錢益平，郭同，陳祥釗，唐　勇，申昌德，許祖波，李　勛，范小林

(贛南師范學院 化學化工學院，江西 贛州　341000)

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噁二唑-2-氧化物合成及抗日本血吸蟲尾蚴活性* 1

錢益平?，郭同，陳祥釗，唐勇，申昌德，許祖波，李勛，范小林

(贛南師范學院 化學化工學院，江西 贛州341000)

摘要：以苯丙烯醇為原料合成噁二唑-2-氧化物，并對其進行結構表征確認，評價其抗日本血吸蟲尾蚴活性.結果表明，噁二唑-2-氧化物具有不同程度的殺滅尾蚴活性，其中4-苯基-1,2,5-噁二唑-3-醛基-2-氧化物殺滅尾蚴活性最好.

關鍵詞：噁二唑-2-氧化物；日本血吸蟲；尾蚴；活性

1引言

血吸蟲病是一種流行于熱帶和亞熱帶地區(qū)、嚴重危害人民身體健康、影響經(jīng)濟社會發(fā)展的重大傳染病.血吸蟲的種類很多，人體常見的血吸蟲主要三種：日本血吸蟲、曼氏血吸蟲，埃及血吸蟲，在我國流行的主要是日本血吸蟲[1].血吸蟲的生活史主要包括7個主要階段：成蟲、卵、毛蚴、母胞蚴、子胞蚴、尾蚴和童蟲.尾蚴是感染人畜的唯一階段，也是血吸蟲生命周期中最脆弱階段[1-2].因此，尾蚴的防治是控制血吸蟲病傳播的重要環(huán)節(jié)，殺滅了尾蚴，就消除了感染威脅.化學藥物是目前殺滅尾蚴最有效手段之一，主要有吡喹酮、氯硝柳胺、硝苯柳胺和五氯酚鈉等[2].

一氧化氮(NO)是一種活性氧自由基分子，具有多種生物學效用的功能分子，特別是，NO與一般的生物效應分子不同，NO無需與特異性蛋白受體結合，可借助其良好的脂溶性快速直接進入病原體體內(nèi)發(fā)揮殺滅作用[3-4].近年來，發(fā)現(xiàn)NO對血吸蟲成蟲、童蟲和尾蚴具有抑制和殺滅作用[5].在自然環(huán)境狀態(tài)下，不存在足以導致尾蚴死亡的NO水平，但在尾蚴以外的其它寄生階段(如中間宿主釘螺體內(nèi)、終宿主哺乳動物體內(nèi))均存在能夠生成NO的合成酶，能夠釋放NO起到防治尾蚴感染，甚至殺滅尾蚴[5].

NO是一種氣體分子，難以直接作為藥物使用.[6]NO供體是外源性補充NO的主要方式之一，其中噁二唑-2-氧化物是一類獨特的NO供體，在較低濃度時具有很好的NO釋放能力，已經(jīng)被廣泛應用于NO藥物研究中.[6]目前尚無噁二唑-2-氧化物殺滅尾蚴活性的相關報道.因此，本文以苯丙烯醇為原料合成了一系列的噁二唑-2-氧化合物，評價了其殺滅尾蚴活性.

2實驗部分

2.1儀器與試劑

主要儀器 Bruker Advance 400型核磁共振儀(瑞士Bruker公司)；SMZ 180系列體式顯微鏡(江西省鳳凰光學集團有限公司)；DHJF-4005低溫攪拌反應器(鄭州長城科工貿(mào)有限公司).

主要試劑 肉桂醇、鹽酸羥胺和二氧化錳購于阿拉丁試劑公司，亞硝酸鈉購于天津科密歐試劑公司，其它溶劑均為分析純.

日本血吸蟲陽性釘螺購自江蘇省血吸蟲病防治研究所.

2.2目標化合物的合成與表征

目標化合物的合成路線見圖1.以肉桂醇為起始原料，在亞硝酸鈉的作用下合成化合物2，再二氧化錳氧化生成化合物3，進一步與羥胺加成生成化合物4，然后與二氯亞砜反應合成化合物5，所有的中間產(chǎn)物及最終產(chǎn)物結構都經(jīng)過NMR和MS等表征確認.

圖1　化合物合成路線(a)NaNO2, CH3COOH, rt; (b) MnO2, DCM, rt; (c) NH2OH·HCl, CH3COONa, EtOH, 80 ℃; (d) SOCl2, DMF, 0 ℃.

化合物2的合成[7]：稱取肉桂醇6.7 g(50 mmol)于100 mL圓底燒瓶中，加入20 mL冰醋酸溶解，向反應液中緩慢滴加NaNO2(100 mmol)溶液，室溫攪拌24 h，待反應完成后，用冰水淬滅，反應混合液用乙酸乙酯萃取(20 mL×3)，合并有機層，依次用飽和NaHCO3溶液、蒸餾水和飽和食鹽水洗，最后往有機層加入無水硫酸鈉干燥，減壓濃縮，殘留物采用柱層析色譜分離，洗脫劑為乙酸乙酯和石油醚(V/V=1∶3)，得淡黃色固體3.36 g，產(chǎn)率為35%.1H NMR (400MHz, CDCl3), δ (ppm): 7.80-7.82 (m, 2H), 7.53-7.55 (m, 3H), 4.72 (s, 2H), 3.20 (s, 1H).13C NMR (400 MHz, CDCl3), δ (ppm): 13C NMR (100 MHz, CDCl3), δ (ppm): 156.86, 131.38, 129.41, 127.79, 126.14, 114.90, 53.32.MS (m/z): 192 [M+H]+.

化合物3的合成[7]：稱取1.5 g (7.8 mmol) 化合物2于100 mL圓底燒瓶中，加入30 mL二氯甲烷溶解，加入已活化的二氧化錳10.17 g(117 mmol)，室溫攪拌反應9 h，然后過濾除去二氧化錳固體，并用二氯甲烷潤洗固體殘留物，濾液減壓濃縮，殘留物采用柱層析色譜分離，洗脫劑為乙酸乙酯和石油醚(V/V=1∶5)，得淡黃色固體0.445 g，產(chǎn)率為30%.1H NMR (400 MHz, CDCl3), δ (ppm): 9.98 (s, 1H), 7.90-7.92 (m, 2H), 7.54-7.61 (m, 3H).13C NMR (100 MHz, CDCl3), δ (ppm): 178.22, 154.98, 131.94, 128.99, 128.72, 124.90, 113.69. MS (m/z): 190[M+H]+.

化合物4的合成[7]：稱取0.2 g (1.1 mmol) 化合物3于100 mL圓底燒瓶中，加入20 mL乙醇溶解，用30 mL乙醇溶解鹽酸羥胺0.115 g (1.65 mmol)和醋酸鈉0.09 g (1.1 mmol)并緩慢滴入其中回流6 h，用水淬滅，反應混合液用乙酸乙酯(20 mL×3)萃取，合并有機層并用飽和食鹽水洗滌有機層，最后往有機層加入無水硫酸鈉干燥，減壓濃縮，殘留物采用柱層析色譜分離，洗脫劑為乙酸乙酯和石油醚(V/V=1∶3)，得淡黃色固體0.09 g，產(chǎn)率為40%.1H NMR (400 MHz, DMSO), δ (ppm): 12.45 (s, 1H), 7.91 (s, 1H), 7.76-7.74 (dd, 2H), 7.62-7.53 (m, 3H);13C NMR (100 MHz, CDCl3), δ (ppm): 156.40, 149.96, 135.45, 131.58, 129.29, 129.14, 111.80. MS (m/z): 205[M+H]+.

化合物5的合成[7]：稱取0.08 g (0.39 mmol) 化合物4于圓底燒瓶中，加入5 mL DMF溶解，置于0 ℃下冰浴反應，緩慢滴加氯化亞砜0.12Ml (4 mmol)至反應瓶中并反應過夜，反應完畢后加入冰水淬滅，接著用二氯甲烷(20 mL×3)萃取，合并有機相，分別用飽和的碳酸氫鈉，水和飽和食鹽水洗滌，分出有機層，并往有機層中加入無水硫酸鈉干燥，減壓濃縮，殘留物采用柱層析色譜分離，洗脫劑為乙酸乙酯和石油醚(v/v=1∶3)，得到淡黃色固體0.0387 g，產(chǎn)率為54%.1H NMR (400MHz, CDCl3), δ (ppm): 7.74-7.76 (m, 2H), 7.56-7.61 (m, 3H).13C NMR (100 MHz, CDCl3), δ (ppm): 155.63 (s), 133.07, 130.20, 127.48, 124.42, 107.91. MS (m/z): 187[M+H]+.

2.3滅尾蚴活性評價

分別稱取1 mmol化合物2、3、4和5，加入到1 mL DMSO中進行溶解，配制成1 mM的母液.

實驗當日取陽性釘螺于錐形瓶中，加入去氯水并加以光照，室溫的溫度控制在25 ℃左右，保持逸蚴時間2 h.分別往24孔培養(yǎng)板中加入2 mL去氯水，同時分別移取1 mmol藥液4 μL、8 μL、16 μL和32 μL于培養(yǎng)板中，稀釋后的濃度分別為2 μM、4 μM、8 μM和16 μM.分別向培養(yǎng)板中加入血吸蟲尾蚴，并設含有32 μL DMSO(最大溶解體積)的去氯水空白對照.在顯微鏡下觀察尾蚴的存活數(shù)量.顯微鏡下觀察凡是斷尾、表皮腫脹等情況時視為死亡.

3結果與討論

尾蚴作為血吸蟲生命周期中一個重要階段，容易受到外界刺激，對自由基也更加敏感[4-5].NO是一種自由基，具有較好的抗血吸蟲尾蚴活性，但難以直接作為藥物使用殺滅尾蚴.噁二唑-2-氧化物是一種已知的外源性NO供體，已經(jīng)被廣泛的用于外源性NO藥物研究中[6].本研究合成了4個噁二唑-2-氧化物，評價了其殺尾蚴活性.實驗結果發(fā)現(xiàn)，噁二唑-2-氧化物2-5均具有一定的殺滅尾蚴活性(表1).在同一濃度下(4μM)，化合物3作用1h后殺滅尾蚴活性為5.9%，2h后導致尾蚴死亡率可明顯提高到58.8%，相比1h活性提高了近10倍，4h后可完全殺滅尾蚴(100%)(表1和圖2).表明，化合物3隨作用時間的延長，其殺滅活性顯著提高.這種活性-時間效應現(xiàn)象，在化合物2、4和5殺尾蚴活性中也有不同程度的體現(xiàn).由此說明，噁二唑-2-氧化物對尾蚴致死率隨作用時間的遞增呈現(xiàn)遞增趨勢，具有一定的時間效應.

表1　噁二唑-2-氧化物滅日本血吸蟲尾蚴活性

注：顯微鏡下觀察藥物滅蚴活性.凡是斷尾、表皮腫脹以及解剖針刺激無反應視為死亡.

進一步分析發(fā)現(xiàn)，化合物滅尾蚴活性隨濃度的增加均不同程度上升，但相對提高的不是很明顯.作用濃度為2 μM時，化合物2、3、4和5作用尾蚴4 h后，尾蚴死亡率分別達到12%、100%、23.1%和25%(圖3)，進一步提高作用濃度到8 μM時，尾蚴死亡率分別達到10%、100%、33.3%和41.2%(圖3)，并沒有顯著的提高.實際上，化合物濃度的提高，實質(zhì)是NO濃度的提高.該實驗結果提示，外源性噁二唑-2-氧化物對尾蚴具有殺滅作用，但殺滅活性與使用劑量無明顯的相關性，即可能NO濃度不是影響活性的主要因素.這與外源性NO供體對成蟲的殺滅效果不一致[8].

圖2　化合物3在4 μM時滅尾蚴效果

此外，從化合物殺滅尾蚴整體效果分析可知，在作用劑量4 μM下，作用時間2 h時，化合物2、4和5作用尾蚴的致死率均未超過30%，但化合物3殺滅尾蚴活性可達到58.8%，進一步延長作用時間，化合物2、4和5的致死率雖有所提高，但仍均未超過50%，明顯低于化合物3，而化合物3 在作用4 h可完全殺滅尾蚴(圖4).同樣，在其它作用濃度和時間下，3對尾蚴的殺滅效果同樣明顯好于化合物2、4和5(表1).進一步分析可知，噁二唑-2-氧化物滅尾蚴效果為3>5>4>2.

NO作為殺滅病原體的一種小分子，具體的作用機理尚未完全闡明.一般認為是NO的細胞毒性，如NO能與病原體中某些物質(zhì)反應生成更強的氧化物質(zhì)，如生成超氧陰離子自由基、過氧亞硝基負離子等，導致體內(nèi)過氧化級聯(lián)反應大量發(fā)生，從而造成病原體損傷[9]；此外NO還可引起病原體脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和核酸等亞硝基或硝化，從而使病原體體膜破壞、防御體系失活和DNA斷裂等，進一步引起病原體損傷和死亡[10].化合物3滅尾蚴的藥效最強，這可能是由于C-3位醛基高的親電性，容易與維持尾蚴體表糖腭上的蛋白質(zhì)等物質(zhì)反應，快速破壞了尾蚴體表糖萼結構，導致其不能適應外界環(huán)境，從而導致其快速死亡，具體的原因正在進一步研究中.

圖3　化合物2-5在不同濃度下4 h滅尾蚴效果　　　　　圖4化合物2-5(4 μM)在不同時間下滅尾蚴效果

4結論

本文合成了4種噁二唑-2-氧化物，并進行了核磁、質(zhì)譜表征確認為目標結構，評價了其滅日本血吸蟲尾蚴活性.實驗結果表明，外源性NO供體噁二唑-2-氧化物對日本血吸蟲尾蚴具有較明顯的殺滅效果，其中4-苯基-1,2,5-噁二唑-3-醛基-2-氧化物(3)滅尾蚴活性最好.

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* 收稿日期：2016-04-05

DOI：10.13698/j.cnki.cn36-1037/c.2016.03.009

基金項目：國家自然科學基金項目(21302022)

作者簡介：郭同(1990-)，男，贛南師范學院化學化工學院2013級碩士研究生，研究方向：血吸蟲防治藥物. ? 通訊作者：錢益平(1984-)，男，贛南師范學院化學化工學院講師、博士，研究方向：有機藥物化學.

中圖分類號：O626.27

文獻標志碼：A

文章編號：1004-8332(2016)03-0033-04

Synthesis of Oxadiazole-2-Dxide Analogues as Anti-SchistosomaJaponicumCercaria Agents

QIAN Yiping, GUO Tong, CHEN Xiangzhao,TANG Yong, SHEN Changde, XU Zhubo, LI Xun, FAN Xiaolin

(SchoolofChemistryandChemicalEngineering,GannanNormalUniversity,Ganzhou341000,China)

Abstract:A series of oxadiazoles-2-oxide analogues were synthesized by benzene propylene glycol as raw material, and their structures were confirmed by1H NMR and EI-MS, and their anti-schistosoma japonicum cercaria activities were evaluated. The results showed that the drugs had obvious the activity against schistosoma japonicum cercaria. Among them, the compound 4-phenyl-1,2,5-oxadiazoles-3-aldehyde-2-oxide had a best effect on anti-schistosoma japonicum cercaria.

Key words:oxadiazoles-2-oxides; schistosoma japonicum; cercaria; activity

網(wǎng)絡出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/36.1037.C.20160510.1213.028.html