李　輝，陳　碧，鄒　輝，舒　玲，曹建國，張堅松

（1.郴州市第一人民醫(yī)院藥學部，郴州423000；2.湖南師范大學醫(yī)學院，長沙　410013）

蔓荊子總黃酮抑制肝細胞癌球形成與激活AMPK抑制AKT相關

李輝*1，陳碧*1，鄒輝2，舒玲2，曹建國2，張堅松2

（1.郴州市第一人民醫(yī)院藥學部，郴州423000；2.湖南師范大學醫(yī)學院，長沙410013）

【摘要】目的：研究蔓荊子總黃酮（FVTF）抑制人肝細胞癌自我更新作用及其機制是否涉及AMPK/Akt信號傳導。方法：腫瘤球形成法測定FVTF對肝細胞癌SMMC-7721和MHCC97H細胞系球形成率的影響。Westernblot分析FVTF處理SMMC-7721細胞AMPK和Akt磷酸化水平。結果：FVTF顯著降低SMMC-7721和MHCC97H細胞系球形成率，呈濃度依賴性。不同濃度FVTF（1.0、2.0、4.0μg/mL）處理SMMC-7721細胞24h，AMPK磷酸化水平增高；Akt磷酸化水平下降。結論：FVTF抑制肝細胞癌自我更新作用與其激活AMPK抑制Akt活性相關。

【關鍵詞】蔓荊子總黃酮；肝細胞癌；自我更新；AMPK；Akt

1997年Bonnet等首次從急性髓系白血病患者骨髓中分離并證實腫瘤干細胞（cancerstemcells，CSCs）的存在以來，越來越多的證據(jù)表明腫瘤中存在一小群具有干細胞特征的細胞，表現(xiàn)出自我更新、多向分化和高致瘤性的特性，是維持腫瘤發(fā)生、生長和腫瘤轉移、復發(fā)的根源［1，2］。蔓荊子為馬鞭草科植物單葉蔓荊VitextrifoliaL.v.ar1simplicifoliaCham.或蔓荊Vitextrifolia L.的干燥成熟果實，是載入中國藥典的一種傳統(tǒng)中藥，具有消熱解表、利濕解毒、止咳祛痰、緩解支氣管痙攣等癥狀的作用［3］。蔓荊子總黃酮（FructusViticisTotal Flavonoids，F(xiàn)VTF）是自主創(chuàng)制的一種具有靶向抑制腫瘤干細胞作用的蔓荊子有效部位（國家發(fā)明專利號：ZL201210591146.9）。本文的研究目的是檢測FVTF抑制人肝細胞癌自我更新作用并探討其機制是否涉及AMPK/Akt信號傳導。

1　資料與方法

1.1試劑和細胞系蔓荊子總黃酮（FVTF）根據(jù)專利說明書（國家發(fā)明專利號：ZL201210591146.9）從蔓荊子中提取和制備。FVTF的性狀為棕褐色粉末。FVTF按干燥品計算，總黃酮量以蘆丁計等于53%。高糖DMEM培養(yǎng)基、DMEM/F12培養(yǎng)基、胎牛血清、0.25%胰蛋白酶（含EDTA）和磷酸緩沖液（PBS）購自美國Hyclone公司?？笰MPK、p-AMPK、Akt和p-Akt抗體均系美國Cell signaling公司產(chǎn)品?？功?actin抗體來自美國Sigma Aldrich公司。人肝細胞癌SMMC-7721細胞系和MHCC97H細胞系分別購自中國科學院細胞庫（中國上海市）和上海復祥生物科技有限公司（中國上海市）。細胞在含10%胎牛血清、100IU/mL青霉素G和100μg/mL鏈霉素的高葡萄糖DMEM細胞培養(yǎng)基中，置37°C、飽和濕度的5% CO2培養(yǎng)箱中單層貼壁生長。

1.2球形成率測定按照先前文獻［4，5］描述的方法測定不同濃度FVTF（1.0、2.0、4.0μg/mL）處理48h的球形成率。

1.3Westernblot按照先前發(fā)表文獻［5］的方法進行westernblot分析。

1.4統(tǒng)計學分析各組實驗數(shù)據(jù)錄入Spss15.0for windowsevaluation軟件建立數(shù)據(jù)庫，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差（Mean±SD）表示。采用OneWayANOVA方差分析；首先進行方差齊性檢驗，在方差齊性時，多組均數(shù)比較采用LSD法；在方差不齊時，多組均數(shù)間比較采用Tukey's檢驗。P＜0.05認為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結果

2.1FVTF對肝細胞癌細胞自我更新能力的影響球形成率測定結果顯示，F(xiàn)VTF以濃度依賴方式降低人肝細胞癌SMMC-7721細胞（圖1A）和MHCC97H細胞（圖1B）的腫瘤球形成率（P＜0.05）。

圖1　FVTF抑制肝細胞癌腫瘤球形成（Mean±SD，n=3）A：肝細胞癌SMMC-7721細胞；B：肝細胞癌MHCC97H細胞。與溶媒對照組比較，*P＜0.05；與1.0　μg/mL　FVTF處理組比較，#P＜0.05。

2.2FVTF對肝細胞癌SMMC-7721細胞AMPK磷酸化的影響免疫印跡分析結果發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)VTF增高人肝細胞癌SMMC-7721細胞AMPK蛋白磷酸化水平。

圖2　FVTF增高SMMC-7721細胞AMPK蛋白磷酸化水平

2.3FVTF對肝細胞癌SMMC-7721細胞Akt蛋白磷酸化水平的影響免疫印跡分析結果證明，F(xiàn)VTF降低人肝細胞癌SMMC-7721細胞Akt蛋白磷酸化水平。

圖3　FVTF降低SMMC-7721細胞Akt蛋白磷酸化水平

3　討論

FVTF是我們創(chuàng)制的一種具有靶向抑制腫瘤干細胞作用的蔓荊子有效部位（國家發(fā)明專利號：ZL201210591146.9）。為了驗證FVTF是否具有抑制人肝細胞癌干細胞樣細胞特性作用，在本研究中，我們采用球形成率測定法檢測不同濃度FVTF（1.0、2.0、4.0μg/ mL）對人肝細胞癌SMMC-7721和MHCC97H細胞系細胞腫瘤球形成的影響。結果證實：FVTF以濃度依賴方式降低上述兩種細胞系球形成率。從而說明FVTF具有抑制體外培養(yǎng)肝細胞癌自我更新作用。

鑒于FVTF中的有效成分紫花牡荊素能通過促進多種腫瘤細胞活性氧生成誘導細胞凋亡［6-8］，我們推測FVTF可能通過變動肝細胞癌干細胞特有的有氧糖酵解代謝性質發(fā)揮抑制肝細胞癌細胞自我更新作用。最近的研究表明，靶向腫瘤細胞代謝是一種可供選擇的腫瘤治療方法。AMPK是一個關鍵性的能量傳感器，調控正常細胞和腫瘤細胞的新陳代謝［9，10］。據(jù)此，我們尋求檢測FVTF是否通過激活AMPK抑制肝細胞癌細胞自我更新作用。本文的Westernblot分析結果發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)VTF能有效增高AMPK蛋白磷酸化水平。這些結果建議FVTF抑制體外培養(yǎng)肝細胞癌腫瘤球形成至少部分是由于其增強AMPK活性所致。

有研究報道AMPK是調節(jié)二甲雙胍抗腫瘤作用的關鍵分子，并認為AMPK介導抑制Akt起關鍵作用［11，12］。在本研究中，我們的實驗結果還證實，不同濃度FVTF（1.0、2.0、4.0μg/mL）處理，在增高AMPK蛋白磷酸化水平的同時，伴隨著Akt蛋白磷酸化水平的逐漸下降。這些結果首次表明AMPK/Akt信號傳導級聯(lián)在FVTF抑制肝細胞癌球形成中的作用?，F(xiàn)在仍不明確AMPK/Akt信號傳導級聯(lián)是否僅在FVTF抗肝細胞癌或肝癌干細胞中起作用，要明確這一點需要進一步研究，并描述該信號級聯(lián)在其他人腫瘤干樣細胞和非干樣細胞中是否起作用。

參考文獻

［1］ Bonnet D, Dick JE. Human acute myeloid leukemia is organized as a hierarchy that originates from a primitive hematopoietic cell［J］. Nat Med, 1997, 3（7）: 730-737.

［2］ Dick JE. Stem cell concepts renew cancer research［J］. Blood, 2008, 112（13）: 4793-4807.

［3］ 王雪莉, 曹曉誠, 盛習鋒, 等. 紫花牡荊素對宮頸癌HeLa細胞系干細胞樣細胞自我更新的影響［J］. 湖南師范大學學報: 醫(yī)學版, 2013（3）: 11-14.

［4］ Quan MF, Xiao LH, Liu ZH, ET AL. 8-bromo-7-methoxychrysin inhibits properties of liver cancer stem cells via downregulation of β-catenin［J］. World J Gastroenterol, 2013, 19（43）: 7680-7695.

［5］ Ren KQ, Cao XZ, Liu ZH, ET AL. 8-bromo-5-hydroxy-7-methoxychrysin targeting for inhibition of the properties of liver cancer stem cells by modulation of Twist signaling［J］. Int J Oncol, 2013, 43（5）: 1719-1729.

［6］ Chen D, Cao J, Tian L, et al. Induction of apoptosis by casticin in cervical cancer cells through reactive oxygen species-mediated mitochondrial signaling pathways［J］. Oncol Rep, 2011, 26（5）: 1287-1294.

［7］ Zeng F, Tian L, Liu F, Cao J, et al. Induction of apoptosis by casticin in cervical cancer cells: reactive oxygen species-dependent sustained activation of Jun N-terminal kinase［J］. Acta Biochim Biophys Sin （Shanghai）. 2012, 44（5）: 442-449.

［8］ He L, Yang X, Cao X, et al. Casticin induces growth suppression and cell cycle arrest through activation of FOXO3a in hepatocellular carcinoma［J］. Oncol Rep, 2013, 29（1）: 103-108.

［9］ Kim YH, Liang H, Liu X, et al. AMPKalpha modulation in cancer progression: multilayer integrative analysis of the whole transcriptome in Asian gastric cancer［J］. Cancer Res, 2012, 13（10）: 2512-2521.

［10］ Din FV, Valanciute A, Houde VP, et al. Aspirin inhibits mTOR signaling, activates AMP-activated protein kinase, and induces autophagy in colorectal cancer cells［J］. Gastroenterology. 2012, 13（7）: 1504-1515.

［11］ Aljada A, Mousa SA. Metformin and neoplasia: Implications and indications［J］. PharmacolTher. 2012, 133: 108-115.

［12］ Sato A, Sunayama J, Okada M, et al. Glioma-initiating cell elimination by metformin activation of FOXO3 via AMPK［J］. Stem Cells Transl Med, 2012, 1（11）: 811-824.

【中圖分類號】R734.2

【文獻標識碼】A

【文章編號】1673-016X（2016）03-0005-03

收稿日期：2016-01-10

基金項目：國家自然科學青年基金項目（No.30760248）；湖南省科技廳社發(fā)領域科技重點研發(fā)計劃（2015SK2066）；郴州市科技局科學技術研究計劃項目（No.cz2015007）

通訊作者：張堅松，E-mail：jwc_zjs@126.com

Inhibition of sphere-forming rate of hepatocellular carcinoma cellsby FructusViticis Total Flavonoids is associated with activation of AMPK and suppression of Akt

Li Hui1, Chen Bi1, Zou Hui2, Shu Ling2, Cao Jian-guo2, Zhang Jian-song2
（1. Department of pharmacy, The First People Hospital of Chenzhou, Changsha 432000, China；2. Medical College, Hunan Normal University, Changsha 410013, China）

［Abstract］Objective To investigate FructusViticis Total Flavonoids（FVTF） inhibits self-renewal capability of human hepatocellular carcinoma cells and the mechanism by which is involved in regulation of AMPK/Akt signaling. Methods Tumorsphere formation assay was used to determine the effects of FVTF on sphere forming rate of hepatocellular carcinoma SMMC-7721 and MHCC97H cell lines. Western blot was emploied to analyze the phosphorylation levels of AMPK and Akt proteins of SMMC-7721 cells treated with FVTF. Results FVTF significantly lowered the sphere forming rates of SMMC-7721 and MHCC97H cell lines, in a concentration-dependent manner. Treatment with various concentrations of FVTF（1.0、2.0 、4.0 μg/mL） for 24 h, the phosphorylation level of AMPK was elevated and the phosphorylation level of Akt was reduced in SMMC-7721 cells. Conclusion FVTF inhibits self-renewal capability of hepatocellular carcinoma cells is associated with activation of AMPK and suppression of Akt.

［Key words］fructus viticis total flavonoids； hepatocellular carcinoma； self-renewal； AMPK； Akt