蔣　智，賈中申，潘裕佳，，李安潔，韋　方

1貴州省人民醫(yī)院心內(nèi)科，貴陽 5500022貴州醫(yī)科大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)系，貴陽 550025

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·論著·

子宮內(nèi)膜干細(xì)胞來源細(xì)胞因子雞尾酒對小鼠心肌缺血再灌注損傷的影響

蔣智1，賈中申2，潘裕佳1，2，李安潔1，韋方1

1貴州省人民醫(yī)院心內(nèi)科，貴陽 5500022貴州醫(yī)科大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)系，貴陽 550025

摘要：目的研究子宮內(nèi)膜干細(xì)胞(EnSCs)來源細(xì)胞因子雞尾酒(EdCC)對小鼠心肌缺血再灌注損傷(I/R)的影響。方法采用Millipore蛋白超濾技術(shù)從EnSCs培養(yǎng)液中提取EdCC，通過尾靜脈注射治療小鼠心肌I/R損傷。TTC/Evans Blue染色評估梗死面積，TUNEL染色計數(shù)凋亡細(xì)胞，Western blot法檢測cleaved caspase 3。結(jié)果EdCC提取效率為每24 h (222.4±29.3) μg/106細(xì)胞，經(jīng)-80℃凍存后EdCC蛋白濃度及蛋白總量逐漸降低。與I/R組比較，100 μg新鮮提取的EdCC可顯著縮小心肌梗死面積(P=0.001)，減少梗死周邊區(qū)細(xì)胞凋亡數(shù)量(P=0.019)，降低cleaved caspase 3表達(dá)(P=0.002)，增加EdCC劑量不能進(jìn)一步縮小梗死面積。EdCC經(jīng)-80 ℃凍存90 d以上心肌保護(hù)效應(yīng)逐漸降低。結(jié)論EdCC可能是通過抑制細(xì)胞凋亡保護(hù)心肌I/R損傷。經(jīng)-80 ℃凍存30 d以內(nèi)可保持較強(qiáng)保護(hù)效應(yīng)。

關(guān)鍵詞：子宮內(nèi)膜干細(xì)胞；細(xì)胞因子；心肌梗死；缺血再灌注損傷；凋亡

ActaAcadMedSin，2016,38(3)：253-259

急性心肌梗死已成為國人主要致死原因[1]。急診再灌注治療可顯著縮小急性心肌梗死的梗死面積從而改善預(yù)后，但缺血再灌注損傷(ischemic reperfusion injury，I/R)會加重心肌結(jié)構(gòu)破壞和功能障礙，削弱再灌注治療的獲益[2]。如何防治再灌注損傷保護(hù)缺血心肌日益成為急性心肌梗死治療中亟待解決的問題[3]。單一細(xì)胞因子如粒細(xì)胞集落刺激因子(granulocyte colony-stimulating factor，G-CSF)和促紅細(xì)胞生成素(erythropoietin，EPO)治療心肌梗死的臨床試驗(yàn)大多得到陰性結(jié)果[4- 5]，而干細(xì)胞移植卻取得治療有效的結(jié)論[6]，大量研究提示旁分泌效應(yīng)是其最主要的治療機(jī)制[7]。子宮內(nèi)膜干細(xì)胞(endometrial stem cells，EnSCs)具有間充質(zhì)干細(xì)胞特性，可從月經(jīng)血中分離獲得，具有無創(chuàng)獲取、增殖速度快、傳代穩(wěn)定、低免疫原性及無倫理道德問題等優(yōu)勢，適宜異體移植，是干細(xì)胞產(chǎn)品中極具潛力的種子細(xì)胞[8]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，人EnSCs移植可通過分泌多種細(xì)胞因子保護(hù)大鼠心肌細(xì)胞，減少心肌梗死面積[9]。為避免直接移植EnSCs潛在的致心律失常[10]、腫瘤形成[11]、血栓栓塞[12]等風(fēng)險，本研究從EnSCs培養(yǎng)液中提取并濃縮EnSCs來源細(xì)胞因子雞尾酒(EnSCs derived cytokine cocktail，EdCC)，并觀察了EdCC對小鼠心臟I/R損傷梗死面積和細(xì)胞凋亡的影響。

材料和方法

材料8～12周齡雄性健康昆明小鼠，體重25～30 g，購自貴州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心。胎牛血清(Hyclone，美國)，DMEM/F12細(xì)胞培養(yǎng)液(吉諾，中國)，PBS(吉諾，中國)，25 cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶(Corning，美國)，Millipore超濾離心管(Millipore，美國)，異氟烷(玉研，中國)，6- 0手術(shù)縫線(Sharpoint，美國)，TTC(Sigma，美國)，Evans Blue(凱信，中國)，多聚甲醛(凱信，中國)，TUNEL試劑盒(Invitrogen，美國)，OCT包埋劑(Takura，日本)，兔抗小鼠cleaved caspase3(CST，美國)，ECL顯色液(Pierce，美國)。

人EnSCs的培養(yǎng)人EnSCs細(xì)胞株購自易文賽生物技術(shù)有限公司(杭州，中國)，37 ℃快速溶解后用含10%胎牛血清的DMEM/F12于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細(xì)胞生長至80%按1∶2或1∶3傳代。

EdCC的制備和儲存將8×105個EnSCs種入25 cm2培養(yǎng)瓶中，24 h后用PBS洗3次，加入3 ml無血清無酚紅DMEM/F12培養(yǎng)液，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24 h后吸出培養(yǎng)液，5000 r/min離心15 min，將上清加入Millipore超濾離心管，5000 r/min離心30 min，上層濃縮液即為EdCC，培養(yǎng)瓶中EnSCs消化后細(xì)胞計數(shù)。用200 μl移液器測得EdCC總體積V，然后取1 μl EdCC加99 μl無酚紅DMEM/F12，BCA法進(jìn)行蛋白定量測得蛋白濃度C，蛋白總量Q=C×V，EdCC提取效率E=Q μg/(細(xì)胞總數(shù)·24 h)。蛋白定量后供實(shí)驗(yàn)用或-80 ℃冰箱儲存。

小鼠心肌I/R損傷模型小鼠用2%異氟烷持續(xù)吸入麻醉，6-0圓針絲線于肺動脈下方2 mm處用活結(jié)結(jié)扎左冠狀動脈前降支開始缺血，將活結(jié)線頭預(yù)留5 mm在胸腔外，5 min后經(jīng)尾靜脈注射藥物，30 min后適當(dāng)用力拉活結(jié)線頭將活結(jié)松開開始再灌注[13]。I/R組注射200 μl無血清DMEM/F12，I/R+EdCC組按實(shí)驗(yàn)設(shè)計注射不同劑量及不同凍存時間的EdCC(用無血清DMEM/F12稀釋成200 μl)。

TTC/Evans Blue染色脫頸椎處死小鼠，將原先松開的線結(jié)再次結(jié)扎，從升主動脈逆行注入2% Evans Blue染液，剪下心臟用PBS洗去多余染液，保鮮膜包裹后放入-20 ℃冰箱冷凍15 min，取出后垂直左心室長軸從心尖至心底間隔1 mm切成5～6片，放入37 ℃含2% TTC的PBS中避光染色20 min，4%多聚甲醛溶液固定20 min，壓平、拍照，非藍(lán)染區(qū)域?yàn)槲ｋU區(qū)(area at risk，AAR)，白色區(qū)域?yàn)楣Ｋ绤^(qū)(infarct area，IA)。用image-pro plus軟件分別計算各切片的左心室面積(left ventricle，LV)、AAR面積和IA面積。梗死面積(IA/AAR%)=IA總和/AAR總和×100%，危險區(qū)面積(AAR/LV%)=AAR總和/LV總和×100%。

冰凍切片脫頸椎處死小鼠，經(jīng)主動脈逆行灌注10 ml冰PBS，剪下心臟用濾紙吸去多余水分，分離多余結(jié)締組織，用10%、20%、30%蔗糖PBS溶液梯度脫水，OCT包埋，液氮速凍，7 μm切片留樣。

TUNEL染色冰凍切片于常溫放置解凍，晾干，4%多聚甲醛溶液固定10 min，PBS洗3次，0.2% TritonX100穿膜5 min，PBS洗3次，加混合好的TUNEL染液在37 ℃下孵育60 min，PBS洗3次，浸入含1 μg/ml Hoechst的PBS溶液中5 min，PBS洗3次，封片。用熒光顯微鏡觀察，每個樣本取5個梗死周邊區(qū)高倍鏡視野，用image-pro plus軟件計數(shù)TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)。

Western blot檢測小鼠脫頸椎處死后立即經(jīng)主動脈逆行灌注10 ml冰PBS，剪去心包、大血管、右心室游離壁等，僅保留冠脈結(jié)扎線以下左心室心肌組織，冰PBS反復(fù)沖洗。心肌組織用錫箔紙包裹，液氮速凍，砸碎后移入EP管，加RIPA蛋白裂解液及蛋白酶抑制劑，冰上裂解30 min，期間反復(fù)震蕩混勻，離心后取上清用BCA法蛋白定量，準(zhǔn)備蛋白樣品，用15%梯度膠電泳后，轉(zhuǎn)膜，用5 %的脫脂牛奶封閉1 h，膜與兔抗小鼠cleaved caspase 3一抗4℃孵育過夜，PBS-T洗3次，加入HRP偶聯(lián)羊抗兔二抗于室溫孵育2 h，PBS-T洗3次，加ECL液曝光、顯影、定影。用掃描儀掃描曝光膠片，用Bandscan軟件分析條帶像素灰度值。

統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件，所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，2組間數(shù)據(jù)比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，3組以上數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析和LSD-t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)果

EnSCs的生長形態(tài)人EnSCs貼壁生長，大部分為紡錘形，細(xì)胞核圓形位于細(xì)胞中間(圖1A)，細(xì)胞間融合后形成旋渦樣結(jié)構(gòu)(圖1B)。

EdCC的提取及保存效率每15 ml EnSCs上清液經(jīng)Millipore超濾技術(shù)超濾濃縮后的體積為(200.5±11.2) μl，蛋白濃度為(5.57±0.95) μg/μl，EdCC的提取效率為每24 h (222.4±29.3)μg/106細(xì)胞。-80 ℃長期儲存可導(dǎo)致EdCC蛋白濃度及總量逐漸降低(圖2)。

EdCC減輕心肌I/R損傷將小鼠分為I/R組、I/R+EdCC 50 μg組、I/R+EdCC 100 μg組和I/R+EdCC 200 μg組(注射新鮮提取EdCC)，再灌注24 h行心臟TTC/Evans Blue染色，結(jié)果顯示，各組小鼠危險區(qū)面積差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)；I/R+EdCC 100 μg組[(34.1±8.6)% 比(48.5±7.9)%，P<0.01；(34.1±8.6)% 比(43.4±8.7)%，P<0.05]和I/R+EdCC 200 μg組[(34.3±10.0)% 比(48.5±7.9)%，P<0.01；(34.3±10.0)% 比(43.4±8.7)%，P<0.05]梗死面積較I/R組和I/R+EdCC 50 μg組明顯縮小，I/R+EdCC 100 μg組與I/R+EdCC 200 μg組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)(圖3)。

EnSCs：子宮內(nèi)膜干細(xì)胞

EnSCs：endometrial stem cells

A.融合度30%；B.融合度100%

A.EnSCs with 30% confluent；B. EnSCs with 100% confluent

圖 1倒置顯微鏡下EnSCs的生長形態(tài)

Fig 1Phase-contrast microscopic view of EnSCs

EdCC：EnSCs來源細(xì)胞因子雞尾酒

EdCC：EnSCs derived cytokine cocktail

圖 2EdCC經(jīng)-80℃凍存后蛋白濃度及蛋白總量逐漸降低(n=4)

Fig 2The protein concentration and total quantity of EdCC decreased following-80℃ storage(n=4)

EdCC減少細(xì)胞凋亡將小鼠分為I/R組和I/R+EdCC組(注射新鮮提取100 μg EdCC)，再灌注3 h取心臟冰凍切片行TUNEL染色，留蛋白用Western blot檢測cleaved caspase 3，結(jié)果顯示，I/R+EdCC組梗死周邊區(qū)凋亡細(xì)胞數(shù)量較I/R組明顯減少[(16.2±4.9)個/高倍鏡視野比(23.8±4.9)個/高倍鏡視野，P<0.05]，cleaved caspase 3表達(dá)水平明顯降低(0.150±0.027比0.400±0.052，P<0.01)(圖4)。

-80 ℃儲存降低EdCC心肌保護(hù)效應(yīng)將小鼠分為I/R組、I/R+EdCC 1 d、I/R+EdCC 30 d、I/R+EdCC 90 d組和I/R+EdCC 180 d組(注射相應(yīng)凍存時間EdCC 100 μg)，再灌注24 h行心臟TTC/Evans Blue染色，結(jié)果顯示，各組間危險區(qū)面積差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)；I/R+EdCC 1 d組[(36.5±7.7)%比(47.0±6.4)%，P<0.01]和I/R+EdCC 30 d組[(39.1±8.9)%比(47.0±6.4)%，P<0.05]的梗死面積明顯小于I/R組，其余各組間差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)(圖5)。

討論

EnSCs具有間充質(zhì)干細(xì)胞特性，是目前極具潛力的干細(xì)胞產(chǎn)品的種子細(xì)胞，但直接移植間充質(zhì)干細(xì)胞存在多種風(fēng)險：(1)干細(xì)胞因缺乏Connexin 43表達(dá)[14- 15]或無法與正常心肌形成節(jié)律偶聯(lián)[16- 17]，將在移植局部形成傳導(dǎo)阻滯區(qū)導(dǎo)致折返性心律失常，也可能通過降低心肌細(xì)胞傳導(dǎo)速度形成致心律失?；|(zhì)[10]；(2)體外短期培養(yǎng)的間充質(zhì)干細(xì)胞可能出現(xiàn)染色體畸形，移植后導(dǎo)致腫瘤形成[11]；(3)細(xì)胞表面的組織因子引起經(jīng)血管途徑注射后血栓栓塞[12]。近來研究提示，干細(xì)胞的旁分泌效應(yīng)是治療心肌梗死的重要機(jī)制[7]。故本研究采用EdCC注射代替EnSCs移植，以期能避免直接細(xì)胞移植導(dǎo)致的致心律失常、腫瘤形成和血栓栓塞風(fēng)險。

I/R：缺血再灌注損傷；AAR/LV：危險區(qū)面積；IA/AAR：梗死面積；與I/R組比較，aP<0.01；與I/R+EdCC 50 μg組比較，bP<0.05

I/R：ischemic reperfusion injury；AAR/LV：risk area；IA/AAR：infarct area；aP<0.01 compared with I/R group；bP<0.05 compared with I/R+EdCC 50 μg group

A.心臟TTC/Evans Blue染色；B.定量分析危險區(qū)面積；C.定量分析梗死面積

A.representative images of TTC/Evans Blue staining of mouse heart；B.quantification of AAR/LV%；C.quantification of IA/AAR%

圖 3EdCC劑量對梗死面積的影響

Fig 3Influence of EdCC dosage on infarct size

與I/R組比較，aP<0.05，bP<0.01

aP<0.05，bP<0.01 compared with I/R group

A.心臟冰凍切片TUNEL染色，藍(lán)色熒光為細(xì)胞核，綠色熒光為TUNEL陽性細(xì)胞核(箭頭)；B. 定量分析梗死周邊區(qū)凋亡細(xì)胞數(shù)量(n=6)；C. Western blot檢測cleaved caspase 3結(jié)果；D.定量分析cleaved caspase 3表達(dá)水平(n=3)

A.representative images of TUNEL positive nuclei in the infarct border zone，blue fluorescence denotes nuclei and green fluorescence denotes apoptotic nuclei (arrow)；B.quantification of the apoptotic nuclei(n=6)；C. Western blotting of cleaved caspase 3；D.quantification of the ratio of cleaved caspase 3 and β-actin(n=3)

圖 4EdCC減少細(xì)胞凋亡，抑制caspase 3活化

Fig 4EdCC reduced cell apoptosis and inhibited activation of caspase 3

與I/R組比較，aP<0.05，bP<0.01

aP<0.05，bP<0.01 compared with I/R group

A.心臟TTC/Evans Blue染色；B.定量分析危險區(qū)面積；C.定量分析梗死面積

A.representative images of TTC/Evans Blue staining of mouse heart；B.quantification of AAR/LV%；C.quantification of IA/AAR%

圖 5-80℃凍存對EdCC心肌保護(hù)效應(yīng)的影響

Fig 5Influence of-80 ℃ storage on the myocardial protective effect of EdCC

當(dāng)前急性心肌梗死最重要的治療措施是在時間窗內(nèi)盡早開通閉塞血管使心肌恢復(fù)血供[3]。隨著急性心肌梗死發(fā)病率的增加、急診再灌注治療的廣泛應(yīng)用，如何保護(hù)缺血心肌、減輕心肌I/R損傷越來越受到重視。本研究在心肌缺血30 min即松開活結(jié)使前降支恢復(fù)血流，即急診再灌注治療，研究設(shè)計接近真實(shí)臨床情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在心肌缺血5 min時經(jīng)尾靜脈注射EdCC可使梗死面積顯著縮小，說明EdCC可在靜脈注射后快速介導(dǎo)心肌保護(hù)作用。已知EnSCs經(jīng)心肌移植可激活細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2、信號傳導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子3和絲氨酸/蘇氨酸激酶促存活信號通路減少細(xì)胞凋亡[9]，推測EdCC的心肌保護(hù)效應(yīng)可能是通過上述信號通路介導(dǎo)。此外，microRNA可能也參與了該保護(hù)效應(yīng)[18]。研究發(fā)現(xiàn)，I/R損傷引起心肌細(xì)胞凋亡約占所有心肌細(xì)胞死亡的80%[19]，caspase 3活化形成cleaved caspase 3是細(xì)胞凋亡的主要執(zhí)行者[20]，抑制凋亡可以顯著縮小梗死面積[21]。本研究采用TUNEL染色發(fā)現(xiàn)，EdCC可顯著減少梗死周邊區(qū)凋亡細(xì)胞數(shù)量。Western blot檢測結(jié)果顯示，EdCC可明顯抑制心肌組織cleaved caspase 3表達(dá)，從細(xì)胞和蛋白水平證明了EdCC的抗凋亡作用。本研究還顯示，EdCC隨凍存時間延長心肌保護(hù)效應(yīng)逐漸降低，推測可能是因?yàn)榈鞍踪|(zhì)聚集、構(gòu)象改變導(dǎo)致生物學(xué)活性喪失[22]，如能優(yōu)化凍融過程或制備成凍干粉可進(jìn)一步提高EdCC儲存效率。

目前干細(xì)胞旁分泌效應(yīng)的研究主要存在以下問題：(1)多種因子的協(xié)同作用；(2)心肌梗死不同時期發(fā)揮治療效應(yīng)的因子不同；(3)因子濃度不同生物學(xué)效應(yīng)不同；(4)移植微環(huán)境影響旁分泌譜[23]。這些問題對深入理解旁分泌效應(yīng)造成巨大的障礙，需聯(lián)合基因、蛋白組學(xué)技術(shù)和質(zhì)譜分析才能進(jìn)一步探索并驗(yàn)證具體的有效治療成分[24]。隨著我國《干細(xì)胞臨床研究管理辦法(試行)》的發(fā)布，備受爭議的干細(xì)胞治療迎來新一輪曙光以及挑戰(zhàn)。本研究結(jié)果支持干細(xì)胞治療策略從細(xì)胞移植向細(xì)胞因子注射轉(zhuǎn)化的新方案，在建立EnSCs細(xì)胞庫的同時可建立商品化EdCC以供臨床研究及應(yīng)用。

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基金項目：國家自然科學(xué)基金(81460050)、貴州省科技廳科學(xué)技術(shù)基金(黔科合J字[2014]2112號)和貴州省衛(wèi)生廳科學(xué)技術(shù)基金(gzwkj2013- 1- 006) Supported by the National Natural Sciences Foundation of China (81460050)，the Science and Technology Foundation of Guizhou Provincial Science and Technology Department (黔科合J字[2014]2112號)，and the Science and Technology Foundation of Guizhou Provincial Health Department (gzwkj2013- 1- 006)

通信作者：韋方電話：0851- 85937194，電子郵件：weifanggzsy@qq.com

中圖分類號:R54

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

文章編號：1000- 503X(2016)03- 0253- 07

DOI：10.3881/j.issn.1000- 503X.2016.03.002

Corresponding author：WEI FangTel：0851- 85937194，E-mail：weifanggzsy@qq.com

(收稿日期：2015- 12- 25)

Effect of Endometrial Stem Cell-derived Cytokine Cocktail on a Mouse Model of Myocardial Reperfusion Injury

JIANG Zhi1，JIA Zhong-shen2，PAN Yu-jia1，2，LI An-jie1，WEI Fang1

1Department of Cardiology，Guizhou Provincial People’s Hospital，Guizhou 550002，China2Department of Clinical Medicine，Guizhou Medical University，Guizhou 550025，China

ABSTRACT：ObjectiveTo study the effect of endometrial stem cells (EnSCs) derived cytokine cocktail (EdCC) on myocardial ischemic reperfusion injury (I/R) in a mouse model. MethodsEdCC was concentrated from the culture medium of EnSCs with Millipore ultra-filtration technology and was administrated to a myocardial I/R mouse models through tail vein injection. The infarct area was determined by TTC/Evans Blue staining. The apoptotic cells were counted by TUNEL assay and the protein level of cleaved caspase 3 was evaluated by Western blotting. ResultsThe EdCC extraction efficiency was (222.4±29.3) μg/106 cells in every 24 h，but the protein gradually degraded under-80 ℃ storage. As compared with I/R group，100 μg fresh EdCC decreased infarct area (P=0.001)，reduced apoptotic nuclei in the infarct border (P=0.019)，and inhibited cleaved caspase 3 expression (P=0.002). Increasing EdCC dosage did not further reduce the infarct area. The myocardial protective effect of EdCC diminished after 90 days’ storage under-80 ℃. ConclusionEdCC reduces myocardial I/R injury through protecting cardiomyocytes from apoptosis within 30 days storage under-80 ℃.

Key words：endometrial stem cells；cytokine；myocardial infarction；ischemic reperfusion injury；apoptosis