劉思穎，鄺棗園，張韌，謝偉群，陳健

（1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院研究生部，廣東廣州　510006；2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，廣東廣州　510006）

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黃芩苷對代謝性炎癥及腸道菌群的調(diào)節(jié)作用探討

劉思穎1，鄺棗園2，張韌2，謝偉群1，陳健1

（1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院研究生部，廣東廣州510006；2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，廣東廣州510006）

摘要：【目的】探討黃芩苷對高脂血癥模型代謝性炎癥及腸道菌群的調(diào)節(jié)作用?！痉椒ā窟x取32只C57BL/6J雄性小鼠隨機(jī)平均分為正常組、模型組、黃芩苷高劑量組（劑量為50 mg·kg-1·d-1）、黃芩苷低劑量組（劑量為25 mg·kg-1·d-1）。高脂飼料喂養(yǎng)3周后，2個黃芩苷用藥組分別給予不同濃度黃芩苷灌胃5周。采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測各組小鼠血清血脂水平以及腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）及內(nèi)毒素水平，采用Miseq平臺對小鼠腸道糞便微生物進(jìn)行基因測序?！窘Y(jié)果】與正常組比較，模型組總膽固醇及低密度脂蛋白水平顯著升高（P<0.01），高密度脂蛋白水平顯著降低（P<0.01），血清TNF-α、IL-6和內(nèi)毒素水平顯著升高（P＜0.01）；黃芩苷高劑量組的TNF-α、IL-6、內(nèi)毒素水平均較模型組顯著降低（P＜0.05或P＜0.01），黃芩苷低劑量組內(nèi)毒素水平亦較模型組顯著降低（P＜0.01）。測序生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，在門的水平，模型組脫鐵桿菌門和變形桿菌門數(shù)目較正常組顯著增多，疣微菌門數(shù)目較正常組顯著減少。在屬的水平，模型組Christensenella、uncultured_ Peptococcaceae、脫硫弧菌屬數(shù)目較正常組顯著增多，而糞球菌屬、Akkermansia及uncultured_Lachnospiraceae數(shù)目較正常組顯著減少；黃芩苷高、低劑量組脫硫弧菌屬豐度均較模型組降低。各組革蘭氏陰性菌與革蘭氏陽性菌數(shù)目之比，模型組較正常組顯著升高（P＜0.05），黃芩苷低劑量組較模型組顯著降低（P＜0.05）?！窘Y(jié)論】黃芩苷能治療高脂飲食引起的代謝性炎癥，這可能與黃芩苷能調(diào)節(jié)腸道菌群的結(jié)構(gòu)有關(guān)。

關(guān)鍵詞：黃芩苷；代謝性炎癥；腸道菌群；革蘭氏陰性菌

目前，高脂飲食以及缺乏鍛煉的不良生活方式逐漸影響著人類的健康。研究表明：長期高脂飲食、體內(nèi)營養(yǎng)過剩容易引起高脂血癥，患者長期處于炎癥的狀態(tài)，則腸道菌群的結(jié)構(gòu)也會發(fā)生改變，這些異常與許多疾病的發(fā)生密切相關(guān)［1-4］。中藥黃芩提取出的單體黃芩苷具有一定的抗炎功效［5-6］。因此，本研究觀察了黃芩苷對高脂飲食引起的小鼠高脂血癥模型代謝性炎癥及腸道菌群結(jié)構(gòu)紊亂的作用，初步探討黃芩苷抗代謝性炎癥的機(jī)制，現(xiàn)報道如下。

1　材料與方法

1.1動物與飼料C57BL/6J小鼠，SPF級，雄性，體質(zhì)量17～20 g，合格證號：SCXK（粵）2013-0002，由廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心提供。喂養(yǎng)于廣州中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心SPF級實驗室，實驗許可證號：SYXK（粵）2013-0085。小鼠高脂飼料由廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心配制，配方質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別是：常規(guī)飼料83%、豬油10%、蛋黃粉5%、膽固醇1.5%；膽鹽0.5%。

1.2藥物、試劑及儀器黃芩苷（中國食品藥品檢定研究院，批號：110715-201318）；總膽固醇（TC）測試盒（批號：20150929）、高密度脂蛋白（HDL）測試盒（批號：20150930）、低密度脂蛋白（LDL）測試盒（批號：20150919）均購自南京建成生物工程研究所；腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）及內(nèi)毒素酶聯(lián)免疫吸附檢測試劑盒均購自北京誠林生物科技有限公司；糞便DNA提取試劑盒（德國Qiagen公司，批號：151024773）。多通道移液器（德國Eppendorf公司，型號：30-300uL）；分析天平（德國Sartorius公司，型號：BS124S）；高速冷凍離心機(jī)（湖南赫西儀器裝備有限公司，型號：3H24RI）；多標(biāo)記微孔板檢測儀（美國PerkinElmer公司，型號：Enspire）。

1.3動物分組、造模與給藥取C57BL/6J雄性小鼠32只適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，按體質(zhì)量隨機(jī)分為4組，分別為正常組、模型組、黃芩苷高劑量組和黃芩苷低劑量組，每組8只，遂開始實驗。除正常組小鼠日常喂以常規(guī)飼料外，其他組小鼠均日常給予高脂飼料喂養(yǎng)以造高脂血癥模型。當(dāng)實驗進(jìn)行到第4周時開始每日定時1次灌胃干預(yù)，正常組與模型組均灌胃0.5 mL/d/只無菌生理鹽水；黃芩苷高劑量組灌胃黃芩苷50 mg·kg-1·d-1（臨床等效量的10倍）；黃芩苷低劑量組灌胃黃芩苷25 mg·kg-1·d-1（臨床等效量的5倍）；黃芩苷均用無菌生理鹽水稀釋。連續(xù)灌胃5周后，將小鼠麻醉摘眼球取血后處死，并無菌操作取其盲腸部糞便。

1.4血脂及IL-6、TNF-α、內(nèi)毒素指標(biāo)檢測用無菌、無熱源的EP管取得血液，室溫靜置1 h后，于4℃、3 000 r/min離心20 min，吸取上層血清，分裝保存于-80℃，分別按試劑盒操作說明測定TC、HDL與LDL水平。采用酶聯(lián)免疫吸附試驗嚴(yán)格按照試劑盒說明書測定血清中IL-6、TNF-α、內(nèi)毒素的濃度，內(nèi)毒素檢測時運用的各種實驗耗材均為無熱源產(chǎn)品。

1.5糞便菌群的基因組DNA提取與PCR擴(kuò)增將各組小鼠腸道新鮮糞便放入無菌凍存管-80℃凍存，依照試劑盒說明書步驟提取小鼠糞便菌群的基因組DNA。利用Qubit2.0 DNA檢測試劑盒對基因組DNA精確定量后，采用引物341F 5’-CCTACGGGNGGCWGCAG-3’，785R 5’-GACTACHV GGGTATCTAATCC-3’，擴(kuò)增細(xì)菌16S rDNA的V3-V4區(qū)。PCR反應(yīng)體系為：5×FastPfu緩沖液4 μL、2.5 mmol/L脫氧核糖核苷三磷酸（dNTP）2 μL、5 μmol/L的正向引物0.8 μL、5 μmol/L的反向引物0.8 μL、FastPfu多聚酶0.4 μL、DNA 10 ng，加ddH2O至總體積20 μL。PCR反應(yīng)條件為：1×（3 min、95°C）；32×（30 s、95℃；30 s、55℃；45 s、72℃）；10 min，72℃、10℃保存。PCR產(chǎn)物上樣3 μL用20 g/L瓊脂糖凝膠80 V恒壓，40 min電泳以鑒定結(jié)果。對DNA進(jìn)行回收，回收產(chǎn)物用Qubit 2.0定量，根據(jù)測得的DNA濃度，將所有樣品按照1∶1的比例進(jìn)行混合；混合后充分震蕩均勻。該混合樣品接下來用于后續(xù)的樣品建庫（加測序標(biāo)簽）與Miseq高通量測序平臺進(jìn)行高通量測序。

將引物序列、短片段、低復(fù)雜度及低質(zhì)量序列、非靶區(qū)域序列、嵌合體去除后，將高質(zhì)量序列的生物信息學(xué)從以下方面分析：（1）操作分類單元（OTU）分類。將多條序列按其序列間的距離對相似性在97%以上的序列進(jìn)行聚類歸并，生成接近于屬的分類操作單元OTU。（2）采用軟件RDP classifier進(jìn)行物種分類。采用Nave Bayesian assignment算法對每條序列在genus水平上計算其分配到此rank中的概率值，分類閾值為0.8。（3）alpha多樣性分析，采用Coverage、richness、ACE、Chao1、Shannon評估指數(shù)分別對樣本進(jìn)行多樣性分析。（4）Beta多樣性分析，用來比較多組樣本之間的差別度量。（5）比較樣本或組間豐度差異，找出樣本或組間豐度存在顯著差異的菌群。

2　結(jié)果

2.1各組小鼠血脂水平比較表1結(jié)果顯示：模型組小鼠出現(xiàn)了脂代謝紊亂，與正常組比較，模型組總膽固醇及低密度脂蛋白水平顯著升高（P＜0.01），而高密度脂蛋白水平顯著降低（P＜0.01），表明造模成功；黃芩苷高、低劑量組與模型組各項血脂水平比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

表1　各組小鼠血脂水平比較Table 1 Comparison of mouse blood fat levels in various groups　（±s）

表1　各組小鼠血脂水平比較Table 1 Comparison of mouse blood fat levels in various groups?。ā纒）

①P＜0.01，與正常組比較

組別正常組模型組黃芩苷高劑量組黃芩苷低劑量組N8888 ρTC/（mg·dL-1）116.4±18.14 163.18±18.96①163.73±15.89 144.14±15.96 cHDL/（mmol·L-1）8.99±1.62 6.3±1.18①8.35±1.80 7.97±1.30 cLDL/（mmol·L-1）0.22±0.036 0.68±0.119①0.62±0.059 0.65±0.186

2.2各組血清IL-6、TNF-α、內(nèi)毒素水平比較表2結(jié)果顯示：模型組血清IL-6、TNF-α、內(nèi)毒素水平較正常組均顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，黃芩苷高劑量組血清IL-6、TNF-α、內(nèi)毒素水平顯著降低（P＜0.05或P＜0.01），黃芩苷低劑量組內(nèi)毒素水平顯著降低（P＜0.01）。

表2　各組小鼠血清IL-6、TNF-α、內(nèi)毒素水平比較Table 2 Effect of baicalin on serum IL-6，TNF-α and endotoxin in various groups

2.3測序結(jié)果

2.3.1菌群多樣性分析表3結(jié)果顯示：OTUs數(shù)目的變化中，模型組較正常組顯著升高，黃芩苷高劑量組較模型組顯著降低（均P＜0.05）。Shannon指數(shù)主要衡量群落的多樣性，模型組群落多樣性較正常組顯著降低，黃芩苷低劑量組較模型組顯著升高（均P＜0.05）。ACE與Chao1指數(shù)是對菌群物種的總數(shù)評估，數(shù)據(jù)表明模型組較正常組的菌群物種總數(shù)大，2個用藥組與模型組無明顯差異。Coverage指數(shù)指各樣品文庫的覆蓋率，正常組、模型組、黃芩苷高劑量組數(shù)值均在0.9以上，黃芩苷低劑量組數(shù)值稍低，說明樣本序列中未被測出的概率較低。β分析得到UniFrac距離如圖1，樣本間相距越遠(yuǎn)則菌群差異越大?？梢钥闯?，正常組與模型組菌群組內(nèi)差異均較小，2組的組間差異在4組中最大；黃芩苷高劑量組與黃芩苷低劑量組菌群組內(nèi)差異均較大，與其余2組組間比較的差異沒有一定的規(guī)律性。

表3　各組小鼠腸道菌群多樣性指數(shù)Table 3 The mouse intestinal flora diversity indexes in various groups

2.3.2物種豐度差異門水平的豐度比較見圖2，模型組脫鐵桿菌門（Deferribacteres）和變形桿菌門（Proteobacteria）數(shù)目較正常組增多，疣微菌門（Verrucomicrobia）數(shù)目較正常組減少。屬水平的豐度比較見圖3，模型組Christensenella、uncultured_ Peptococcaceae、脫硫弧菌屬（Desulfovibrio）數(shù)目明顯較正常組升高，而糞球菌屬（Coprococcus）、Akkermansia及uncultured_Lachnospiraceae較正常組減少；黃芩苷高劑量組及黃芩苷低劑量組脫硫弧菌屬（Desulfovibrio）豐度均較模型組降低。統(tǒng)計豐度最大的前50個菌屬（豐度排在50后的菌所占數(shù)目比例很小，暫忽略不計），各組的革蘭氏陰性菌與革蘭氏陽性菌之比（p）均數(shù)見圖4，結(jié)果顯示：模型組陰性菌/陽性菌顯著高于正常組（P＜0.05），黃芩苷低劑量組陰性菌/陽性菌顯著低于模型組（P＜0.05）。

圖1　各樣品UniFrac距離Figure 1 Weighted UniFrac distance of various samples

圖2　各組小鼠腸道菌群門水平豐度比較Figure 2　Comparison of abundance of mice intestinal flora at phylum level in various groups

圖3　各組小鼠腸道菌群屬水平豐度比較Figure 3 Comparison of abundance of mouse intestinal flora at genus level in various groups

圖4　各組小鼠腸道菌群中革蘭氏陰性菌與陽性菌的比例Figure 4　The ratio of gram-negative bacteria to grampositive bacteria of mouse intestinal flora in various groups

3　討論

眾多研究已證實，高脂血癥患者長期體內(nèi)存在代謝性炎癥，這是由攝入營養(yǎng)物和代謝過剩觸發(fā)的一種低程度、慢性的系統(tǒng)性炎癥。長期的高脂飲食會導(dǎo)致腸道上皮細(xì)胞損傷、滲透性增加，腸道微生物的結(jié)構(gòu)改變，細(xì)菌和（或）細(xì)菌內(nèi)毒素大量進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)，炎癥因子IL-6、TNF-α分泌增加，最終導(dǎo)致代謝性炎癥的發(fā)生［1-4］。黃芩苷抗炎效果顯著，王敏等［7］曾發(fā)現(xiàn)黃芩苷能降低ApoE基因敲除小鼠血清中TNF-α水平。在本研究中，高脂飲食后的小鼠血清IL-6、TNF-α及內(nèi)毒素水平顯著升高，經(jīng)黃芩苷干預(yù)后，高劑量組此3項指標(biāo)顯著降低，低劑量組內(nèi)毒素水平顯著降低，表明黃芩苷針對C57BL/6J小鼠單純高脂飲食導(dǎo)致的炎癥反應(yīng)有明顯改善作用。

有研究［8］發(fā)現(xiàn)，硫酸鹽還原菌的代謝產(chǎn)物會破壞腸屏障，誘導(dǎo)炎癥的發(fā)生。本研究對各組小鼠腸道微生物基因測序發(fā)現(xiàn)，與正常組比較，高脂模型小鼠腸道中屬于硫酸鹽還原菌類的uncultured_ Peptococcaceae及脫硫弧菌屬（Desulfovibrio）增多；同時抗炎細(xì)菌［9］Akkermansia減少；而Christensenella、糞球菌屬（Coprococcus）及uncultured_Lachnospiraceae在高脂誘導(dǎo)下的變化尚未見其它文獻(xiàn)報道，具體原因有待進(jìn)一步研究。此外，本研究發(fā)現(xiàn)黃芩苷對高脂飲食后的菌群結(jié)構(gòu)能起到一定調(diào)節(jié)作用。2種劑量黃芩苷均能降低脫硫弧菌屬（Desulfovibrio）的數(shù)目，并且低劑量黃芩苷能降低革蘭氏陰性菌的比例。Cani等［10］提出高脂飲食引起的內(nèi)毒素升高，可能與腸道內(nèi)革蘭陰性菌的增加有關(guān)。因此，本課題組推測，黃芩苷能通過調(diào)節(jié)腸道菌群結(jié)構(gòu)，降低腸道革蘭氏陰性菌與陽性菌之比，減少內(nèi)毒素入血以及炎性因子的分泌，從而減輕代謝性炎癥。又因為代謝性炎癥的水平受到腸道免疫系統(tǒng)、腸通透性、腸道菌群等多方面因素的影響［1-4］。因此，相對于模型組，低劑量黃芩苷能降低革蘭氏陰性菌與陽性菌的比例，但對于IL-6、TNF-α無明顯調(diào)節(jié)作用，高劑量黃芩苷不能降低革蘭氏陰性菌比例，而降低了內(nèi)毒素水平，這些情況可能是由于其他因素的干預(yù)所致，具體原因還有待進(jìn)一步研究。

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【責(zé)任編輯：黃玲】

·中藥質(zhì)量與控制·

Regulatory Effect of Baicalin on Metaflammation and Intestinal Flora

LIU Siying1，KUANG Zaoyuan2，ZHANG Ren2，XIE Weiqun1，CHEN Jian1
（1.Dept.of Postgraduate Affairs，Guangzhou University of Chinese Medicine，Guangzhou 510006 Guangdong，China；2.College of Fundamental Medical Science，Guangzhou University of Chinese Medicine，Guangzhou 510006 Guangdong，China）

Abstract：Objective To observe the regulatory effect of baicalin on metaflammation and intestinal flora of hyperlipidemic mouse model.Methods Thirty-two male C57BL/6J mice were randomly divided into 4 groups，namely normal group，model group，low- and high-dose baicalin groups（25，50 mg·kg-1·d-1）.Mice of normal group were fed with ordinary forage and mice of model group were fed with high-fat forage for 8 weeks.Mice of low- and high-dose group were given gastric gavage of different concentrations of baicalin for 5 weeks after fed with high-fat forage for 3 weeks.Blood lipid，tumor necrosis factor（TNF-α），interleukin 6（IL-6）and endotoxin levels in the serum were determined by enzyme-linked immunosorbent assay（ELISA）.Gene sequencing of enteric microorganism was conducted by Miseq system.Results The total cholesterol and low-density lipoprotein of model group were significantly higher（P<0.01），high-density lipoprotein was lower（P<0.01），and TNF-α，IL-6 and endotoxin were notably higher（P<0.01）than those of the normal group.Compared with the model group，TNF-α，IL-6 and endotoxin of high -dose baicalin group were decreased（P<0.05 or P<0.01），and endotoxin level of low -dose baicalin group was also decreased（P<0.01）.Bioinformatics analysis results indicated that the abundance of Deferribacteres and Proteobacteria of model group was significantly higher at phylum level，while the abundance of Verrucomicrobia was significantly lower than that of the normal group.At Genus level，the abundance of Christensenella，uncultured_Peptococcaceae and Desulfovibrio of the model group was significantly higher，while the abundance of Coprococcus，Akkermansia and uncultured_Lachnospiraceae was significantly lower than that of the normal group.The abundance of Desulfovibrio of both low- and high-dose baicalin groups was lower than that of the model group.The ratio of gram-negative bacterium to gram-positive bacterium of the model group was increased as compared with the normal group（P＜0.05），while that of low-dose baicalin group was decreased significantly compared with the model group（P＜0.05）.Conclusion Baicalin has therapeutic effect on metaflammation caused by high fat diet，and its mechanism is probably related with the regulatory effect of intestinal flora.

Key words：baicalin；metaflammation；intestinal flora；gram-negative bacterium

中圖分類號：R285.5

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1007-3213（2016）03 - 0372 - 05

DOI：10．13359/j．cnki．gzxbtcm．2016．03．021

收稿日期：2016-01-30

作者簡介：劉思穎（1990-），女，碩士研究生；E-mail：xiaoying106@foxmail.com

通訊作者：鄺棗園，女，教授；E-mail：zyhuang@gzucm.edu.cn

基金項目：廣州中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)基礎(chǔ)理論重點學(xué)科資助項目