王賢良，蘇立碩，毛靜遠，王　帥，趙國元，王　聰

天津中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院心血管科，天津 300193

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·論著·

理氣化痰活血方藥對大鼠冠脈微血管血栓形成及阻塞的影響

王賢良，蘇立碩，毛靜遠，王帥，趙國元，王聰

天津中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院心血管科，天津 300193

摘要：目的復制大鼠冠脈微血管血栓形成的動物模型，考察理氣化痰活血方藥對大鼠冠脈微血管血栓形成及血栓阻塞的影響。方法將清潔級健康雄性SD大鼠125只[體重為(300±25)g]順序編號，采用抽簽法隨機分為治療組(n=60)、對照組(n=60)及空白組(n=5)3組，治療組和對照組大鼠均通過經(jīng)心尖部向左心室內(nèi)注射月桂酸鈉建立大鼠冠脈微血管血栓形成動物模型，治療組術前1 d及術后給予理氣化痰活血方藥灌胃(1 ml/100 g，每日1次)，對照組術前1 d及術后給予蒸餾水灌胃(1 ml/100 g，每日1次)，兩組分別在術后1、24 h，7、14、21、28 d各時間點隨機處死5只大鼠，并留取心肌組織；空白組5只大鼠不予任何處理，正常飼養(yǎng)，在28 d時一并處死，留取心肌組織。心肌組織標本經(jīng)HE染色制作病理切片，觀察比較各組大鼠各時間點冠脈微血管血栓形成及微血管血栓阻塞情況。結果治療組和對照組大鼠經(jīng)心尖部注射月桂酸鈉后1 h即有冠脈微血管血栓形成，24 h左右血栓形成率最高；與空白組比較，治療組和對照組冠脈微血管均出現(xiàn)不同程度的阻塞情況。治療組術后各時間點冠脈微血管血栓形成率均明顯低于對照組(P<0.05或P<0.01)；治療組冠脈微血管血栓阻塞程度明顯輕于對照組(P<0.05或P<0.01)。結論通過注射月桂酸鈉可以成功誘導大鼠冠脈微血管血栓形成。理氣化痰活血方藥可減少大鼠冠脈微血管血栓形成，同時可改善大鼠冠脈微血管血栓阻塞程度。

關鍵詞：冠脈微循環(huán)；理氣化痰活血方藥；微血管血栓形成；微血管阻塞

ActaAcadMedSin，2016,38(3)：260-264

隨著心臟介入診療技術的廣泛開展，冠脈微循環(huán)障礙越來越引起人們的關注，臨床上冠脈微循環(huán)障礙常見于心臟X綜合征(cardiac syndrome X，CSX)、冠脈介入治療(percutaneous coronary intervention，PCI)術后無復流、高血壓和糖尿病導致的冠脈微血管病變等，在所有與冠脈微循環(huán)障礙相關的心臟疾病中，CSX最具代表性?，F(xiàn)代醫(yī)學的治療主要是承襲冠心病用藥，臨床效果并不令人十分滿意，而中醫(yī)藥在改善臨床癥狀甚者預后方面顯示出獨特優(yōu)勢。前期研究發(fā)現(xiàn)，氣滯痰阻血瘀是CSX的主要病機特征[1]，理氣化痰活血方藥可有效緩解CSX患者心絞痛癥狀，提高運動耐量[2]。本研究通過經(jīng)心尖部向左心室內(nèi)注射月桂酸鈉復制大鼠冠脈微血管血栓形成動物模型，模擬臨床患者發(fā)作心絞痛而大冠脈無有意義狹窄的情況，評估了理氣化痰活血方藥對大鼠冠脈微血管血栓形成及血栓阻塞的影響。

材料和方法

實驗動物清潔級健康雄性SD(Sprague-Dawley)大鼠125只，體重(300±25) g，購自中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院衛(wèi)生學環(huán)境醫(yī)學研究所動物實驗中心[許可證號：SCXK(軍)2014- 0001]。

實驗藥物理氣化痰活血方藥主要組成：柴胡、枳殼、瓜蔞皮、薤白、云苓、白術、陳皮、川芎、當歸、丹參、延胡索、紅花等。飲片購于天津中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院藥劑科，由天津市石天藥業(yè)有限責任公司加工成2.25 g/ml的濃縮劑。

實驗試劑及儀器水合氯醛(上海阿拉丁生化科技股份有限公司)、月桂酸鈉粉劑(天津市百世化工有限公司)、利多卡因注射液(東北制藥集團沈陽第一制藥廠)、肝素鈉注射液(常州千紅生化制藥股份有限公司)、40萬U青霉素粉針劑(石家莊石藥集團中諾藥業(yè)有限公司)、10%中性福爾馬林溶液(上海麥克林生化科技有限公司)、10%氯化鉀注射液(武漢濱湖雙鶴藥業(yè)有限責任公司)，小動物體重臺稱(上?；ǔ彪娖饔邢薰?，BP310S電子天平(德國Sartorius公司)，小動物呼吸機(ALC-V8型動物呼吸機,上海奧爾科特生物科技有限公司)，Olympus光學顯微鏡及圖像觀察系統(tǒng)(日本Olympus儀器有限公司)。

動物分組及給藥將大鼠稱重編號后，采用抽簽法隨機分為治療組(n=60)、對照組(n=60)及空白組(n=5) 3組，觀察性飼養(yǎng)7 d。治療組術前1 d及術后給予理氣化痰活血方藥(1 ml/100 g)灌胃，每天定時1次；對照組術前1 d及術后給予蒸餾水(1 ml/100 g)灌胃，每天定時1次；空白組每天予蒸餾水(1 ml/100 g)灌胃，每天定時1次。

模型制作大鼠稱重并予10%水合氯醛(3 ml/kg)腹腔注射麻醉，將大鼠取仰臥位固定，常規(guī)頸部及胸部備皮消毒，頸部正中切開皮膚鈍性分離暴露氣管，直視下經(jīng)氣管插管，連接小動物呼吸機輔助通氣，于左側第2肋間水平靠近胸骨左緣縱向切開肌肉，依次剪斷第2肋、第3肋、第4肋，尋找并暴露主動脈，用自制擴胸器向左右兩側擴張胸腔，使心尖部位暴露，使用一次性0.1 ml注射器由心尖部刺入左心室腔內(nèi)，迅速注入月桂酸鈉1 ml/kg(濃度1 mg/ml)，同時夾閉主動脈升部與主動脈弓連接處10 s，以使注入的月桂酸鈉試劑順利進入冠狀動脈。注射完成后迅速將心臟放入胸腔，待心跳平穩(wěn)后縫合肋骨和胸骨，關閉胸腔，逐層縫合肌肉、皮下組織和皮膚，待呼吸平穩(wěn)后拔除氣管插管。術中或術后出現(xiàn)心臟驟停或者呼吸停止，給予胸外心臟按壓。術后常規(guī)給予青霉素80萬U腹腔注射預防感染，連續(xù)注射3 d，待大鼠完全蘇醒后送回鼠籠飼養(yǎng)。

標本采集及觀察每組大鼠于實驗終點時沿心臟長軸取約2 mm厚心肌組織，置于10%中性甲醛液保存，行HE染色。視野(×100)下隨機觀察10根管壁直徑<100 μm的冠脈微血管，觀察冠脈微血管內(nèi)血栓情況及冠脈微血管阻塞情況，計數(shù)被栓塞的血管數(shù)量，并計算其占所觀察的微血管的百分率，觀察冠脈微血管血栓阻塞程度，冠脈微血管血栓栓塞程度分為：(1)輕度：微血管阻塞<30%；(2)中度：微血管阻塞30%～70%；(3)重度：微血管嚴重阻塞70%～100%。

統(tǒng)計學處理采用Excel 2007和SPSS 13.0統(tǒng)計軟件，所得數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示，單變量計量資料樣本均數(shù)間比較，若符合正態(tài)分布采用單因素方差分析；多重比較用LSD或SNK法，若方差不齊，則用Games-Howell分析；組間兩兩比較采用t檢驗，個別不符合正態(tài)分布數(shù)據(jù)則釆用非參數(shù)檢驗；P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結果

一般情況對照組60只大鼠中，術中死亡16只，造模成功后死亡11只；治療組60只大鼠中，術中死亡14只，造模成功后死亡8只；兩組間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

大鼠冠脈微血管原位血栓形成情況HE染色結果顯示，對照組和治療組大鼠冠脈微血管均可見白色或混合血栓形成，空白組大鼠冠脈微血管內(nèi)未見明顯血栓形成 (圖1)。

理氣化痰活血方藥對大鼠冠脈微血管血栓形成的影響治療組大鼠術后各時間點冠脈微血管血栓形成率均明顯低于對照組(P<0.05或P<0.01) (表1)。

理氣化痰活血方藥對冠脈微血管血栓阻塞程度的影響對照組各時間點冠脈微血管阻塞程度均較治療組明顯嚴重，對照組冠脈微血管阻塞重度和中度阻塞所占比重大，治療組冠脈微血管阻塞輕度阻塞所占比重較多，差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05或P<0.01)(表2～4，圖2)。

A.對照組；B.治療組；C.空白組

A. control group；B. treatment group；C. blank group

圖 13組大鼠冠脈微血管形成情況(HE，×200)

Fig 1Coronary microvessles in three groups(HE，×200)

表 1　3組大鼠術后各時間點冠脈微血管血栓率(x-±s，%)

與對照組比較，aP<0.05，bP<0.01

aP<0.05，bP<0.01 compared with control group

表 2　對照組和治療組大鼠術后各時間點冠脈微血管輕度阻塞情況的比較(n=30，x-±s，%)

表 3　對照組和治療組大鼠術后各時間點冠脈微血管中度阻塞情況的比較(n=30，x-±s，%)

表 4　對照組和治療組大鼠術后各時間點冠脈微血管重度阻塞情況的比較(n=30，x-±s，%)

A. 輕度阻塞(×200)；B. 中度阻塞(×200)；C. 重度阻塞(×400)

A. mild obstruction (×200)；B. moderate obstruction (×200)；C. severe obstruction (×400)

圖 2大鼠冠脈微血管阻塞情況(HE)

Fig 2Coronary microvascular obstruction in rats(HE)

討論

冠脈微循環(huán)由冠狀動脈微血管組成，冠狀動脈微血管指直徑<150 μm的血管(包括細動脈、毛細血管、細靜脈等)，冠脈微循環(huán)的完整和暢通是心肌灌注的重要保障。隨著冠脈微循環(huán)障礙檢測技術的不斷提高及其評估體系的日臻完善，冠脈微循環(huán)障礙所引起的臨床表現(xiàn)及其對心臟疾病診斷、治療及預后的影響日漸受到重視。冠脈微血管血栓形成、心外膜血管斑塊破潰脫落進入微循環(huán)等，都可能導致冠脈微循環(huán)障礙，其中冠脈微血管內(nèi)形成的原位血栓是造成冠脈微循環(huán)障礙的常見原因[3]。目前建立冠脈微循環(huán)障礙動物模型的常見方法中，本研究采用的化學損傷法最符合臨床冠脈微循環(huán)障礙的發(fā)病機制和特點[4- 5]。

冠脈微循環(huán)障礙以胸悶、胸痛為主要臨床表現(xiàn)，相當于中醫(yī)“胸痹”、“心痛病”范疇。本課題組前期研究結果顯示，CSX發(fā)病的關鍵因素在于氣滯、痰阻、血瘀，三者相互影響、相互轉化痹阻心脈[1],并證實了理氣化痰活血方藥在改善CSX患者臨床癥狀及中醫(yī)證候、保護血管內(nèi)皮等方面的效果[2]。方中柴胡、積殼、瓜萎皮、薤白解郁理氣寬胸，為君藥；川芎、當歸、丹參、延胡索、紅花行氣活血止痛，為臣藥；佐以茯苓、白術、陳皮健脾化痰。諸藥相伍，理氣而不傷氣，化痰而不剛燥，活血而不損血，共奏理氣化痰活血之功?，F(xiàn)代中藥藥理研究結果表明，柴胡皂苷可以減少冠脈微血管中白細胞的附著，減輕炎癥反應[5]；枳殼、陳皮、延胡索藥理研究表明可以增加冠脈流量，降低心肌氧耗量[6- 7]；薤白、當歸、川芎、丹參、紅花藥理研究表明，能顯著延長小鼠凝血時間，有抑制凝血和抗血栓形成的作用[8- 11]。本研究結果則顯示，理氣化痰活血方藥可以有效減少冠脈微血管血栓形成，降低冠脈微血管血栓阻塞程度，其可能作用機制尚待進一步探討。

參考文獻

[1]毛靜遠，王恒和，葛永彬.心臟X綜合征的中醫(yī)治療[J].中西醫(yī)結合心腦血管病雜志，2007，5(5)：377- 379.

[2]王賢良，毛靜遠，王恒和，等.理氣寬胸活血法治療心臟X綜合征的臨床研究[J].上海中醫(yī)藥雜志，2009，43(1)：33- 35.

[3]陳良，蔣錦琪，張良道.大白兔冠狀動脈微血栓模型的建立[J].臨床心血管病雜志，2012，28(1)：76- 79.

[4]蘇立碩，王賢良，毛靜遠，等.冠狀動脈微循環(huán)障礙動物模型建立的方法及評析[J].中國醫(yī)學科學院學報，2014，36(5)：542- 545.

[5]沈成興，梁春，陳良龍，等.經(jīng)冠狀動脈內(nèi)注射月桂酸鈉構建大鼠冠狀動脈微栓塞模型[J].中國動脈硬化雜志，2005，13(4)：447- 450.

[6]李書啟.柴胡疏肝散抗氧化活性及其活性成分柚皮苷藥代動力學的研究[D].北京：北京化工大學，2010：35- 36.

[7]陸紅玲，韓連奎，劉達興，等.橙皮苷對缺血再灌注損傷模型大鼠心肌組織保護作用的研究[J].中國藥房，2012，23(3)：203- 205.

[8]邱蓉麗，李祥，陳建偉，等.延胡索總生物堿抗心肌缺血的實驗研究[J].中國中醫(yī)藥科技，2001，8(4)：265.

[9]姜靜，尚寧，奚肇慶，等.復方薤白膠囊對野百合堿誘導肺動脈高壓大鼠血漿中花生四烯酸代謝產(chǎn)物的影響[J].中華呼吸和結核雜志，2005，28(8)：534- 536.

[10]張旭靜，曹奕豐，馮春紅，等.川芎、當歸萃取液對大鼠血栓形成影響[J].中國臨床醫(yī)藥雜志，2002，11(1)：45- 46.

[11]葉挺祥.丹酚酸B對血管內(nèi)皮細胞NO合成的影響[D].天津：天津大學，2006：47- 48.

[12]張宏宇，陳沫，熊文激，等.紅花黃色素抗血栓和降血脂作用的實驗研究[J].中國實驗診斷學，2010，14(7)：1028- 1031.

基金項目：國家自然科學基金(81202799)和教育部“創(chuàng)新團隊發(fā)展計劃”(IRT1276)Supported by the National Natural Sciences Foundation of China (81202799) and the Ministry of Education of People’s Republic of China“Program for Innovative Research Team in University”(IRT1276)

通信作者：毛靜遠電話：022- 27986008，電子郵件：jymao@126.com

中圖分類號:R256.22

文獻標志碼:A

文章編號：1000- 503X(2016)03- 0260- 05

DOI：10.3881/j.issn.1000- 503X.2016.03.003

Corresponding author：MAO Jing-yuanTel：022- 27986008，E-mail：jymao@126.com

(收稿日期：2015- 07- 02)

Effect of Qi-regulating，Phlegm-resolving，and Blood-promoting Prescription on Rat Coronary Microvascular Thrombosis and Coronary Microvascular Occlusion

WANG Xian-liang，SU Li-shuo，MAO Jing-yuan，WANG Shuai，ZHAO Guo-yuan，WANG Cong

Department of Cardiology，F(xiàn)irst Teaching Hospital of Tianjin University of TCM，Tianjin 300193，China

ABSTRACT：ObjectiveTo explore the effect of qi-regulating，phlegm-resolving，and blood-promoting prescription on coronary microvascular thrombosis and coronary microvascular occlusion in rat models. MethodsTotally 125 healthy clean-grade male SD rats weighing (300±25) g were sequentially numbered and then randomly divided into treatment group (n=60)，control group (n=60) and blank group (n=5).Rats in the treatment group and control group received apical left ventricular injection of sodium laurate to establish rat models of coronary microvascular thrombosis. Then，rats in the control group were given distilled water by gavage one day before operation and after surgery. In contrast，rats in the treatment group were given qi-regulating，phlegm-resolving，and blood-promoting prescription by gavage one day before operation and after surgery. Five rats from both treatment group and control group were killed at each of six time points (1 hour，24th hour，7th day，14th day，21th day，and 28th day)，and the myocardium specimens were harvested. The 5 rats in the blank group did not receive any special treatment and were given normal feeding；in the 28th day，they were sacrificed to obtain the myocardial specimens. Pathological sections of rat myocardial tissues were made to observe and compare the degrees of coronary microvascular thrombosis and coronary microvascular obstruction. ResultsIn the treatment group and the control group，coronary microvascular thrombosis occurred 1 hour after apical sodium laurate injection and reached the peak at the 24th hour. Compared with the blank group，the treatment group and the control group showed different degree of coronary microvascular obstruction. Comparison between the treatment group and the control group at each time point showed that the coronary microvascular thrombosis in the treatment group was significantly lower than that in the control group (P<0.05 or P<0.01).The severity of coronary microvascular occlusion was significantly milder in the treatment group than in the control group (P<0.05 or P<0.01). ConclusionsApical left ventricular injection of sodium laurate successfully established rat models of coronary microvascular thrombosis. Qi-regulating，phlegm-resolving，and blood-promoting prescription can reduce coronary microvascular thrombosis and improve coronary microvascular obstruction.

Key words：coronary microcirculation；qi-regulating,phlegm-resolving,and blood-promoting prescription；coronary microvascular thrombosis；coronary microcirculation disturbance