潘奕鷗　王薇薇　李愛科　張衛(wèi)衛(wèi)　韓四海　劉建學(xué),3*

(1.河南科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，洛陽(yáng)471023；2.國(guó)家糧食局科學(xué)研究院，北京100037；3.河南省食品原料工程技術(shù)研究中心，洛陽(yáng)471023)

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阿魏酸對(duì)ob/ob小鼠脂肪沉積及腹脂脂肪酸組成的影響

潘奕鷗1,2,3王薇薇2李愛科2張衛(wèi)衛(wèi)1韓四海1劉建學(xué)1,3*

(1.河南科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，洛陽(yáng)471023；2.國(guó)家糧食局科學(xué)研究院，北京100037；3.河南省食品原料工程技術(shù)研究中心，洛陽(yáng)471023)

摘要：本試驗(yàn)旨在研究阿魏酸對(duì)ob/ob小鼠脂肪沉積和腹脂脂肪酸組成的影響。選取5周齡的雄性ob/ob小鼠30只，隨機(jī)分為3組(n=10)，分別飼喂在基礎(chǔ)飼糧中添加0(對(duì)照組)、0.25%和0.50%阿魏酸的試驗(yàn)飼糧，試驗(yàn)期9周。結(jié)果表明：與對(duì)照組相比，飼糧中添加0.25%和0.50%的阿魏酸顯著降低了ob/ob小鼠的總增重、腹脂率(P<0.05)，顯著降低了血清甘油三酯及肝臟甘油三酯和總膽固醇水平(P<0.05)，減少了肝臟脂滴積累，顯著降低了腹脂中棕櫚油酸和油酸的含量(P<0.05)，顯著降低了腹脂中棕櫚油酸/棕櫚酸和油酸/硬脂酸(P<0.05)。由此得出，阿魏酸可以抑制ob/ob小鼠的脂肪沉積，改善其腹脂脂肪酸組成，減重降脂效果明顯。

關(guān)鍵詞：阿魏酸；ob/ob小鼠；肥胖；脂肪沉積；脂肪酸組成

阿魏酸(ferulic acid,FA)化學(xué)名4-羥基-3-甲氧基-2-丙烯酸，是一種酚類化合物，普遍存在于中藥、糧食、蔬菜、水果中[1-2]，其在谷物麩皮中含量較高[3]，在全麥粉中的含量為1.252 g/kg，在玉米面中的含量更高達(dá)2.317 g/kg[4]。多酚類物質(zhì)如蘋果多酚、茶多酚和葡萄籽多酚一般具有強(qiáng)抗氧化性，對(duì)高血脂、糖尿病等有一定的調(diào)節(jié)作用[5-7]。FA也有極強(qiáng)的抗氧化性[8]，并對(duì)Ⅱ型糖尿病、高血壓和心腦血管疾病等有一定的治療效果[9-12]。肥胖病主要表現(xiàn)在機(jī)體脂肪的過量積累，并且是Ⅱ型糖尿病、心腦血管疾病等的主要誘發(fā)因素之一[13]。多酚類物質(zhì)及其衍生物，如富含F(xiàn)A的咖啡多酚、酒花多酚、沒食子酸、沒食子兒茶素和沒食子酸酯均具有抑制脂肪積累的效果[14-17]。Son等[18]研究發(fā)現(xiàn)，在飼糧中添加FA或FA酯化物質(zhì)谷維素可以顯著抑制高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖小鼠的體重增加，使總增重分別降低了47.50%和26.67%；Senaphan等[19]研究認(rèn)為，大鼠每天口服30或60 mg/kg BW的FA可以改善高脂高碳水化合物誘導(dǎo)的代謝綜合征，降低大鼠血清中甘油三酯(triglyceride,TG)和總膽固醇(total cholesterol,TC)的水平，并降低代謝綜合征大鼠的體重。但是這些報(bào)道并未以脂肪變化為研究重點(diǎn)，只對(duì)體重、血脂水平等進(jìn)行了檢測(cè)分析，而FA對(duì)肥胖機(jī)體脂肪沉積和脂肪代謝等方面的影響尚未見系統(tǒng)報(bào)道。ob/ob小鼠是瘦素基因缺陷型小鼠，在青年時(shí)期即會(huì)嚴(yán)重超重，并形成肥胖病相關(guān)的體脂紊亂，如高血脂、肝臟脂質(zhì)沉積等[20]。本試驗(yàn)以雄性ob/ob小鼠為研究對(duì)象，研究飼糧中添加不同量的FA(0.25%或0.50%)對(duì)ob/ob小鼠脂肪沉積和腹脂中脂肪酸組成的影響，旨在為進(jìn)一步探明FA對(duì)預(yù)防和治療肥胖病的功效提供科學(xué)依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料與儀器

FA標(biāo)準(zhǔn)品：粉末狀，純度≥99%，購(gòu)于上海晶純生化科技股份有限公司。

TG和TC檢測(cè)試劑盒購(gòu)于南京建成生物工程研究所，脂肪酸標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)于北京普析科技有限公司，其他常規(guī)試劑均為分析純。

主要試驗(yàn)儀器如下：SynergyTMHT酶標(biāo)儀(Biotek公司，美國(guó))；海爾立式超低溫保存箱(青島海爾特種電器有限公司)；Centrifuge-5810R型高速冷凍離心機(jī)(Eppendorf公司，德國(guó))；羅氏生化分析儀(Roche公司，瑞士)；7890A氣相色譜附氫火焰檢測(cè)器(FID)，色譜柱為DB-23(Agilent公司，美國(guó))；KD-BMⅢ生物組織包埋機(jī)、KD-3368AM切片機(jī)、KEDEE生物組織染色機(jī)(金華市科迪儀器設(shè)備有限公司)等。

1.2動(dòng)物飼養(yǎng)管理

30只5周齡、體重相近的雄性ob/ob小鼠，購(gòu)于北京華阜康生物科技股份有限公司，為無特定病原體級(jí)(specified pathogen free,SPF)。ob/ob小鼠基礎(chǔ)飼糧由南通特洛菲飼料科技有限公司提供，依照AIN-93M標(biāo)準(zhǔn)飼料配方設(shè)計(jì)，其組成及營(yíng)養(yǎng)水平見表1。ob/ob小鼠飼養(yǎng)在SPF實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房(國(guó)家糧食局科學(xué)研究院，北京)的獨(dú)立送風(fēng)籠具(individual ventilated cage,IVC)中。飼養(yǎng)室保持溫度(23±2) ℃，相對(duì)濕度50%，12 h/12 h光照日夜循環(huán)。配對(duì)飼喂，充足飲水，預(yù)飼1周。

1.3試驗(yàn)方法

1.3.1試驗(yàn)設(shè)計(jì)

將30只ob/ob小鼠隨機(jī)分成3組，每組10個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)1只，分籠飼養(yǎng)。對(duì)照組(CON組)、低劑量FA添加組(L-FA組)和高劑量FA添加組(H-FA組)ob/ob小鼠分別飼喂在基礎(chǔ)飼糧中添加0、0.25%和0.50% FA的試驗(yàn)飼糧。每周測(cè)定各組ob/ob小鼠體重、周采食量，稱重前禁食12 h，試驗(yàn)期為9周。

1.3.2樣品采集

采樣前禁食12 h，稱量ob/ob小鼠終體重。摘除小鼠眼球采集血樣，分離血清，凍存于-80 ℃待測(cè)。采集血樣后，ob/ob小鼠斷頸處死，解剖分離肝臟和腹部白色脂肪組織(white adipose tissue,WAT)，稱重后計(jì)算肝臟指數(shù)和腹脂率。取同一部位的肝組織，存于10%甲醛固定液中。剩余肝組織與WAT一并凍存于-80 ℃待測(cè)。

肝臟指數(shù)(%)=(肝臟重/體重)×100； 腹脂率(%)=(腹部WAT重/體重)×100。

表1　基礎(chǔ)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))Table 1　Composition and nutrient levels of the basal diet (air-dry basis)

礦物質(zhì)與維生素預(yù)混料為每千克飼糧提供The mineral and vitamin premix provided the following per kg of the diet：Ca 5 000 mg，P 3 000 mg，K 3 600 mg，Na 1 033 mg，Mg 511 mg，F(xiàn)e 45 mg，Zn 35 mg，Mn 10 mg，Cu 6 mg，I 0.2 mg，Cr 1 mg，S 300 mg，Cl 1 613 mg，VA 4 000 IU，VD 1 000 IU，VE 75 IU，VK 0.000 86 g，VB15 mg，VB26 mg，VB330 mg，VB515 mg，VB66 mg，膽堿 choline 1 000 mg，葉酸 folic acid 2 mg，生物素 biotin 0.2 mg，VB120.025 mg。

1.3.3血脂水平檢測(cè)

用生化分析儀檢測(cè)血清中TG、TC、高密度脂蛋白膽固醇(high density lipoprotein cholesterol,HDL-C)和低密度脂蛋白膽固醇(low density lipoprotein cholesterol,LDL-C)的水平。

1.3.4肝脂水平檢測(cè)

肝臟勻漿依照南京建成生物工程研究所提供的方法制備，按照檢測(cè)試劑盒說明書采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)肝臟中TG和TC水平。

1.3.5肝臟病理學(xué)分析

取固定24 h后的肝組織，包埋處理后，切片(厚度為5 μm)，經(jīng)蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin staining,HE)染色后在光學(xué)顯微鏡下以10×25倍視野觀察肝組織中脂滴大小和密度變化。

1.3.6腹脂脂肪酸組成檢測(cè)

按照GB/T 9695.7—2008操作，得到小鼠脂肪組織中的油脂，并按照GB/T 17367—2008的方法，用三氟化硼法對(duì)其脂肪酸進(jìn)行甲酯化，利用氣相色譜法(GB/T 17377—2008)分析其脂肪酸組成，主要包括棕櫚酸(palmitic acid,C16∶0)、棕櫚油酸(palmitoleic acid,C16∶1)、硬脂酸(stearic acid,C18∶0)和油酸(oleic acid,C18∶1)的含量(質(zhì)量百分?jǐn)?shù))，并計(jì)算C16∶1/C16∶0和C18∶1/C18∶0。

1.4數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SAS 9.0統(tǒng)計(jì)軟件中的ANOVA過程進(jìn)行單因素方差分析，P<0.05為差異顯著。

2結(jié)果

2.1FA對(duì)ob/ob小鼠體重、總增重和總采食量的影響

由圖1可知，飼養(yǎng)期初始，各組ob/ob小鼠體重均呈穩(wěn)定增長(zhǎng)趨勢(shì)，與CON組ob/ob小鼠相比，前4周L-FA組和H-FA組ob/ob小鼠的體重沒有顯著差異(P>0.05)。第5～6周，L-FA組和H-FA組ob/ob小鼠體重增長(zhǎng)趨于平緩。第7周開始至飼養(yǎng)期結(jié)束，L-FA組與H-FA組ob/ob小鼠體重均顯著低于CON組(P<0.05)。

同一時(shí)間點(diǎn)，數(shù)據(jù)點(diǎn)無字母或有相同字母標(biāo)注表示差異不顯著(P>0.05)，有不同小寫字母標(biāo)注表示差異顯著(P<0.05)。

At the same time piont, data points with no letter or the same letters mean no significant difference (P>0.05), while with different small letters mean significant difference (P<0.05).

圖1各組ob/ob小鼠每周體重變化

Fig.1Body weight change weekly ofob/obmice in groups

由表2可知，各組總采食量無顯著差異(P>0.05)，L-FA組與H-FA組ob/ob小鼠的總增重顯著低于CON組(P<0.05)。

表2　各組ob/ob小鼠的總增重和總采食量Table 2　Total weight gain and total feed intake of ob/ob mice in groups　g

同行數(shù)據(jù)肩標(biāo)無字母或相同字母表示差異不顯著(P>0.05)，不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。下表同。

In the same row, values with no letter or the same letter superscripts mean no significant difference (P>0.05), while with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05). The same as below.

2.2FA對(duì)ob/ob小鼠肝臟指數(shù)和腹脂率的影響

由表3可知，L-FA組與H-FA組ob/ob小鼠的肝臟重和肝臟指數(shù)與CON組無顯著差異(P>0.05)，但L-FA組和H-FA組ob/ob小鼠的肝臟重均有降低的趨勢(shì)(P<0.10)。與CON組相比，飼糧中添加0.25%或0.50%的FA顯著降低了ob/ob小鼠的腹部WAT重和腹脂率(P<0.05)。

2.3FA對(duì)ob/ob小鼠血脂水平的影響

由表4可知，飼糧中添加0.25%或0.50%的FA對(duì)ob/ob小鼠的血清TC和LDL-C水平均沒有產(chǎn)生顯著影響(P>0.05)。L-FA組與H-FA組ob/ob小鼠的血清TG水平顯著降低于CON組(P<0.05)，只有當(dāng)FA添加量為0.50%時(shí)，ob/ob小鼠的血清HDL-C水平才得到顯著提高(P<0.05)，L-FA組ob/ob小鼠的血清HDL-C水平與CON組無顯著差異(P>0.05)。

表3　各組ob/ob小鼠的肝臟指數(shù)和腹脂率Table 3　Liver index and abdomen lipid percentage of ob/ob mice in groups

表4　各組ob/ob小鼠血清TG、TC、HDL-C和LDL-C水平Table 4　Serum TG, TC, HDL-C and LDL-C levels of ob/ob mice in groups　mmol/L

2.4FA對(duì)ob/ob小鼠肝脂水平的影響

由表5可知，與CON組相比，飼糧中添加0.25%和0.05%的FA使ob/ob小鼠肝臟TG水平分別降低了50.00%和39.29%，肝臟TC水平降低了39.62%和43.72%，差異均達(dá)到顯著水平(P<0.05)。

表5　各組ob/ob小鼠肝臟TG和TC水平Table 5　Liver TG and TC levels of ob/ob mice in groups

2.5ob/ob小鼠肝臟病理學(xué)分析

由圖2可知，同為10×25倍視野下，CON組ob/ob小鼠肝臟脂滴大而密集(圖2-A)，而L-FA組ob/ob小鼠肝臟脂滴明顯減少(圖2-B)，并且大部分脂滴直徑小于CON組，H-FA組ob/ob小鼠肝臟脂滴大小與密集程度相對(duì)于CON組也得到了明顯改善(圖2-C)。

2.6FA對(duì)ob/ob小鼠腹脂脂肪酸組成的影響

由表6可知，F(xiàn)A對(duì)ob/ob小鼠腹脂中C16∶0和C18∶0含量無顯著影響(P>0.05)，但對(duì)C16∶1和C18∶1含量的增高有顯著的抑制作用(P<0.05)。L-FA組與H-FA組ob/ob小鼠腹脂中C16∶1/C16∶0和C18∶1/C18∶0顯著低于CON組(P<0.05)，且H-FA組C18∶1/C18∶0還顯著低于L-FA組(P<0.05)。

3討論

本試驗(yàn)通過在飼糧中添加一定量的FA，研究FA是否會(huì)對(duì)ob/ob小鼠的增重以及脂肪沉積和代謝有改善作用。本試驗(yàn)采用配對(duì)飼喂，使各組最終絕對(duì)總采食量無顯著差異，各組ob/ob小鼠平均FA日攝入量分別為：CON組，0 mg/d；L-FA組，7.6 mg/d；H-FA組，15.5 mg/d，符合試驗(yàn)所設(shè)計(jì)的FA攝入梯度。

A為CON組ob/ob小鼠肝臟組織切片，B為L(zhǎng)-FA組ob/ob小鼠肝臟組織切片，C為H-FA組ob/ob小鼠肝臟組織切片。

A, liver section ofob/obmice in CON group; B, liver section ofob/obmice in L-FA group; C, liver section ofob/obmice in H-FA group.

圖2　各組ob/ob小鼠肝臟組織切片HE染色觀察Fig.2　Observation on HE staining of liver tissue sections of ob/ob mice in groups (250×) 表6　各組ob/ob小鼠腹脂脂肪酸組成Table 6　Fatty acid composition in abdominal lipid of ob/ob mice in groups

由試驗(yàn)結(jié)果可知，L-FA組和H-FA組ob/ob小鼠的總增重分別比CON組減少了23.01%和19.4%，Son等[18]的研究表明在飼糧中添加0.50% FA可以使總增重降低26.67%，與此相一致，但本研究結(jié)果說明更小的FA添加量也可達(dá)到減重的效果。與之類似的，飼糧中添加0.25% FA使ob/ob小鼠的脂肪重減少了24.66%，腹脂率降低了18.58%，而H-FA組ob/ob小鼠的脂肪重和腹脂率分別減少了21.97%和16.17%。各組ob/ob小鼠的肝臟指數(shù)無顯著差異，飼糧中添加0.25%和0.50%的FA均使ob/ob小鼠的肝臟重降低了15.4%，有趨勢(shì)但不顯著，這說明FA對(duì)ob/ob小鼠脂肪沉積的抑制可能主要作用于脂肪組織。相對(duì)于CON組，L-FA組和H-FA組ob/ob小鼠肝臟中TG水平分別降低了50.00%和39.29%，TC水平分別降低了39.62%和43.72%，這與圖2顯示出的FA具有改善肝臟脂滴積累的作用相一致，說明0.25%和0.50% FA雖未顯著降低ob/ob小鼠的肝臟重，但可以抑制肝臟中脂質(zhì)的積累。不同的是，Wang等[21]的研究發(fā)現(xiàn)口服FA雖可以降低高脂飼糧誘導(dǎo)的肥胖大鼠肝臟中TC水平，但是TG水平只有降低的趨勢(shì)。其可能的原因是口服大量的FA與飼糧中含的FA在體內(nèi)消化吸收的效率不同。在血液中，HDL-C的主要功能是促進(jìn)血清中膽固醇的逆向轉(zhuǎn)運(yùn)[22]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，H-FA組ob/ob小鼠的血清HDL-C水平相對(duì)于CON組顯著提高，但血清TC水平?jīng)]有顯著變化。這與Marimuthu等[23]研究的結(jié)果并不相同，他們發(fā)現(xiàn)口服FA的代謝綜合征大鼠的血清HDL-C水平比CON組升高了74.56%，血清TC水平則降低了35.37%。結(jié)果的差異可能是FA的攝入量和攝入方式不同導(dǎo)致。L-FA組與H-FA組ob/ob小鼠的血清TG水平相比CON組分別降低了10.56%和6.11%，而Marimuthu等[23]也報(bào)道高脂血癥大鼠每天注射20 mL/kg FA可以顯著降低血清與肝臟中的TG水平，與此結(jié)果類似。

Jeyakumar等[24]研究發(fā)現(xiàn)，飲食誘導(dǎo)肥胖大鼠模型中，大鼠脂肪組織的C16∶1/C16∶0和C18∶1/C18∶0會(huì)升高，但是該研究并未關(guān)注FA對(duì)脂肪酸組成的影響。在本試驗(yàn)中，相對(duì)于CON組，L-FA組ob/ob小鼠腹脂中C16∶1/C16∶0和C18∶1/C18∶0分別顯著降低了15.59%和8.09%，H-FA組則分別降低了20.18%和13.62%，差異均達(dá)到顯著水平。FA對(duì)脂肪組織中C16∶0和C18∶0的含量沒有顯著的改善作用，但是FA降低了C16∶1和C18∶1的含量，從而降低了ob/ob小鼠腹脂中C16∶1/C16∶0和C18∶1/C18∶0。硬脂酰輔酶A脫氫酶(stearoyl-CoA desaturase,SCD)是一種內(nèi)質(zhì)網(wǎng)酶，可以催化不飽和脂肪酸的合成[25]。在缺少SCD基因的ob/ob小鼠中，脂肪組織中C16∶1和C18∶1的含量及C16∶1/C16∶0和C18∶1/C18∶0有所降低[26]。因此，本試驗(yàn)中FA可能通過下調(diào)SCD基因的表達(dá)，有效減少不飽和脂肪酸的合成，抑制ob/ob小鼠的脂肪合成進(jìn)程。

在本試驗(yàn)條件下，F(xiàn)A添加量為0.25%時(shí)較對(duì)ob/ob小鼠的總增重、腹脂、血清與肝臟的TG水平的改善作用都略高于添加量為0.50%時(shí)，但0.50%的FA對(duì)ob/ob小鼠的血清和肝臟TC水平有較好的改善效果。由此可知，若以減重降脂為目的，0.25%為較適宜添加量，若以降膽固醇為目的，則0.50%為較適宜添加量。FA等酚酸在人們?nèi)粘ｏ嬍持泻控S富，在玉米等粗糧中的含量接近0.25%，這就鼓勵(lì)人們?cè)谌粘ｏ嬍持卸嘁杂衩?、小米和糙米等富含F(xiàn)A等多酚類物質(zhì)的谷物作為主食，提高對(duì)此類植物化學(xué)素的攝取，達(dá)到預(yù)防肥胖的保健效果。

4結(jié)論

本試驗(yàn)條件下，飼糧中添加0.25%和0.50%的FA均能夠抑制ob/ob小鼠體重的增加，降低脂肪組織重量及腹脂率，降低血脂和肝脂水平，改善肝臟脂滴積累程度。以減重降脂為目的時(shí)，0.25%為較適宜添加量；以降膽固醇為目的時(shí)，0.5%為較適宜添加量。

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(責(zé)任編輯菅景穎)

doi：10.3969/j.issn.1006-267x.2016.07.019

收稿日期：2016-01-25

基金項(xiàng)目：公益性(糧食)行業(yè)專項(xiàng)“糧油營(yíng)養(yǎng)健康特性研究與基礎(chǔ)參數(shù)數(shù)據(jù)庫(kù)的構(gòu)建”(201313011-6)；河南省重點(diǎn)攻關(guān)項(xiàng)目“農(nóng)產(chǎn)品加工副產(chǎn)物的高效增值和循環(huán)利用關(guān)鍵技術(shù)研究”(142102310262)

作者簡(jiǎn)介：潘奕鷗(1990—)，男，河南洛陽(yáng)人，碩士研究生，研究方向?yàn)樯锘瘜W(xué)與分子生物學(xué)。E-mail: lynnouou@163.com *通信作者：劉建學(xué)，教授，碩士生導(dǎo)師，E-mail: jx_liu@163.com

中圖分類號(hào)：S816

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1006-267X(2016)07-2140-07

*Corresponding author, professor, E-mail: jx_liu@163.com

Effects of Ferulic Acid on Lipid Deposition and Fatty Acid Composition in Abdominal Lipid ofob/obMice

PAN Yiou1,2,3WANG Weiwei2LI Aike2ZHANG Weiwei1HAN Sihai1LIU Jianxue1,3*

(1. College and Food and Bioengineering, Henan University of Science and Technology, Luoyang 471023, China;2. Academy of State of Administration of Grain, Beijing 100037, China; 3. Henan Engineering Research Center of Food Material, Luoyang 471023, China)

Abstract:This experiment was conducted to study the effects of ferulic acid (FA) on lipid deposition and fatty acid composition in abdominal lipid of ob/ob mice. A total of 30 male ob/ob mice at 5 weeks old were randomly divided into 3 groups (n=10). ob/ob mice in the 3 groups were fed the basal diets supplemented with 0 (control group), 0.25% and 0.50% FA, respectively. The experiment lasted for 9 weeks. The results showed that compared with control group, FA significantly reduced the total weight gain and abdomen fat percentage (P<0.05), significantly lessened the serum TG and liver TG and TC levels (P<0.05), attenuated accumulation of lipid droplet, significantly suppressed the contents of palmitoleic acid and oleic acid in abdominal lipid(P<0.05), and significantly decreased the desaturation indexes-palmitoleic acid/palmitic acid and oleic acid/ stearic acid in abdominal lipid (P<0.05). It is concluded that FA can inhibit the lipid deposition and ameliorate the fatty acid composition in abdominal lipid, and the weight-reducing and lipid-lowering effect is obvious.[Chinese Journal of Animal Nutrition, 2016, 28(7)：2140-2146]

Key words:ferulic acid; ob/ob mice; obesity; lipid deposition; fatty acid composition