沙志強(qiáng)，沙龍澤，許　琪

中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所　北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)學(xué)院　生物化學(xué)與分子生物學(xué)系醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100005

?

·論著·

CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白同源蛋白與鈣聯(lián)蛋白在內(nèi)側(cè)顳葉癲癇模型小鼠海馬中的表達(dá)

沙志強(qiáng)，沙龍澤，許琪

中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)系醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100005

摘要：目的觀察CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白同源蛋白(CHOP)及鈣聯(lián)蛋白(CNX)在內(nèi)側(cè)顳葉癲癇小鼠海馬區(qū)域中表達(dá)的時(shí)間和空間分布。方法采用海人酸(KA)誘導(dǎo)內(nèi)側(cè)顳葉癲癇小鼠模型，免疫印跡和免疫熒光技術(shù)檢測CHOP和CNX在急性期(12、24 h)小鼠海馬CA3區(qū)的表達(dá)量及分布差異，并與注射PBS的正常小鼠進(jìn)行對照。結(jié)果免疫印跡檢測結(jié)果顯示，KA注射后12 h小鼠海馬中的CHOP(F=1.136，P=0.4069)和CNX表達(dá)量(F=2.378，P=0.2087)與對照組差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，KA注射后24 h注射側(cè)海馬中的CHOP(F=8.510，P=0.0362)和CNX表達(dá)量(F=6.968，P=0.0497)明顯高于對照組。免疫熒光結(jié)果顯示，KA注射后12 h CHOP的表達(dá)主要集中于CA3區(qū)，注射后24 h 在CA1和CA3區(qū)表達(dá)水平均升高；KA注射后24 h CHOP蛋白(F=24.480，P=0.0057)和CNX蛋白(F=7.149，P=0.0478)的表達(dá)量顯著高于對照組。結(jié)論伴隨著癲癇發(fā)作的產(chǎn)生，CHOP蛋白表達(dá)量上升，提示神經(jīng)元內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激水平不斷增加，可能需要更多CNX作為分子伴侶幫助更多未折疊蛋白完成折疊過程。

關(guān)鍵詞：內(nèi)側(cè)顳葉癲癇；內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激；CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白同源蛋白；鈣聯(lián)蛋白

ActaAcadMedSin，2016,38(3)：265-270

內(nèi)側(cè)顳葉癲癇(medial temporal lobe Epilepsy，mTLE)是一種常見的神經(jīng)系統(tǒng)疾病，以腦部神經(jīng)元的過度同步化放電和自發(fā)反復(fù)性的癲癇發(fā)作為主要臨床表現(xiàn)[1]，也是常見的藥物難治性癲癇[2]，其反復(fù)性發(fā)作的致病灶位于硬化的海馬。盡管mTLE的臨床表現(xiàn)各有不同，但仍具有以下相似的病理表現(xiàn)：(1)神經(jīng)元丟失，尤其是CA1和CA3的椎體神經(jīng)元；(2)膠質(zhì)細(xì)胞增生；(3)門區(qū)苔狀纖維發(fā)芽[3]。其超微結(jié)構(gòu)的變化表現(xiàn)為：(1)胞漿濃縮，細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器減少；線粒體膨脹，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張；(2)核膜模糊，染色質(zhì)濃縮，部分與核膜融合；(3)出現(xiàn)凋亡小體的[4]。目前對于癲癇發(fā)生過程中細(xì)胞內(nèi)環(huán)境改變的分子機(jī)制尚不十分清楚，因此,探尋細(xì)胞內(nèi)環(huán)境改變潛在的蛋白表達(dá)模式對研究mTLE的發(fā)生及發(fā)展有著重要的意義。

CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白同源蛋白(CCAAT/enhancer-binding protein homologous protein，CHOP)是經(jīng)典的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)志物之一，可通過形成異源二聚體與靶基因結(jié)合參與細(xì)胞分化、凋亡及炎癥等過程[5- 8]。Sokka等[9]研究發(fā)現(xiàn)，利用海人酸(kainic acid，KA)誘導(dǎo)的癲癇大鼠模型可引起海馬神經(jīng)元內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激現(xiàn)象，而真核起始因子2α(eukaryotic initiation 2α，eIF2α)磷酸化抑制劑能有效降低KA誘導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激效應(yīng)及神經(jīng)元凋亡，提示內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激效應(yīng)參與了由谷氨酸受體激活介導(dǎo)的細(xì)胞毒性產(chǎn)生過程，進(jìn)而可能參與癲癇發(fā)生過程。鈣聯(lián)蛋白(calnexin，CNX)作為細(xì)胞中重要的類凝集素伴侶分子，參與了許多重要的生物學(xué)功能，包括輔助糖蛋白的折疊和裝配，并參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白質(zhì)量控制系統(tǒng)及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)蛋白的降解途徑，可緩解內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)鈣離子穩(wěn)態(tài)。Murphy等[10]通過體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，離體海馬培養(yǎng)在培養(yǎng)基中加入KA后，CNX表達(dá)量會(huì)隨著細(xì)胞凋亡進(jìn)程而顯著增加，提示CNX參與了細(xì)胞凋亡進(jìn)程，同時(shí)也可能與mTLE的病理表現(xiàn)相關(guān)。本研究觀察了癲癇模型鼠海馬中CHOP及CNX的表達(dá)量和空間分布情況，初步探究了兩種蛋白與癲癇發(fā)生的關(guān)系。

材料和方法

材料SPF級C57BL/6雄性8周齡小鼠24只(北京維通利華有限公司)，體重18～20 g；電動(dòng)10%水合氯醛溶液(北京協(xié)和醫(yī)院)，KA(美國Sigma公司)，Alex488 anti-Rabbit二抗(美國Invitrogen公司)，CNX(美國Stressgen公司)；CHOP(美國Bioworld公司)；DAPI(美國Invitrogen公司)；進(jìn)樣器(中國，深圳沃瑞德科技有限公司)，手持式顱骨鉆(中國，深圳沃瑞德科技有限公司)，腦力體定位儀(深圳瑞沃德生命科技有限公司)，LEICA EG1150H包埋機(jī)、LEICA RM2255 石蠟切片機(jī)、LEICA熒光倒置顯微鏡(美國Leica公司)。

癲癇小鼠模型的建立及分組用100 μl 10%水合氯醛溶液經(jīng)腹腔注射小鼠，10 min后按住小鼠腿部無震顫性動(dòng)作后視為麻醉成功。將小鼠固定于立體定位儀，門齒置于門齒鉗，雙耳插入耳桿，使其兩端平衡。將小鼠頭部毛發(fā)剪凈，剪開頭皮，用3%雙氧水清洗頭皮黏膜，暴露頭骨，以前鹵點(diǎn)為原點(diǎn)，于前鹵點(diǎn)后2.0 mm、矢狀線旁向右1.8 mm用黑色marker筆標(biāo)注。將微型電動(dòng)顱鉆的檔位調(diào)成4號檔，用鑷子將周圍頭皮拉開，使電鉆垂直于顱骨鉆開直徑約1 mm的孔洞，隨后將微量進(jìn)樣針緩慢插入腦組織，深度為2.3 mm，注入50nl PBS(對照組，n=3)或200ng KA(實(shí)驗(yàn)組，n=3)，注射后留針2 min防止藥物回流。抽出進(jìn)樣針，縫合頭皮，適量涂抹青霉素軟膏防止感染，隨即將小鼠置于37 ℃熱臺上，待其恢復(fù)放回籠中。

免疫熒光檢測注射藥物12、24 h后，將小鼠用4%多聚甲醛進(jìn)行心臟灌流處理，然后取腦，并放入4%多聚甲醛48 h，然后換80%乙醇浸泡48 h，包埋切片。在進(jìn)行免疫熒光檢測，先脫蠟至水，然后在檸檬酸-檸檬酸鈉溶液中高溫高壓抗原修復(fù)5 min，待溶液溫度降至室溫后，取出切片加入3%BSA室溫封閉1 h。加入用1%BSA稀釋的一抗，4 ℃孵育過夜，然后用加入1‰Tween- 20的0.01 mol/L PBS清洗3×15 min，加入用1%BSA稀釋的二抗，室溫孵育1 h，然后再次用1‰Tween- 20的0.01 mol/L PBS清洗3×15 min，加入用0.01 mol/L PBS稀釋的DAPI核染料，室溫孵育5 min，最后用0.01 mol/L PBS清洗后，封片、拍照。

免疫印跡檢測將蛋白樣品與上樣緩沖液混合，上樣至電泳。濃縮膠電泳電壓 80V，電泳時(shí)間約10 min，當(dāng)樣品至分離膠時(shí)，調(diào)節(jié)電壓至120V，電泳時(shí)間約1.5 h。采用濕法轉(zhuǎn)膜(NC膜)，恒流 300 mA，4 ℃轉(zhuǎn)膜1 h。轉(zhuǎn)膜后將膜從電轉(zhuǎn)槽中取出，浸沒于事先配置好的封閉液中，室溫?fù)u蕩1 h。一抗和抗體稀釋液按照 1∶1000 的比例配置，將 NC 膜放入抗體稀釋液，4 ℃孵育過夜。用TBST進(jìn)行3×15 min洗膜，然后用NC方法二抗稀釋液，室溫孵育1 h，再次用TBST進(jìn)行3×15 min洗膜，最后采用ECL法曝光顯影。

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理免疫熒光和免疫印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用Image J軟件進(jìn)行熒光強(qiáng)度與灰度值分析。采用Prism5.0統(tǒng)計(jì)軟件，組間比較采用ANOVA分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

造模情況對照組小鼠注射PBS后生命活動(dòng)正常，未發(fā)現(xiàn)明顯的行為學(xué)異常及癲癇樣發(fā)作。實(shí)驗(yàn)組小鼠注射KA幾分鐘后即呈現(xiàn)面部肌肉抽搐等表現(xiàn)；麻醉緩解后，小鼠呼吸急促，表現(xiàn)出節(jié)律性點(diǎn)頭樣發(fā)作、咀嚼及磨牙等行為，注射KA 20 min后出現(xiàn)前肢抽搐性發(fā)作，隨后漸漸減弱，1.5～3 h后漸漸恢復(fù)正常。

CHOP在癲癇發(fā)作急性期的表達(dá)免疫印跡結(jié)果顯示，KA注射后12 h小鼠海馬中的CHOP表達(dá)量略高于對照組小鼠，但差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=1.136，P=0.4069)；KA注射后24 h注射側(cè)海馬中的CHOP表達(dá)量明顯高于對照組(F=8.510，P=0.0362)(圖1A、B)。免疫熒光結(jié)果顯示，KA注射后12 h CHOP的表達(dá)主要集中于CA3區(qū)(圖1C、D)；注射后24 h CHOP蛋白不僅在CA1與CA3區(qū)表達(dá)水平升高(F=24.480，P=0.0057)，表達(dá)CHOP的神經(jīng)元數(shù)量也增加，在門區(qū)及齒狀回顆粒下層(subgranular zone，SGZ)區(qū)域同時(shí)也有低水平表達(dá)(圖2)。

CNX在癲癇發(fā)作急性期的表達(dá)免疫印跡結(jié)果顯示，KA注射后12 h小鼠海馬中的CNX表達(dá)水平與對照組差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=2.378，P=0.2087)，注射后24 h CNX表達(dá)量則顯著高于對照組(F=6.968，P=0.0497)(圖3A、B)。免疫熒光結(jié)果顯示，KA注射后24 h CNX在CA3區(qū)的表達(dá)量顯著高于對照組(F=7.149，P=0.0478)(圖3C、D)。

討論

長期癲癇反復(fù)發(fā)作可伴隨神經(jīng)元壞死、丟失及膠質(zhì)細(xì)胞增生和海馬硬化等病理表現(xiàn)。已有研究表明，反復(fù)癲癇發(fā)作1 h或驚厥發(fā)作0.5 h以上都會(huì)產(chǎn)生神經(jīng)元不可逆性損傷。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在神經(jīng)系統(tǒng)疾病，如帕金森、老年癡呆和阿爾茨海默病等中的作用已有廣泛研究[11]。Kitao等[12]研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激同樣參與了谷氨酸誘導(dǎo)的興奮性腦損傷。Sokka等[9]在體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)中均發(fā)現(xiàn)，CHOP蛋白在KA注射后24 h的癲癇大鼠海馬CA3區(qū)表達(dá)量顯著增加。Chen等[13]利用戊四唑(pentylenetetrazol，PTZ)誘導(dǎo)的癲癇大鼠模型，在mRNA和蛋白水平也得出類似結(jié)論，即注射12 h后，CHOP在 mRNA水平達(dá)到峰值，而24 h時(shí)蛋白水平才達(dá)到最大值。Engel等[14]通過杏仁核注射KA誘導(dǎo)癲癇小鼠模型發(fā)現(xiàn)，CHOP蛋白表達(dá)量在注射后8 h達(dá)到峰值，在注射后24 h又逐漸降低至注射開始時(shí)的水平，推測這可能是由于不同建模方法所導(dǎo)致的。本研究通過海馬注射KA藥物誘導(dǎo)癲癇小鼠模型，在蛋白及組織學(xué)層面驗(yàn)證注射KA后24 h，CHOP的表達(dá)量顯著增強(qiáng)，但在空間表達(dá)分布卻呈現(xiàn)出與Chen等[13]實(shí)驗(yàn)結(jié)果不一致之處，即：注射KA后12 h，CHOP的表達(dá)主要集中于CA3區(qū)，而Chen等[13]在PTZ建立的癲癇鼠模型中未發(fā)現(xiàn)12 h時(shí)間點(diǎn)CHOP表達(dá)量上調(diào)的跡象；在注射后24 h，CHOP蛋白不僅在CA1和CA3區(qū)表達(dá)水平升高，且表達(dá)CHOP的神經(jīng)元數(shù)量也增加，同時(shí)門區(qū)及SGZ區(qū)域的神經(jīng)元細(xì)胞中也有低水平表達(dá)，而Chen等[13]在注射藥物24 h后只觀察到海馬CA3區(qū)CHOP表達(dá)量上調(diào)，并未發(fā)現(xiàn)其他區(qū)域表達(dá)上調(diào)現(xiàn)象。盡管如此，以上結(jié)果仍提示內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激參與了谷氨酸誘導(dǎo)的興奮性神經(jīng)元損傷的過程。

與對照組比較，aF=8.510，P=0.0362；bF=0.3907，P=0.7000；cF=24.480，P=0.0057

aF=8.510，P=0.0362；bF=0.3907，P=0.7000；cF=24.480，P=0.0057 compared with the control group

A. KA注射后12和24 h，CHOP蛋白在小鼠海馬注射側(cè)表達(dá)量升高；B.免疫印跡結(jié)果統(tǒng)計(jì)分析；C.KA注射后12和24 h，CHOP蛋白在注射側(cè)海馬CA3區(qū)中的染色情況；D. 免疫熒光結(jié)果統(tǒng)計(jì)分析

A. increased expression level of CHOP in the hippocampus 12 h and 24 h after KA injection；B. statistical analysis of Western blotting findings；C. immunostaining of CHOP in the CA3 of hippocampus 12 h and 24 h after KA injection；D. statistic analysis of immunofluorescence determination results

圖 1KA注射后12和24 h，注射側(cè)海馬CA3區(qū)域中 CHOP表達(dá)量的免疫印跡及免疫熒光強(qiáng)度分析(n=3)

Fig 1Western blot analysis and fluorescence intensity analysis of CHOP expression level in the CA3 of hippocampus 12 h and 24 h after KA injection(n=3)

圖 2CHOP蛋白在KA注射24 h后注射側(cè)海馬區(qū)域的空間表達(dá)分布

Fig 2Spatial distribution of CHOP in the hippocampus 24 h after KA injection

與對照組比較，aF=6.968，P=0.0497；bF=7.149，P=0.0478

aF=6.968，P=0.0497；bF=7.149，P=0.0478 compared with the control group

A. KA注射后12和24 h，鈣聯(lián)蛋白在小鼠海馬注射側(cè)表達(dá)量升高；B.免疫印跡結(jié)果統(tǒng)計(jì)分析；C.KA注射后12和24 h，鈣聯(lián)蛋白在小鼠注射側(cè)海馬CA3區(qū)中的染色情況；D. 免疫熒光結(jié)果統(tǒng)計(jì)分析

A. increased expression level of calnexin in the hippocampus 12 h and 24 h after KA injection in the mTLE mouse models；B. statistical analysis of Western blotting findings；C. immunostaining of calnexin in the CA3 of hippocampus 12 h and 24 h after KA injection；D. statistic analysis of immunofluorescence determination results

圖 3KA注射后12 h與24 h，注射側(cè)海馬CA3區(qū)域中的 Calnexin表達(dá)量免疫印跡及免疫熒光強(qiáng)度分析(n=3)

Fig 3Western blot analysis and fluorescence intensity analysis of calnexin expression level in the CA3 of hippocampus 12 h and 24 h after KA injection(n=3)

CNX作為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中重要的分子伴侶參與了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白質(zhì)的合成過程，具有重要的生物學(xué)功能。當(dāng)細(xì)胞中未折疊蛋白數(shù)量增加時(shí)，CNX可延長與錯(cuò)誤折疊蛋白或未成熟折疊蛋白的結(jié)合時(shí)間，并使其停留于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中完成正確折疊。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)鈣離子穩(wěn)態(tài)失衡或在外界極端條件刺激下導(dǎo)致的過多蛋白分泌及未成熟折疊的蛋白增加時(shí)，都可以形成內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，應(yīng)激信號傳入細(xì)胞核時(shí)，會(huì)引起一些誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的基因表達(dá)。Murphy等[10]利用體外培養(yǎng)海馬組織發(fā)現(xiàn)，在培養(yǎng)基中加入KA 24 h后，海馬中的CNX蛋白表達(dá)量升高，提示CNX可能作為一種保護(hù)性適應(yīng)參與的癲癇發(fā)生進(jìn)程。本研究結(jié)果顯示，KA注射24 h急性期癲癇小鼠海馬中CNX表達(dá)量顯著高于對照組，與以往結(jié)果一致，提示CNX可能參與了神經(jīng)元損傷修復(fù)及保護(hù)性適應(yīng)過程。但本研究還顯示，KA注射后12 h CHOP表達(dá)量上調(diào)的同時(shí)，CNX并沒有及時(shí)表達(dá)升高，且在注射后24 h只在CA3區(qū)表達(dá)略有升高，而在CA1區(qū)表達(dá)量并未顯著高于對照組，提示CNX可能并非是首要感受未折疊蛋白或協(xié)助完成蛋白加工折疊過程的分子伴侶。

綜上，本研究結(jié)果顯示，在癲癇小鼠模型的急性期中，CHOP和CNX的表達(dá)量隨著癲癇發(fā)生時(shí)間的推移而顯著上調(diào)，提示在神經(jīng)元丟失進(jìn)程中有內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)的參與，同時(shí)CNX也可能參與了神經(jīng)元保護(hù)性適應(yīng)及損傷修復(fù)等過程。

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基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金(31222031)和協(xié)和青年科研基金(2012J09)Supported by the National Natural Sciences Foundation of China (31222031) and the Union Youth Science & Research Fund (2012J09)

通信作者：許琪電話：010- 69156432，電子郵件：xuqi@pumc.edu.cn

中圖分類號:R43

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

文章編號：1000- 503X(2016)03- 0265- 06

DOI：10.3881/j.issn.1000- 503X.2016.03.004

Corresponding author：XU QiTel：010- 69156432，E-mail：xuqi@pumc.edu.cn

(收稿日期：2015- 01- 26)

Expressions of CCAAT/enhancer-binding Protein Homologous Protein and Calnexin in the Hippocampus of a Mouse Model of Mesial Temporal Lobe Epilepsy

SHA Zhi-qiang，SHA Long-ze，XU Qi

State Key Laboratory of Medical Molecular Biology，Department of Biochemistry and Molecular Biology，Institute of Basic Medical Sciences，CAMS and PUMC，Beijing 100005，China

ABSTRACT：ObjectiveTo explore the temporal and spatial distribution of CCAAT/enhancer-binding protein homologous protein (CHOP) and calnexin (CNX) in the dentate gyrus of mesial temporal lobe epilepsy (mTLE) mouse model. MethodsWe used kainic acid (KA) to induce acute phase (12 h and 24 h) mTLE mouse models and performed Western blotting and immunofluorescence to detect the different expressions and distribution pattern of CHOP and CNX in CA3 of the hippocampus. ResultsCompared with the controls，the expressions of CHOP(F=1.136，P=0.4069) and CNX (F=2.378，P=0.2087) did not increase in CA3 of hippocampus 12 h following KA injection in the acute phase of mTLE mouse models，whereas the expressions in CA1 and CA3 of hippocampus 24 h after injection were significantly higher (F=8.510，P=0.0362；F=6.968，P=0.0497，respectively). As shown by immunofluorescence analysis，CHOP was expressed mainly in CA3 of hippocampus 12 h after KA injection，and increased in CA1 and CA3 24 h after KA administration. Compared with the controls，the expressions of CHOP(F=24.480，P=0.0057) and CNX (F=7.149，P=0.0478) were significantly higher 24 h after KA injection.ConclusionsThe expression of CHOP increases along with the progression of seizures，indicating the increased level of endoplasmic reticulum stress. An increasing number of CNX，which serves as molecular chaperone，may be needed to facilitate the unfolded protein to complete the folding process.

Key words：mesial temporal lobe epilepsy；endoplasmic reticulum stress；CCAAT/enhancer-binding protein homologous protein；calnexin