鄧洋 張麗萍 高艷榮 李斌振 盧城德 邢廣雪

聯(lián)合稀土元素鑭和鈰對(duì)雄性大鼠生殖功能影響的實(shí)驗(yàn)研究

鄧洋 張麗萍 高艷榮 李斌振 盧城德 邢廣雪

目的研究稀土元素鑭和鈰對(duì)大鼠生殖功能的影響，初步探討聯(lián)合鑭和鈰對(duì)大鼠生精功能的損傷程度。方法將大鼠隨機(jī)分成La(NO3)3、Ce(NO3)3及La(NO3)3＋Ce(NO3)3作用的高、中、低三個(gè)劑量組，并設(shè)對(duì)照組，灌胃稀土元素和生理鹽水8周后，檢測(cè)附睪精子的數(shù)量、存活率及畸形率，分析睪丸中ACP、AKP、LDH及NOS酶活性的改變和睪丸組織病理學(xué)改變。結(jié)果①各給藥劑量組(除低劑量Ce組外)睪丸的AKP均低于對(duì)照組(P＜0.05)；低劑量La＋Ce組的ACP高于對(duì)照組(P＜0.05)，高La＋Ce、中La和高Ce劑量組的ACP均低于對(duì)照組(P＜0.05)；高中低La＋Ce、低La、高中Ce劑量組的LDH均低于對(duì)照組(P＜0.05)；高中La＋Ce、高低La、高低Ce劑量組的NOS均低于對(duì)照組(P＜0.05)。②高中劑量組的La、Ce及La＋Ce精子數(shù)量均少于對(duì)照組(P＜0.05)；高中La、中Ce、高La＋Ce劑量組精子活率顯著低于對(duì)照組(P＜0.05)；高La、高中Ce、高中La＋Ce劑量組精子畸形率均高于對(duì)照組(P＜0.05)。③光鏡下整體上看高劑量鑭、鈰及聯(lián)合組對(duì)睪丸組織破壞嚴(yán)重，低劑量組與對(duì)照組相比破壞較少或無明顯影響。結(jié)論高劑量的鑭、鈰及鑭+鈰對(duì)大鼠生精功能造成了一定損傷，隨著劑量的降低損傷越來越不明顯；鑭與鈰聯(lián)合作用表現(xiàn)為相加作用，后呈現(xiàn)協(xié)同作用。

鑭；鈰；聯(lián)合；精子

我國是世界上稀土資源最豐富的國家，我國的稀土儲(chǔ)量、生產(chǎn)和出口均為全球之冠，稀土應(yīng)用也居世界第二。由于稀土具有獨(dú)特的結(jié)構(gòu)和性能，因而廣泛用于農(nóng)、林、牧、漁、醫(yī)、藥等方面。由于應(yīng)用的廣泛、半衰期長等性質(zhì)，越來越多的稀土元素進(jìn)入環(huán)境，它對(duì)人體健康和生態(tài)環(huán)境的潛在危害已經(jīng)引起廣泛關(guān)注。學(xué)者建議系統(tǒng)的研究稀土對(duì)人類健康的影響，在接觸人群中早期發(fā)現(xiàn)毒效應(yīng)并迅速采取干預(yù)措施，從而使毒效應(yīng)發(fā)生可逆變化而不發(fā)展為顯著的功能損傷，同時(shí)研究稀土元素及其化合物的毒作用靶器官及機(jī)制，并制定稀土職業(yè)接觸限值。所以明確稀土元素的生物毒性，制定出各種稀土元素職業(yè)接觸限值對(duì)于職業(yè)人群是迫切需要解決的問題。目前，關(guān)于稀土元素的研究主要集中于呼吸系統(tǒng)[1-2]、消化系統(tǒng)、血液系統(tǒng)及免疫系統(tǒng)等方面研究[3-4]，尚缺乏稀土元素尤其是稀土間的聯(lián)合作用對(duì)生殖系統(tǒng)損傷的系統(tǒng)研究。稀土元素鑭和鈰資源豐富、易提取，而且比其他稀土產(chǎn)品便宜，因此它們就成為較早有實(shí)際用途的稀土，它們對(duì)生殖方面的研究主要集中在雌性生殖系統(tǒng)和胚胎，而關(guān)于它們對(duì)雄性生殖系統(tǒng)的影響較少。因此，本研究通過將不同劑量的硝酸鑭[La(NO3)3，La]、硝酸鈰[Ce(NO3)3，Ce]及硝酸鑭＋硝酸鈰(La＋Ce)對(duì)實(shí)驗(yàn)大鼠給藥，通過檢測(cè)精子數(shù)量和質(zhì)量、睪丸相應(yīng)酶活性變化及睪丸組織病理學(xué)改變，初步揭示稀土元素鑭、鈰及鑭＋鈰聯(lián)合作用的生殖毒性，為職業(yè)人群接觸鑭和鈰等稀土物質(zhì)的安全性的評(píng)價(jià)積累依據(jù)和資料，并為探討其作用機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及給藥方法由北京市實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供的雄性Wister大鼠100只，初始體質(zhì)量(200±20)g，清潔級(jí)動(dòng)物。合格證書：SCXK(京)2011—0012。硝酸鑭(批號(hào)：2014-9-10)和硝酸鈰(批號(hào)：2014-168E02)均購于瑞科稀土冶金及功能材料國家工程研究中心。大鼠按體質(zhì)量隨機(jī)分組法分成10組(空白對(duì)照組，La、Ce及La＋Ce分別高、中、低劑量組)，每組10只，分籠飼養(yǎng)，大鼠自由飲水及飲食。按大鼠體質(zhì)量給予相關(guān)的稀土元素和生理鹽水灌胃，具體如下：高、中、低La、Ce及La＋Ce劑量組給藥分別為：100、50、25，20、10、5，50＋10、25＋5、12.5＋2.5(上述給藥劑量單位均為mg/kg BW)；空白對(duì)照組為生理鹽水1 mg/kg劑量。

1.2 觀察指標(biāo)

1.2.1 大鼠附睪精子數(shù)量和質(zhì)量的測(cè)定先稱重附睪，置附睪于6 mL生理鹽水中，用剪刀剪碎，用4層擦鏡紙過濾，取濾液1 mL，加入9 mL生理鹽水，制備精子懸液，將精子懸液置液在37℃水浴中孵育20 min，待用。

1.2.1.1 精子計(jì)數(shù)取1滴精子懸液滴到細(xì)胞計(jì)數(shù)板上，于顯微鏡下計(jì)數(shù)5個(gè)方格的精子數(shù)將精子數(shù)換算成每克附睪中的精子數(shù)。

1.2.1.2 精子活率取1滴精子懸液，加入1滴5%伊紅溶液和1%苯胺黑溶液于載玻片的一端，迅速混勻，取上述混勻液1滴制成抹片，鏡下檢查，活的精子頭部為無色透明，死亡精子為粉紅色。觀察200個(gè)精子，計(jì)數(shù)活精子數(shù)，計(jì)算精子活率。

1.2.1.3 精子畸形取1滴精子懸液涂片，使用甲醇固定5 min，干燥后，用1%伊紅染色1 h，蒸餾水沖洗，待片子晾干后鏡檢，精子畸形主要包括雙頭、胖頭、無鉤、雙尾、無定形等，每只大鼠檢測(cè)1 000個(gè)精子，計(jì)算畸形率。

1.2.2 睪丸細(xì)胞酶活性的影響含量取左側(cè)睪丸組織0.5 g加入4.5 mL冷生理鹽水，冰浴制成10%的勻漿，以3 500 r/min離心10 min，取上清液，采用酶聯(lián)免疫法測(cè)定睪丸勻漿中堿性磷酸酶(Alkaline phosphatase，AKP)、酸性磷酸酶(Acid phopohatase，ACP)、乳酸脫氫酶(Lactate dehydrogenase，LDH)和一氧化氮合酶(Nitric oxide synthase，NOS)的含量。

1.2.3 睪丸組織的病理學(xué)檢查取左側(cè)睪丸用10%中性緩沖福爾馬林液固定，采用HE染色，對(duì)睪丸進(jìn)行組織病理學(xué)檢查，分析大鼠睪丸組織損傷特征。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法所有數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行分析，使用單因素方差分析和SNK-Q檢驗(yàn)比較組間差異，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠體質(zhì)量、睪丸重量、臟器系數(shù)的比較不同給藥劑量La＋Ce、La及Ce對(duì)大鼠體質(zhì)量、睪丸重量及睪丸與體質(zhì)量的臟器系數(shù)比差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

2.2 大鼠睪丸細(xì)胞酶活性測(cè)定與對(duì)照組相比，除了低劑量Ce組外，其余實(shí)驗(yàn)組大鼠睪丸AKP活性均低于對(duì)照組(P＜0.05，圖1A)。低劑量La＋Ce組ACP高于對(duì)照組，高劑量La＋Ce、中劑量La和高劑量Ce的ACP均低于對(duì)照組(P＜0.05，圖1B)；高中低劑量La＋Ce，低劑量La，高中劑量Ce的LDH均低于對(duì)照組(P＜0.05，圖1C)；高中劑量La＋Ce，高中劑量La，高低劑量Ce的NOS均低于對(duì)照組(P＜0.05，圖1D)。

2.3 稀土元素鑭和鈰對(duì)大鼠精子數(shù)量、活率及畸形率的影響高劑量La＋Ce、La及Ce組與對(duì)照組相比均存在精子數(shù)量減少(P＜0.05)，精子活率顯著降低(P＜0.05)，精子畸形率明顯升高(P＜0.05)。通過上述結(jié)果顯示隨著鑭和鈰給藥劑量增加，與對(duì)照組相比出現(xiàn)精子數(shù)量和精子活率下降，畸形率升高的趨勢(shì)。對(duì)于鑭和鈰聯(lián)合組顯示的毒副作用較單獨(dú)的稀土元素并沒有大大增加，所以推斷的二者是相加作用，而不是拮抗作用或相乘作用(表1)。

圖1 實(shí)驗(yàn)大鼠睪丸中四種酶的活性比較

表1 稀土元素鑭和鈰聯(lián)合對(duì)大鼠精子數(shù)量、精子活率、精子畸形率的影響(±s)

表1 稀土元素鑭和鈰聯(lián)合對(duì)大鼠精子數(shù)量、精子活率、精子畸形率的影響(±s)

注：與對(duì)照組比較，#P＜0.05；與同一種低劑量染毒物質(zhì)的組相比，△P＜0.05

組別n精子數(shù)量(×106/g)精子活率(%)精子畸形率(%)空白對(duì)照組10375.88±13.2393.30±8.10*2.34±0.56*La(NO3)3高10238.38±7.43#82.45±11.50#4.23±1.34#中10272.10±12.49#84.30±14.72#3.76±0.97低10295.77±6.1985.60±8.142.98±0.34 Ce(NO3)3高10224.90±6.22#△88.56±9.145.98±1.23#△中10280.13±23.07#81.00±17.08#4.12±1.36#低10361.60±34.7286.67±8.922.90±1.02 La＋Ce高10232.40±30.32#81.20±12.55#4.78±0.45#△中10286.08±62.30#84.10±7.31#3.89±1.67#低10358.13±3.8585.40±10.772.67±0.69

2.4 睪丸組織形態(tài)學(xué)觀察光鏡下對(duì)照組睪丸的曲細(xì)精管排列整齊，各級(jí)生精細(xì)胞均層次清晰，發(fā)育良好，支持細(xì)胞有條理的分布在生精細(xì)胞之間，間質(zhì)細(xì)胞群集或散落在睪丸間質(zhì)之間，管腔內(nèi)有大量精子；與對(duì)照組相比，高劑量La組可以看到曲細(xì)精管上皮細(xì)胞幾乎消失，剩下基底膜和少量精原細(xì)胞，整個(gè)曲細(xì)精管內(nèi)無精子，管腔破裂，管壁出現(xiàn)萎縮與變形，間質(zhì)細(xì)胞和支持細(xì)胞較少，間質(zhì)間隙變寬、滲出液增多；與對(duì)照組相比，中低La劑量組生精細(xì)胞較高劑量組多，雖然也出現(xiàn)管壁變形與萎縮，間質(zhì)間隙增大，但管腔完整無破裂現(xiàn)象發(fā)生；與對(duì)照組相比，高劑量Ce組管腔雖無破裂但曲細(xì)精管上皮細(xì)胞消失，僅剩下基底膜和少量精原細(xì)胞，整個(gè)曲細(xì)精管內(nèi)無精子，中、低劑量組情況也稍好一些；與對(duì)照組相比，高劑量La＋Ce組也可以看到曲細(xì)精管上皮細(xì)胞幾乎消失，僅剩下基底膜和少量精原細(xì)胞，整個(gè)曲細(xì)精管內(nèi)無精子，管壁出現(xiàn)萎縮與變形，間質(zhì)細(xì)胞和支持細(xì)胞變少，間質(zhì)間隙變寬、滲出液增多(圖2)。

圖2 鑭和鈰對(duì)大鼠睪丸組織的病理學(xué)改變(HE染色×200)

3 討論

研究表明稀土元素能有效提高牲畜的體質(zhì)量和品質(zhì)，稀土曾被廣泛用于飼料添加劑[5]。本研究中實(shí)驗(yàn)組大鼠體質(zhì)量與對(duì)照組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可推測(cè)低劑量的鑭和鈰對(duì)動(dòng)物的生長發(fā)育有促進(jìn)作用，但是高劑量可抑制動(dòng)物生長，甚至?xí)a(chǎn)生毒害作用。

精原細(xì)胞的發(fā)生、發(fā)展、分化為成熟精子是一個(gè)精細(xì)且復(fù)雜的過程，任何一個(gè)環(huán)節(jié)受到外源性有害物質(zhì)的影響都有可能會(huì)引起精子的數(shù)量和質(zhì)量的下降，而這些外源性有害物質(zhì)對(duì)雄性生殖系統(tǒng)毒性效應(yīng)主要表現(xiàn)在精子生成障礙和形態(tài)學(xué)的改變。精子質(zhì)量是評(píng)價(jià)雄性生育力的重要指標(biāo)，可通過精子數(shù)量、活率及畸形率體現(xiàn)[6]。精子數(shù)量如果發(fā)生減少通常認(rèn)為是外源性化學(xué)物質(zhì)對(duì)某級(jí)甚至是各級(jí)生精細(xì)胞生長發(fā)育過程中產(chǎn)生毒性作用的結(jié)果；精子活率是預(yù)測(cè)生育能力最重要的指標(biāo)之一且為受精的前提和保證。本結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，高給藥劑量組大鼠精子的數(shù)量和質(zhì)量顯著下降，由此推測(cè)鑭和鈰無論是單獨(dú)作用還是聯(lián)合作用對(duì)精子質(zhì)量均有一定影響，劑量越大，損害越大。沈旭等[7]提出精子活力下降可能是由于稀土離子可取代某些酶的Ca2+、Mg2+，而阻礙了Ca2+進(jìn)入細(xì)胞膜的相關(guān)位點(diǎn)，一些重要的代謝途徑尤其是能量的代謝途徑被抑制了，如3′，5′-環(huán)磷酸腺苷，阻礙了精子運(yùn)動(dòng)的啟動(dòng)過程及其鞭毛的擺動(dòng)，導(dǎo)致精子活力下降，其機(jī)制還有待于進(jìn)一步研究[8]。

此外，精子形成過程中需要睪丸中多種酶參與，AKP是存在于胞漿的一種含鋅酶，與生精細(xì)胞的分裂及營養(yǎng)運(yùn)輸密切相關(guān)，本實(shí)驗(yàn)中AKP的活力下降，影響細(xì)胞的分裂周期，導(dǎo)致各級(jí)精母細(xì)胞及精子均減少；ACP主要存在于睪丸支持細(xì)胞和精子的溶酶體內(nèi)，目前認(rèn)為其能夠清除衰老和受損的細(xì)胞，維持細(xì)胞正常的代謝和功能，是評(píng)價(jià)生精障礙的指標(biāo)之一[8]，研究顯示ACP活力越低，頭部異常精子比例就越高[9]。本結(jié)果表明染毒劑量越大，ACP下降的越明顯，說明隨著染毒劑量的增大生精過程變得越來越難；給予鑭的三組大鼠，睪丸ACP、AKP與對(duì)照組相比均有下降趨勢(shì)，這與陳言峰等[10]的研究結(jié)果有所不同，但與劉高峰等[11]的結(jié)果是一致的，這可能與實(shí)驗(yàn)條件不同有關(guān)。在本試驗(yàn)中睪丸組織的LDH活力均出現(xiàn)下降，推測(cè)鑭和鈰可能干擾了睪丸細(xì)胞糖代謝從而導(dǎo)致睪丸細(xì)胞代謝異常，進(jìn)而影響了精子的形成。NOS可催化L-精氨酸合成一氧化氮(Nitric oxide，NO)，雄性動(dòng)物生殖系統(tǒng)中的NO水平與雄激素分泌、陰莖勃起、精子成熟、運(yùn)動(dòng)、獲能及睪丸微循環(huán)的調(diào)節(jié)均有密切關(guān)系[11-13]。本研究結(jié)果表明給藥后，NOS呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，這樣生成的NO也將出現(xiàn)下降，影響生殖細(xì)胞的產(chǎn)生和功能。

本研究中初步探討了鑭鈰聯(lián)合作用對(duì)大鼠生殖功能的影響，雖然給藥劑量分別是鑭和鈰劑量的50%，但從無論是精子的數(shù)量和質(zhì)量、4種酶及光鏡的結(jié)果來看，聯(lián)合作用的高劑量組所造成的損害作用并沒有大大超過鑭和鈰單獨(dú)作用的結(jié)果，故推測(cè)鑭鈰聯(lián)合其體現(xiàn)的是相加作用，后呈協(xié)同作用。相應(yīng)的機(jī)制會(huì)在以后的實(shí)驗(yàn)中作進(jìn)一步的研究與探討。

4 結(jié)論

通過給大鼠連續(xù)灌胃不同濃度稀土元素鑭、鈰及鑭鈰聯(lián)合8周后，不同劑量的稀土元素對(duì)大鼠生殖系統(tǒng)有不同程度的影響，即低劑量無作用或促進(jìn)作用、高劑量有損害作用，鑭鈰聯(lián)合其體現(xiàn)的是相加作用，后呈協(xié)同作用。

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ObjectiveTo study the influence of combined rare earth elements of Lanthanum and Cerium on reproductive function of male rats，and to make preliminary discovery of the damage degree of combined Lanthanum and Cerium to spermatogenous function of the rats.MethodsThe male rats were randomly divided into group La(NO3)3，group Ce(NO3)3and group La(NO3)3＋Ce(NO3)3with three different dosage of high，moderate and low，and a control group was set up.After 8 weeks of gavage of rare earth elements and normal saline，the epididymal sperm number，survival rate and aberration rate were detected to analyze the changes of ACP，AKP，LDH，and NOS enzymatic activity，and the pathological alteration of testicular tissues.Results①The testicular AKP in the different dosage groups except the low Ce group was lower than that of the control group(P＜0.05)；The ACP of the low La＋Ce group was higher than that of the control group(P＜0.05)；The ACP of the high La＋Ce group，the moderate La group and the high Ce group was lower than that of the control group(P＜0.05)；The LDH of the high，moderate and low La＋Ce groups，of the low La group，and of the high and moderate Ce groups was lower than that of the control group(P＜0.05)；The NOS of the high and moderate La＋Ce groups，of the high and low La groups and of the high and low Ce groups was lower than that of the control group(P＜0.05).②The number of the sperms in the high and moderate groups of La，Ce and La＋Ce was smaller than that of the control group(P＜0.05)；The sperm motility rate in the high and moderate La，moderate Ce，and high La＋Ce groups was significantly lower than that of the control group(P＜0.05)；The sperm aberration rate of the high La，high and moderate Ce，and high and moderate La＋Ce groups was higher than that of the control group(P＜0.05).③Generally，under the light microscope，the damage effects of high dose of La，Ce，and La＋Ce on testicular tissues were serious，while between the control group and the low dose groups，there was little damage or or no obvious effect.ConclusionHigh dosage of La，Ce，and La＋Ce shows damage to the spermatogenous function of the rats，while it shows no clear damage with the decrease of the dosage.Combined rare earth elements of Lanthanum and Cerium has additive effect and then takes on synergistic effect.

Lanthanum；Cerium；Combine；Sperm

2016-05-04)

1005-619X(2016)10-1012-04

10.13517/j.cnki.ccm.2016.10.002

014010包頭醫(yī)學(xué)院(鄧洋，張麗萍，高艷榮，盧城德，刑廣雪)；014010包頭市衛(wèi)生局衛(wèi)生監(jiān)督所(李斌振)

1.包頭市醫(yī)藥衛(wèi)生科技計(jì)劃項(xiàng)目(Wsjj2014016，稀土元素鑭和鈰聯(lián)合作用對(duì)雄性大鼠生殖毒性影響的研究)；2.內(nèi)蒙古自治區(qū)自然基金(2015MS0865，稀土元素鈰和釹聯(lián)合對(duì)雄性大鼠免疫和內(nèi)分泌系統(tǒng)影響的實(shí)驗(yàn)研究)；3.秦文彬科技教育基金(byjj201508，稀土元素鑭和鈰聯(lián)合對(duì)雄性大鼠免疫系統(tǒng)和肝功能影響的實(shí)驗(yàn)研究)

張麗萍