吐遜·吾守爾（新疆阿瓦提縣畜禽改良站，新疆　阿瓦提　843200）

?

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激基因在牛健康和閉鎖卵泡中的差異表達(dá)研究

吐遜·吾守爾
（新疆阿瓦提縣畜禽改良站，新疆阿瓦提843200）

摘 要：為了初步探究內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在牛卵泡閉鎖過程中起到的作用，實(shí)驗(yàn)采用熒光定量PCR（qRT-PCR）方法對(duì)健康卵泡及閉鎖卵泡中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)基因的表達(dá)情況進(jìn)行了研究。結(jié)果表明：閉鎖卵泡顆粒細(xì)胞中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)基因Atf4，Atf6，Grp78，Grp94，Xbp1，Chop，Caspase12的表達(dá)均顯著高于健康卵泡。說明內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激參與了牛卵泡閉鎖的發(fā)生，為研究牛卵泡閉鎖及卵泡選擇的分子機(jī)制提供了重要參考價(jià)值。

關(guān)鍵詞：內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激；基因表達(dá)；牛卵泡閉鎖；顆粒細(xì)胞凋亡

10.16863/j.cnki.1003-6377.2016.03.004

前言

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（ERS）是指在缺氧、氧化應(yīng)激、異常糖基化反應(yīng)以及鈣離子穩(wěn)態(tài)失衡情況下，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)未折疊的蛋白質(zhì)會(huì)明顯增多，當(dāng)超出內(nèi)質(zhì)網(wǎng)處理能力時(shí)，細(xì)胞激活一些相關(guān)信號(hào)級(jí)聯(lián)合反應(yīng)來應(yīng)對(duì)條件的變化和恢復(fù)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)良好的蛋白質(zhì)折疊環(huán)境。一般用參與非折疊蛋白反應(yīng)（Unfolded Protein Response,UPR）的標(biāo)志性分子來提示ERS的發(fā)生，PERK，IRE-1，ATF6是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的三條信號(hào)通路的重要分子，BiP和XBP-1表達(dá)上調(diào)常被用作ERS的標(biāo)志。研究表明發(fā)生ERS的細(xì)胞能調(diào)節(jié)ERS相關(guān)促凋亡分子如CHOP 和caspase-12等和促存活分子如GADD34和BiP等的表達(dá)/活化，最終決定細(xì)胞是適應(yīng)還是凋亡[1]。在發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激條件下，PERK與分子伴侶Grp78分離而活化，并引起其下游eIF2α磷酸化而失活，終止細(xì)胞內(nèi)絕大部分蛋白質(zhì)的合成，但能夠激活A(yù)TF4的表達(dá)，進(jìn)而引起CHOP表達(dá)量上調(diào)[2]。

哺乳動(dòng)物卵泡在發(fā)育過程中75%～99%的會(huì)發(fā)生閉鎖，僅僅少量的卵泡會(huì)成熟并排卵，然而不正常的閉鎖會(huì)導(dǎo)致繁殖力的過早終結(jié)[5]。卵泡的閉鎖主要是由顆粒細(xì)胞凋亡導(dǎo)致的[3,4]，卵巢顆粒細(xì)胞的正常功能對(duì)于卵母細(xì)胞成熟至關(guān)重要，而顆粒細(xì)胞功能的紊亂會(huì)導(dǎo)致生育能力的喪失[6]。目前已經(jīng)有關(guān)于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激影響小鼠、山羊卵巢顆粒細(xì)胞凋亡的報(bào)道[7,8]，但是深層機(jī)制還沒有得以揭示。同時(shí)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激是否參與了牛卵巢顆粒細(xì)胞的凋亡過程國內(nèi)外還沒有相關(guān)報(bào)道。為此，本實(shí)驗(yàn)利用熒光定量PCR技術(shù)分析了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)基因在健康卵泡及閉鎖卵泡中的表達(dá)情況，以探究內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激是否參與了牛卵泡顆粒細(xì)胞凋亡過程。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料及試劑

恒溫水浴鍋，超凈工作臺(tái)，自動(dòng)滅菌鍋，高速冷凍離心機(jī)，伯樂CFX96實(shí)時(shí)定量PCR儀，EvaGreen Master MIX熒光定量試劑盒，Dnase I，EDTA，Millipore超純水儀，20 mL醫(yī)用注射器，體視顯微鏡，洗卵液TCM199（含有hepes），Trizol，雙抗，PBS等。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1牛卵巢顆粒細(xì)胞采集

屠宰場收集牛卵巢，置于30℃～35℃的生理鹽水，2 h內(nèi)運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室。生理鹽水洗三遍，使用18 g針頭的注射器針刺破卵泡，釋放出壁層顆粒細(xì)胞，將所采集的卵泡液置于15 mL離心管內(nèi)。置于離心機(jī)中1 000 rpm離心5 min，用PBS懸浮細(xì)胞后1 000 rpm離心5 min，PBS清洗重復(fù)兩次，最后將細(xì)胞用1 mL Trizol裂解，-20℃保存用于RNA提取。本研究中每一個(gè)顆粒細(xì)胞樣品重復(fù)來自于4～6個(gè)健康卵泡或閉鎖泡，實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次。

1.2.2細(xì)胞總RNA的提取及反轉(zhuǎn)錄

按照Trizol提取RNA說明書方法提取顆粒細(xì)胞總RNA。以所提顆粒細(xì)胞總RNA為模板，使用iScript cDNA Synthesis kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒，按照其說明書方法去除基因組DNA并反轉(zhuǎn)錄。反轉(zhuǎn)錄完成后，將獲得的cDNA置于-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3熒光定量

根據(jù)EvaGreen Master MIX熒光定量試劑盒說明書，設(shè)定實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)的體系及程序設(shè)定。反應(yīng)體系為EvaGreen Master MIX 5 μL，上下游引物各1 μL，顆粒細(xì)胞細(xì)胞cDNA 1 μL，Rnase-free H20 2 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)轭A(yù)變性95℃30 s，95℃5 s，60℃30 s，40個(gè)循環(huán)。根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫各基因的CDS序列,利用利用primer 5.0設(shè)計(jì)引物，Atf4上下游引物序列分別為5'-CAGCAAGGAGGATGCTTTCT -3'和5'-GCATGGTTTCCAGGTCATCT-3'；Atf6上 下 游 引物 序 列 分別 為5'-AAGTGGAAAGGACCAAGTCAAG-3'和5'-GCCATGAGCTGAGAATTTGAG-3'；Grp78上下游引物序列分別為5'-TGAGCCTACGGCAGCTGCTAT-3'和5'-TGGTGAGAAGGGACACATCAAAG-3'；Grp94上下游引物序列分別為5'-CCCGATGCAAAGGTGGAA-3'和5'CCCGCATCCATTTCTTCGT-3'；Chop上 下游 引 物 序 列分 別 為5'-GGAGGTGCTGTCCTCAGATG-3'和5'-CAGAGAGGCAGGGTCAAGAGT-3';Xbp1上下游引物序列分別為5'-GGCAGAGACCAAGGGGAATG -3'和 5'-GGGTCGACTTCTGGGAGCTG-3';Caspase12上下游引物序列分別為 5'-GCCC TCATCATCTGCAACAA-3'和5'-GACGGCCAGC AAACTTCATT-3';內(nèi)參基因Gapdh上下游引物序列分別為5'-TGGTGAAGGTCGGAGTGAAC-3'和5'-GGAAGATGGTGATGGGATTTC-3'。

1.2.4數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

實(shí)時(shí)熒光定量PCR的結(jié)果利用2-△ct法計(jì)算健康組與閉鎖卵卵泡顆粒細(xì)胞內(nèi)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激基因相對(duì)表達(dá)量，所得實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)使用Minitab 17軟件進(jìn)T檢驗(yàn)分析，數(shù)據(jù)表示為Mean±SEM表示。

2　結(jié)果與分析

2.1健康卵泡與閉鎖卵泡的識(shí)別

健康卵泡的卵泡內(nèi)膜上分布較多的紅色血管，發(fā)育良好，其卵泡液澄清透明并且不含雜質(zhì)；閉鎖卵泡的內(nèi)膜發(fā)生不同程度的白化現(xiàn)象，并其卵泡液渾濁，含有較多的脫落顆粒細(xì)胞[9]。兩種卵泡形態(tài)見圖1。

圖1　健康（Healthy）和閉鎖卵泡（Atretic）的形態(tài)

2.2主要內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激基因的溶解曲線

參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)的主要基因的溶解曲線如圖2。由圖中可見這幾個(gè)基因的溶解曲線都為單峰，證明PCR產(chǎn)物單一無雜帶。

圖2　主要內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激基因的溶解曲線

2.3內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)急基因在健康及閉鎖卵泡顆粒細(xì)胞間的表達(dá)差異

兩種卵泡提取RNA，反轉(zhuǎn)錄cDNA，使用熒光定量儀檢測幾種主要的參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)的基因表達(dá)量差異，由圖3可知細(xì)胞內(nèi)參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的基因在牛閉鎖卵泡中的表達(dá)含量均比健康卵泡顯著或極顯著升高(P<0.05或P<0.01)。

圖3　內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)急基因在健康及閉鎖卵泡顆粒細(xì)胞間的表達(dá)差異

3　討　論

牛卵泡發(fā)育過程中要經(jīng)過募集、選擇、擇優(yōu)等一系列的復(fù)雜生物學(xué)事件[10]，其中卵泡發(fā)育的每個(gè)時(shí)期均會(huì)有卵泡閉鎖的發(fā)生。卵泡閉鎖主要是由卵泡顆粒細(xì)胞凋亡導(dǎo)致的，而內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激是細(xì)胞發(fā)生凋亡的誘因之一[11]。CHOP與Caspase12是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的下游基因；PERK與Grp78分離會(huì)激活A(yù)TF4的表達(dá)，進(jìn)而上調(diào)CHOP轉(zhuǎn)錄；ATF6能結(jié)合至內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激元件基因的啟動(dòng)子區(qū)域，并活化這些基因最終激活CHOP的轉(zhuǎn)錄；ATF6的活化也會(huì)激活XBP1基因的轉(zhuǎn)錄；XBP1mRNA經(jīng)IRE1剪接后的XBP1蛋白可以增強(qiáng)分子伴侶蛋白BIP的轉(zhuǎn)錄活性，增加錯(cuò)誤折疊糖蛋白的降解；XBP1剪切體的升高表明細(xì)胞內(nèi)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)強(qiáng)度的增強(qiáng)。本研究中，閉鎖卵泡顆粒細(xì)胞內(nèi)Xbp1剪切體表達(dá)量顯著高于健康卵泡內(nèi)含量（P<0.01)，說明牛閉鎖卵泡顆粒細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)強(qiáng)度高于健康卵泡，由此推斷細(xì)胞內(nèi)過強(qiáng)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)可能是導(dǎo)致顆粒細(xì)胞凋亡的原因之一。同時(shí)，CHOP及Caspase12為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的最終執(zhí)行分子，二者在牛閉鎖卵泡顆粒細(xì)胞內(nèi)表達(dá)也顯著高于健康卵泡顆粒細(xì)胞P< 0.05和P<0.01)，與Yang[8]等人在小鼠凋亡顆粒細(xì)胞中的結(jié)果一致。Atf4及Atf6作為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)的上游調(diào)控基因，在牛閉鎖卵泡顆粒細(xì)胞內(nèi)表達(dá)顯著高于健康卵泡顆粒細(xì)胞內(nèi)含量（<0.01)。因此，本研究表明內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)參與了牛卵泡發(fā)育過程中卵泡閉鎖事件，可能是導(dǎo)致由牛卵泡顆粒細(xì)胞凋亡引起的卵泡閉鎖的原因之一。

參考文獻(xiàn):

[1]鐘衛(wèi)衛(wèi)，林世德.內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與肝損傷研究進(jìn)展[J].世界華人消化雜志,2010，(10):1021-1025.

[2]Banhegyi,G.,et al.,Endoplasmic reticulum stress[J].Ann N Y Acad Sci,2007，（1113）:58-71.

[3]Hughes,F.J.and W.C.Gorospe,Biochemical identification of apoptosis(programmed cell death)in granulosa cells:evidence for a potential mechanism underlying follicular atresia[J].Endocrinology, 1991,129(5):2415-22.

[4]RAJAKOSKI,E.,The ovarian follicular system in sexually mature heifers with special reference to seasonal,cyclical,end left-right variations[J].Acta Endocrinol Suppl(Copenh),1960，34(Suppl 52):1-68.

[5]Johnson,A.L.,Granulosa cell apoptosis:conservation of cell signaling in an avian ovarian model system[J]. Biol Signals Recept,2000，9(2):p.96-101.

[6]Su,Y.Q.,K.Sugiura and J.J.Eppig,Mouse oocyte control of granulosa cell development and function: paracrine regulation of cumulus cell metabolism[J].Semin Reprod Med,2009，27(1):p.32-42.

[7]Lin,P.,et al.,Endoplasmic reticulum stress is involved in granulosa cell apoptosis during follicular atresia in goat ovaries[J].Mol Reprod Dev,2012，79(6):p.423-32.

[8]Yang,Y.,et al.,Luman recruiting factor regulates endoplasmic reticulum stress in mouse ovarian granulosa cell apoptosis[J].Theriogenology,2013，79(4):p.633-9.e1-3.

[9]Boni,R.,A.Cuomo and E.Tosti,Developmental potential in bovine oocytes is related to cumulus-oocyte complex grade,calcium current activity,and calcium stores[J].Biol Reprod,2002，66(3):p.836-42.

[10]張運(yùn)海.牛卵泡發(fā)育及其調(diào)控[J].動(dòng)物科學(xué)與動(dòng)物醫(yī)學(xué),2000,(04):15-18.

[11]Hassan,M.,et al.,Endoplasmic reticulum stress-mediated pathways to both apoptosis and autophagy: Significance for melanoma treatment[J].World J Exp Med,2015，5(4):p.206-217.

中圖分類號(hào)：S827

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1003-6377（2016）03-0017-05

基金項(xiàng)目：國家“十二五”肉牛產(chǎn)業(yè)體系項(xiàng)目。

作者簡介：吐遜·吾守爾（1964-），男（維吾爾族），在職碩士，高級(jí)畜牧師，研究方向?yàn)閯?dòng)物遺傳育種與繁殖。E-mail:20850920@qq.com

收稿日期：2016-02-15修回日期：2016-02-24

Study on Expression Difference of Endoplasmic Reticulum Stress Genes between Bovine Healthy and Atretic Follicles

TUXUN·Wushouer
（Xinjiang Awati County Animal and Poultry Station,Awat Xinjiang 843200,China）

Abstract:To preliminarily explore the role of endoplasmic reticulum stress bovine follicular atresia,we use fluorescence quantitative PCR(qRT-PCR)to detect the expression of several genes which are involved in endoplasmic reticulum stress between bovine healthy and atretic follicles.The results show that:The expression of Atf4,Atf6,Grp78,Grp94,Xbp1,Chop,Caspase12 in atretic follicles are significantly higher than the one in healthy follicles.It is suggested that endoplasmic reticulum stress may account for the bovine follicular atresia to some extent,and this study provides important reference to the investigation of molecular mechanisms of bovine follicular atresia and follicle selection.

Key words:endoplasmic reticulum stress;genes expression;bovine atretic follicles;granulosa cells apoptosis