王鳳英，黃路圣，魯　曼，張?zhí)┥?/p>

(1.江蘇省泰興市人民醫(yī)院兒科　225400；2.山東省泰安市中心醫(yī)院兒科　271000)

?

過敏性紫癜患兒SOCS3、HMGB1的表達及意義

王鳳英1，黃路圣1，魯曼2，張?zhí)┥?

(1.江蘇省泰興市人民醫(yī)院兒科225400；2.山東省泰安市中心醫(yī)院兒科271000)

[摘要]目的研究過敏性紫癜患兒外周血SOCS3和HMGB1的表達及其相互關(guān)系和臨床意義。方法選取過敏性紫癜兒童(HSP組)20例和正常健康兒童(對照組)15例。應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)檢測外周血單個核細胞中SOCS3 mRNA表達水平，采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測血清HMGB1的水平。結(jié)果HSP組外周血單個核細胞SOCS3 mRNA表達量和血清HMGB1的表達量分別為1.87±0.53、(16.29±3.28)μg/L，高于對照組的0.77±0.13、(7.44±1.34)μg/L，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，且二者成正相關(guān)(r=0.816，P<0.01)。混合型HSP患兒SOCS3 mRNA表達量和血清HMGB1的表達量較單純型患兒的表達量增高，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。HSP患兒SOCS3 mRNA表達量和血清HMGB1的表達量無性別差異。結(jié)論SOCS3和HMGB1可能參與了兒童HSP的發(fā)病。

[關(guān)鍵詞]HMGB1蛋白質(zhì)；紫癜，過敏性；細胞因子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制蛋白3；兒童

過敏性紫癜(HSP)是一種以小血管為主要病變的變態(tài)反應(yīng)性疾病，迄今為止其發(fā)病機制尚未完全清楚[1]。研究表明，在HSP患兒急性期體內(nèi)存在輔助性T細胞(Th)1/Th2的失衡，主要表現(xiàn)為Th2的優(yōu)勢活化[2]。細胞因子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制蛋白3(SOCS3)主要表達在Th2細胞，促進Th2細胞的分化，抑制Th1細胞分化，使Th2型反應(yīng)增強[3-4]。高遷移率族蛋白1(HMGB1)是一種新型的炎性細胞因子，研究發(fā)現(xiàn)HMGB1參與了多種自身免疫性疾病的發(fā)生和發(fā)展[5]。目前SOCS3和HMGB1在HSP患兒中的研究報道較少。本課題研究了SOCS3和HMGB1在HSP患兒外周血中的表達及相關(guān)性，以探討其在HSP發(fā)病中的作用及意義，現(xiàn)報道如下。

1資料與方法

1.1一般資料選取HSP患兒與健康體檢兒童進行對比研究，經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準，均取得受試對象家長知情同意。HSP患兒20例(HSP組)，診斷均符合諸福棠兒科學第7版HSP診斷標準及2013年中華醫(yī)學會兒科學分會免疫學組制訂的兒童過敏性紫癜循證診治建議，在受檢前4周內(nèi)未使用任何糖皮質(zhì)激素或細胞毒性藥物。其中，男11例，女9例；平均年齡(7.4±2.2)歲；單純皮膚型5例，混合型15例(有12例伴關(guān)節(jié)癥狀，9例伴消化道癥狀，5例伴腎臟損害)。對照組為健康體檢兒童隨機抽樣15例，男8例、女7例；平均年齡(7.2±1.6)歲。HSP組與對照組年齡及性別差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

1.2方法

1.2.1實驗標本的采集部位：外周靜脈血。試管：采用肝素鈉抗凝管和非肝素鈉抗凝管。采集對象：HSP組治療前及對照組。采血量：每管各2 mL。

1.2.2實驗標本的處理采用密度梯度離心法將肝素鈉抗凝管分離出外周血單個核細胞(PBMC)，以備檢測SOCS3 mRNA表達，非肝素鈉抗凝管離心取血清，-20 ℃冰箱保存以備待測 HMGB1水平。

1.2.3SOCS3 mRNA表達水平檢測(1)mRNA提取和cDNA合成。試劑來源：采用山東賽恩斯科技有限公司代購的Invitrogen公司的mRNA提取試劑、美國Thermo公司的反轉(zhuǎn)錄試劑盒和SYBR Green Ⅰ熒光定量PCR試劑盒。實驗步驟：嚴格按照Trizol試劑盒說明書的步驟用PBMC提取mRNA，然后將mRNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，在0.2 mL的EP管里進行，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)總體系為20 μL。(2)SOCS3基因的表達量應(yīng)用SYBR Green Ⅰ熒光定量PCR試劑檢測，反應(yīng)體系為50 μL(SYBR Green Ⅰ 25 μL，cDNA 2 μL，上、下游引物各1 μL，加雙蒸水至50 μL)；PCR反應(yīng)條件：95 ℃ 1 min變性；再95 ℃ 10 s，58 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s，共40個循環(huán)。所用PCR儀為ABI Prism 7500，以β-actin作為內(nèi)參基因，SOCS3、β-actin的引物設(shè)計和合成由寶生物工程有限公司完成，目的基因和內(nèi)參基因的引物序列見表1。(3)SOCS3 mRNA表達水平用SOCS3△Ct值表示，△Ct為目的基因Ct值與β-actin Ct值的差異，為基因的相對表達量。

表1　目的基因和內(nèi)參基因的引物序列

1.2.4HMGB1的檢測試劑購自上海百沃科技有限公司。采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)法檢測其HMGB1血清水平，嚴格按照試劑盒說明書要求進行。濃度的計算：以標準品濃度作為橫坐標，吸光度(OD)值作為縱坐標，繪制標準曲線，得出標準方程，根據(jù)標準方程計算。

2結(jié)果

2.1兩組SOCS3 mRNA及HMGB1的比較HSP組SOCS3 mRNA表達水平高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。HSP組血清HMGB1水平較對照組增高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，見表2。HSP組SOCS3 mRNA 和HMGB1的表達量成正相關(guān)(r=0.816，P<0.01)。

2.2臨床類型不同的HSP患兒SOCS3 mRNA、HMGB1檢測結(jié)果比較混合型HSP患兒SOCS3 mRNA和HMGB1的表達量分別為2.05±0.480、(17.45±2.90)μg/L；單純型患兒SOCS3 mRNA和HMGB1的表達量分別為1.34±0.16、(12.82±1.23)μg/L；混合型HSP患兒SOCS3 mRNA和HMGB1的表達量較單純型患兒的表達量明顯增高，差異有統(tǒng)計學意義(t=3.18、3.41，P=0.005、0.003)。

表2　HSP組與對照組SOCS3 mRNA、HMGB1表達差異

2.3性別不同HSP患兒SOCS3 mRNA、HMGB1檢測結(jié)果比較男性HSP患兒SOCS3 mRNA和HMGB1的表達量分別為1.80±0.56、(16.34±2.99)μg/L；女性患兒SOCS3 mRNA和HMGB1的表達量分別為1.95±0.49、(16.23±3.78)μg/L；不同性別HSP患兒SOCS3 mRNA和HMGB1的表達量差異無統(tǒng)計學意義(t=0.62、0.07，P=0.539、0.945)。

3討論

SOCS3和SOCS1是SOCS家族中研究較深入的成員之一，可通過多種途徑負向調(diào)控JAK-STAT(Janus kinase/signal transducers and activators of transcription)信號通路，影響多種炎癥細胞因子的表達與釋放，參與免疫性、炎癥性疾病的發(fā)生和發(fā)展[6-7]。SOCS1在Thl細胞中高表達，SOCS3在Th2細胞中高表達；白細胞介素(IL)-12/STAT4、 IL-4/STAT6途徑分別是Th1、Th2分化所必需的[8]。研究表明SOCS1可使Th1型反應(yīng)增強，而SOCS3可使Th2型反應(yīng)增強，作用機制分別為抑制IL-4/STAT6和IL-12/STAT4通路信號的傳導(dǎo)[3-4]。研究已證實HSP是Th2細胞及其細胞因子占優(yōu)勢的變態(tài)反應(yīng)性疾病[2]。本研究結(jié)果顯示，HSP患兒SOCS3的表達量較健康兒童明顯增高，且混合型HSP較單純型HSP患兒的表達量增高更明顯，推測HSP患兒在體內(nèi)炎性因子的作用下，表達顯著增高的SOCS3促使HSP患兒表現(xiàn)為Th2的優(yōu)勢活化，SOCS3表達越高的患兒越易合并皮膚外的臟器受累，提示SOCS3表達越高者炎性反應(yīng)越重，故SOCS3可能參與了兒童HSP的發(fā)病。本研究HSP患兒SOCS3表達量未發(fā)現(xiàn)有性別差異。

HMGB1是一種非組蛋白的核 DNA 結(jié)合蛋白，是HMG超家族成員之一，生理狀態(tài)下結(jié)合于核染色體，參與DNA的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、翻譯和修復(fù)等生命活動，病理狀態(tài)下是一種促炎介質(zhì)，具有細胞因子的功能，同時也可作為損傷相關(guān)分子模式家族(damage-associated molecular patterns，DAMPs)成員激活抗原提呈細胞(APC)，啟動增強適應(yīng)性免疫應(yīng)答，參與免疫細胞的分化、成熟和活化，進一步參與多種疾病的病理變化[9-10]。既往研究表明HMGB1具有廣泛的免疫活性，促進一系列免疫炎性細胞因子如單核細胞趨化因子-1(MCP-1)、IL-1、IL-6、IL-8、基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)等及趨化因子和黏附因子的大量釋放[10]；反之，腫瘤壞死因子(TNF-α)、脂多糖(LPS)、IL-1等多種炎癥介質(zhì)能促使單核細胞、巨噬細胞、樹突狀細胞、中性粒細胞等加速表達和分泌HMGB1，不斷放大炎性信號，導(dǎo)致炎性反應(yīng)失控[11]。在HSP發(fā)病中有多種細胞因子的參與，如TNF-α、IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、IL-26、IL-28、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)等均可能是參與HSP發(fā)病的重要因子。Chen等[12]研究發(fā)現(xiàn)HMGB1可能通過誘導(dǎo)TNF-α和IL-6介導(dǎo)HSP的血管內(nèi)皮炎癥，進一步參與HSP的病理發(fā)展。本研究結(jié)果顯示HSP組HMGB1血清水平較對照組顯著增高，表達差異有統(tǒng)計學意義，且混合型HSP患兒HMGB1血清水平較單純型HSP增高，差異有統(tǒng)計學意義，提示HMGB1可能參與了兒童HSP的發(fā)病。HMGB1的水平越高，病情越重，累積的臟器越多，但表達量無性別差異，與甘世偉等[13]的報道相一致。

Huang等[14]研究表明大劑量HMGB1能誘導(dǎo)人或鼠T淋巴細胞向Th2功能性分化，降低Th1/Th2比例，出現(xiàn)Th2優(yōu)勢。郭惠芳等[15]研究表明HMGB1刺激能增加細胞SOCS1、SOCS3的表達。本研究表明HSP患兒SOCS3的表達和HMGB1的表達量均增高，且二者表達成正相關(guān)，由此推測HSP患兒體內(nèi)增高的SOCS3和HMGB1相互作用，促使HSP患兒出現(xiàn)TH2細胞優(yōu)勢活化及相應(yīng)細胞因子的分泌，加之HMGB1本身及活化的免疫炎癥細胞，破壞免疫平衡，導(dǎo)致全身小血管的損傷和炎癥。

研究認為SOCS、HMGB1可作為靶點干預(yù)治療多種免疫相關(guān)疾病，本課題組擬進一步探索SOCS3、HMGB1參與HSP發(fā)病的分子機制及相互作用機制，為SOSC3、HMGB1治療HSP等免疫性疾病的臨床應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

參考文獻

[1]Rigante D,Castellazzi L,Bosco A,et al.Is there a crossroad between infections,genetics,and Henoch-Sch?nlein purpura?[J].Autoimmun Rev,2013,12(10):1016-1021.

[2]Li YY,Li CR,Wang GB,et al.Investigation of the change in CD4+T cell subset in children with Henoch-Schonlein purpura[J].Rheumatol Int,2012,32(12):3785-3792.

[3]Yamamoto K,Yamaguchi M,Miyasaka N,et al.SOCS-3 inhibits IL-12-induced STAT4 activation by binding through its SH2 domain to the STAT4 docking site in the IL-12 receptor beta2 subunit[J].Biochem Biophys Res Commun,2003,310(4):1188-1193.

[4]Yoshimura A.Negative regulation of cytokine signaling[J].Clin Rev Allergy Immunol,2005,28(3):205-220.

[5]潘舒月，青玉鳳，周京國．高遷移率族蛋白B1:自身免疫性疾病重要炎性分子[J]．中華臨床免疫和變態(tài)反應(yīng)雜志，2013，7(2)：198-202．

[6]Tamiya T,Kashiwagi I,Takahashi R,et al.Suppressors of cytokine signaling (SOCS) proteins and JAK/STAT pathways regulation of T-Cell inflammation by SOCS1 and SOCS3[J].Arterioscler Thromb Vasc Biol,2011,31(5):980-985.

[7]Mahlab-Guri K,Asher I,Sthoeger Z.SOCS:suppressor of cytokine signaling proteins and their role in the pathogenesis of allergic and autoimmune disorders[J].Harefuah,2013,152(8):464-468,499.

[8]Shirota H,Gursel M,Klinman DM.Suppressive oligodeoxynucleotides inhibit Th1 differentiation by blocking IFN-gamma-and IL-12-mediated signaling[J].J Immunol,2004,173(8):5002-5007.

[9]Yang H,Tracey KJ.Targeting HMGB1 in inflammation[J].Biochim Biophys Acta,2010,1799(1/2):149-156.

[10]Venereau E,Schiraldi M,Uguccioni M,et al.HMGB1 and leukocyte migration during trauma and sterile inflammation[J].Mol Immunol,2013,55(1):76-82.

[11]Luo Y,Chihara Y,Fujimoto K,et al.High mobility group box 1 released from necrotic cells enhances regrowth and metastasis of cancer cells that have survived chemotherapy[J].Eur J Cancer,2013,49(3):741-751.

[12]Chen T,Guo ZP,Wang WJ,et al.Increased serum HMGB1 levels in patients with Henoch-Schonlein purpura[J].Exp Dermatol,2014,23(6):419-423.

[13]甘世偉，趙林勝，王燕．HMGB1在過敏性紫癜患兒血清中的表達及其臨床意義[J]．重慶醫(yī)科大學學報，2014，39(12)：1767-1770．

[14]Huang LF,Yao YM,Meng HD,et al.The effect of high mobility immune function human group group box-1 protein on T lymphocytes in vitron[J].Zhong guo Wei Zhong Bing Ji Jin Yi Xue,2008,20(1):7-13.

[15]郭惠芳，劉淑霞，張玉軍，等．HMGB1對大鼠類纖維母細胞樣滑膜細胞STAT/SOCS/cyclin D1表達的影響[J]．中國病理生理雜志，2010，26(6)：1208-1213．

作者簡介：王鳳英(1975-)，副主任醫(yī)師，碩士，主要從事小兒免疫性疾病研究。

doi:·經(jīng)驗交流·10.3969/j.issn.1671-8348.2016.15.033

[中圖分類號]R725.9

[文獻標識碼]B

[文章編號]1671-8348(2016)15-2130-03

(收稿日期：2015-11-15修回日期：2016-01-16)