔡永萍，錢森和，孫旭．2013．光質(zhì)對(duì)離體誘導(dǎo)棕色棉纖維基因表達(dá)影響的cDNA-SRAP分析．棉花學(xué)報(bào)，26（1）：34-40．

段玉云，董坤，王片吉，謝勇，李萍仙，盧俊，李勝，曾黎瓊，潘開華．2015．富源花魔芋對(duì)不同硝酸鉀施用量的吸收利用．西南農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)， 28（4）：1697-1701．

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Differential Genes Expression Analysis of Amorphophallus konjac Plants Growing under Different Potassium Levels

ZENG Li-qiong1，HAN Rong-rong1，2，3，DUAN Yu-yun1，CHEN Ling1，WEN Yi-fu2，LI E-xian1，JIANG Fei1，2
（1Biotechnology & Germplasm Resources Institute，Yunnan Academy of Agricultural Sciences，Key Lab of Agricultural Biotechnology of Yunnan Province，Key Lab of Southwestern Crop Gene Resource and Germplasm Innovation，Ministry of Agriculture，Kunming 650223，Yunnan，China；2College of Animal Science and Technology，Yunnan Agricultural University，Kunming 650201，Yunnan，China；3College of Animal Science and Technology，Southwest University，Chongqing 400715，China）

Abstract：In order to investigate the response mechanism of Amorphophallus konjac plants growing under different potassium levels，the total RNA of the leaves of Amorphophallus konjac Fuyuan on the fifth day after potassium sulfate（low，medium and high level）was applied．Then cDNA was synthesized，and the differentially expressed genes of Amorphophallus konjac Fuyuan leaves under low，medium and high potassium sulfate were amplified by optimized cDNA-SRAP，and their bioinformatics was analyzed．The results showed that 507 gene segments were amplified by 29 pairs primer combinations，including 126 differentially expressed gene segments．Compared with the medium potassium level，19 inhibited expressed fragments，14 induced expressed fragments，29 up-regulated expressed fragments，and 64 down-regulated expressed fragments were found in the low and high potassium levels．After recycling 13 differentially expressed gene segments of good quantity，9 homologous sequences matched with them in NCBI．Except for 4 nucleotide sequences matching with higher homology to the known function genes (glutaminyl-tRNA synthetase，β-ATP synthase，YchFGTP-binding protein YchF，ribonucleotide reductase) and 5 nucleotide sequences matching with higher homology to the assumption genes or the predict genes，other differentially expressed gene segments were not found，which might be some new genes of Amorphophallus konjac Fuyuan associated with potassium nutrition uptake．The specific function of the new genes will be further studied and analyzed in the future．

Key words：Amorphophallus konjac Fuyuan；cDNA-SRAP；Gene expression；Potassium level

收稿日期：2015-10-14；接受日期：2016-02-26