李春亮，李釗偉，秦　鳳

(青海大學(xué)附屬醫(yī)院創(chuàng)傷骨科，西寧 810000)

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Sirt1調(diào)控軟骨細(xì)胞自噬在骨關(guān)節(jié)炎中作用及機(jī)制

李春亮，李釗偉△，秦鳳

(青海大學(xué)附屬醫(yī)院創(chuàng)傷骨科，西寧 810000)

[摘要]目的探討沉默信息調(diào)節(jié)因子1(Sirt1)調(diào)控軟骨細(xì)胞自噬在骨關(guān)節(jié)炎(OA)中作用及機(jī)制的研究。方法免疫組織化學(xué)及逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)法檢測人OA軟骨和正常軟骨中Sirt1的表達(dá)，Ⅱ型膠原酶消化軟骨獲得軟骨細(xì)胞，單丹磺酰尸胺(MDC)法檢測OA軟骨細(xì)胞及正常軟骨細(xì)胞自噬水平，并分析二者相關(guān)性；Sirt1激動(dòng)劑白藜蘆醇干預(yù)OA軟骨細(xì)胞，并通過MDC法檢測OA軟骨細(xì)胞自噬水平，Western blot及RT-PCR法檢測酵母自噬基因Atg/Vps30同源基因(Beclin-1)及微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(LC3)蛋白及mRNA表達(dá)水平，煙酸己可堿(Hoechst)染色檢測OA軟骨細(xì)胞凋亡情況，Western blot檢測B淋巴細(xì)胞瘤-2(Bcl-2)、Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax)及哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)通路激活情況，分光光度法檢測各組天冬氨酸蛋白水解酶(Caspase-3)活性。結(jié)果OA軟骨中Sirt1蛋白及mRNA表達(dá)量都顯著低于正常軟骨中表達(dá)量(P<0.01)，OA軟骨細(xì)胞自噬水平低于正常軟骨細(xì)胞(P<0.01)，OA中軟骨Sirt1表達(dá)量與自噬水平正相關(guān)；Sirt1激動(dòng)劑白藜蘆醇能顯著提高OA軟骨細(xì)胞自噬水平(P<0.01)，提高自噬基因Beclin-1及LC3蛋白及mRNA表達(dá)量(P<0.01)，并抑制mTOR磷酸化(P<0.01)，從而抑制OA軟骨細(xì)胞凋亡(P<0.01)，下調(diào)Bax表達(dá)(P<0.01)，上調(diào)Bcl-2表達(dá)(P<0.01)，降低Caspase-3活性(P<0.01)。結(jié)論Sirt1在OA中低表達(dá)，并與軟骨細(xì)胞自噬水平正相關(guān)，提高Sirt1表達(dá)水平后能顯著能夠顯著抑制OA自噬，并抑制OA軟骨細(xì)胞凋亡，這可能是通過mTOR信號通路實(shí)現(xiàn)的。

[關(guān)鍵詞]骨關(guān)節(jié)炎；軟骨細(xì)胞；自噬；沉默信息調(diào)節(jié)因子1

骨關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis，OA)是一種多發(fā)于老年人的慢性退行性關(guān)節(jié)疾病，以關(guān)節(jié)軟骨破壞和關(guān)節(jié)周圍骨質(zhì)增生為主要病理特征，主要與年齡、性別、遺傳因素等有關(guān)[1-3]。目前OA發(fā)病機(jī)制主要圍繞在關(guān)節(jié)軟骨如何維持細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)代謝的動(dòng)態(tài)平衡上，而近年來也發(fā)現(xiàn)自噬在OA發(fā)病過程中起著重要作用[4-5]。沉默信息調(diào)節(jié)因子1(silent information regulation of transcription 1，Sirt1)是sirtuins家族研究最為廣泛的一員，在神經(jīng)退變性疾病、糖尿病、腫瘤、炎癥、衰老等疾病中通過自噬參與其病理過程[6]。此外Sirt1在人OA軟骨細(xì)胞外基質(zhì)合成、細(xì)胞存活，以及抗炎作用中起著重要作用[7-8]，并能通過對自噬相關(guān)蛋白去乙?；瘡亩{(diào)節(jié)細(xì)胞自噬水平[6,9]。因此推測，Sirt1可能通過調(diào)節(jié)OA軟骨細(xì)胞自噬水平從而參與軟骨細(xì)胞凋亡。所以本研究擬探討Sirt1是否通過調(diào)控OA軟骨細(xì)胞自噬，從而為Sirt1成為OA治療靶點(diǎn)提供理論依據(jù)。

1資料與方法

1.1一般資料軟骨組織取自2014年8月至2015年8月本院骨科進(jìn)行膝關(guān)節(jié)置換術(shù)的30名OA患者(根據(jù)美國風(fēng)濕性學(xué)會2008年制訂的OA診斷標(biāo)準(zhǔn)，通過病史、臨床檢查和X線片確診)。其中，男12例，女18例，年齡57～86歲，平均70歲。正常關(guān)節(jié)軟骨10例，取自因創(chuàng)傷根據(jù)截肢的膝關(guān)節(jié)股骨頭軟骨，根據(jù)病史，術(shù)前X線片及術(shù)后肉眼觀察排除標(biāo)本退行性變，腫瘤、感染、類風(fēng)濕炎癥和明顯骨質(zhì)疏松等結(jié)構(gòu)性破壞。正常關(guān)節(jié)軟骨中，男7例，女3例，年齡19～42歲，平均31歲?；颊邔θ〔闹椴⑼?，本試驗(yàn)亦經(jīng)醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2方法

1.2.1主要試劑與儀器兔抗Sirt1人多克隆抗體購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；兔抗B淋巴細(xì)胞瘤-2(Bcl-2)、Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax)、哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)及p-mTOR單克隆抗體購自Epitmics公司；鼠抗甘油醛3-磷酸脫氫酶(GADPH)抗體，含半胱氨酸的天冬氨酸水解酶3(Caspase-3)檢測試劑盒購自碧云天生物技術(shù)研究所；兔抗酵母自噬基因Atg/Vps30同源基因(Beclin-1)及微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(LC3)多克隆抗體購自Abcam公司；白藜蘆醇購自Sigma公司；Ⅱ型膠原酶，胎牛血清，達(dá)爾伯克(氏)改良伊格爾(氏)培養(yǎng)基(DMEM/F-12)購自Gibco公司。ChemiDocTMXRS凝膠成像系統(tǒng)購自Bio-Rad公司；Tecan Infinite F200/M200型多功能酶標(biāo)儀購自瑞士TECAN集團(tuán)公司，AF6000熒光顯微鏡購自德國Leica公司。

1.2.2免疫組織化學(xué)檢測標(biāo)本經(jīng)二甲苯脫蠟，100%、95%、80%乙醇脫水，流水沖洗，抗原修復(fù)，馬血清進(jìn)行抗原封閉，一抗封閉，二抗封閉，蘇木素浸泡，鹽酸乙醇浸泡，流水沖洗至反藍(lán)，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，吹干后中性樹膠封片，后鏡檢。Sirt1陽性染色為淡黃色、棕黃色，定位于細(xì)胞核。

1.2.3逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)檢測總RNA的提取參考Trizol試劑盒 (Invitrogen) 使用說明書，整個(gè)提取處于無RNAase的環(huán)境下。引物設(shè)計(jì)見表1，通過一步法RT-PCR試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA并進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲取5 μL擴(kuò)增產(chǎn)物用于下一步2%的瓊脂糖膠進(jìn)行檢測并拍照。引物分別加入25 μL PCR反應(yīng)體系中，反應(yīng)條件為94 ℃變性45 s，59 ℃復(fù)性45 s，72 ℃延伸60 s，共35個(gè)循環(huán)。

1.2.4軟骨細(xì)胞的制備及分組[1-2]無菌環(huán)境下，充分漂洗軟骨組織標(biāo)本，用眼科剪剪碎至1 mm3大小。并依次用0.25%的胰蛋白酶及0.20%的膠原酶分別消化30 min 及2 h。獲得單細(xì)胞懸液后，用10%胎牛血清的DMEM/F-12培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，37 ℃和5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，約4～5 d細(xì)胞開始融合，實(shí)驗(yàn)使用第2～3代細(xì)胞。細(xì)胞分為OA組及Sirt1激動(dòng)劑白藜蘆醇組(白藜蘆醇組)。

1.2.5單丹磺酰尸胺(MDC)染色細(xì)胞自噬囊泡體能與MDC特異性結(jié)合，在熒光顯微鏡下呈藍(lán)色。于6孔板中制備OA軟骨細(xì)胞爬片，于37 ℃和5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，再加入10 μmol/L白藜蘆醇或不加任何刺激物進(jìn)行干預(yù)培養(yǎng)24 h后，加入0.05 mmol/L MDC于37 ℃孵育15 min，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌3次，4%多聚甲醛固定15 min，PBS洗滌3次，并置于含有防熒光猝滅劑的載破片上，避光作用5～10 min后，熒光顯微鏡下觀察拍照。

表1　RT-PCR引物

1.2.6煙酸已可堿(Hoechst)染色將OA軟骨細(xì)胞培養(yǎng)于6孔板，于37 ℃和5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，加入10 μmol/L白藜蘆醇或不加任何刺激物進(jìn)行干預(yù)培養(yǎng)24 h，后按照Hoechst染色試劑盒說明書進(jìn)行操作，染色，固定，顯微鏡下進(jìn)行觀察并拍照。

1.2.7Western blot檢測將OA軟骨細(xì)胞培養(yǎng)于6孔板，于37 ℃和5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，加入10 μmol/L白藜蘆醇或不加任何刺激物進(jìn)行干預(yù)培養(yǎng)24 h。收集細(xì)胞，加入裂解液裂解，冰浴30 min，每隔10 min震蕩5 s，以1×104r/min 4 ℃離心15 min，獲得蛋白樣品。根據(jù)二喹啉甲酸(BCA)試劑盒對蛋白濃度進(jìn)行測定。蛋白上樣，十二烷基磺酸鈉(SDS)凝膠電泳，后濕法轉(zhuǎn)膜。將膜浸入一抗溶液孵育，4 ℃過夜；漂洗后，浸入二抗溶液(1∶100)中室溫孵育1～2 h。將膜取出漂洗，在膜上滴加ECL曝光液，在凝膠成像系統(tǒng)中曝光。用“Quantity one”軟件對各抗體條帶灰度值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

1.2.8Caspase-3活性檢測將OA軟骨細(xì)胞培養(yǎng)于6孔板，于37 ℃和5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，加入10 μmol/L白藜蘆醇或不加任何刺激物進(jìn)行干預(yù)培養(yǎng)24 h，按Caspase-3分光光度法檢測試劑盒進(jìn)行檢測。

2結(jié)果

2.1Sirt1蛋白及mRNA在人OA軟骨及正常軟骨組織中的表達(dá)與正常軟骨組織比較，OA軟骨組織中Sirt1蛋白陽性表達(dá)顯著降低(5.42±0.43vs.2.87±0.25)，OA軟骨組織中Sirt1 mRNA表達(dá)亦顯著降低(0.98±0.09vs.0.38±0.06)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見圖1、2。

A：正常軟骨組織；B：OA軟骨組織。

圖1Sirt1蛋白在人OA軟骨及正常軟骨組織中的表達(dá)

*:P<0.01，與正常軟骨細(xì)胞比較。

圖2Sirt1mRNA在人OA軟骨及正常軟骨組織中的表達(dá)

2.2OA軟骨細(xì)胞及正常軟骨細(xì)胞中自噬水平與正常軟骨細(xì)胞比較，OA軟骨細(xì)胞自噬水平降低[(30.45±5.17)%vs.(6.35±0.45)%,P<0.01]，見圖3。

A：正常軟骨細(xì)胞；B：OA軟骨細(xì)胞。

圖3OA軟骨細(xì)胞及正常軟骨細(xì)胞中自噬水平

2.3OA軟骨細(xì)胞中Sirt1表達(dá)自噬水平的相關(guān)性Person分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，OA軟骨細(xì)胞中Sirt1表達(dá)量與自噬水平正相關(guān)(r=0.783，P<0.01)。

A：OA組；B：白藜蘆醇組。

圖4Sirt1表達(dá)上調(diào)后對OA軟骨細(xì)胞凋亡的影響

*：P<0.01，與OA組比較。

圖5Sirt1表達(dá)上調(diào)后對OA軟骨細(xì)胞中自噬蛋白表達(dá)量的影響

2.4Sirt1表達(dá)上調(diào)后對OA軟骨細(xì)胞中自噬水平的影響與OA軟骨細(xì)胞組織比較，白藜蘆醇刺激Sirt1表達(dá)上調(diào)后，OA軟骨細(xì)胞自噬水平升高[(6.49±0.53)%vs.(26.89±3.12)%,P<0.01]。并使凋亡自噬基因Beclin-1及LC3蛋白及mRNA表達(dá)量上調(diào)(P<0.01)，見圖4、5。

A：OA組；B：白藜蘆醇組。

圖6Sirt1表達(dá)上調(diào)后對OA軟骨細(xì)胞凋亡的影響

*：P<0.01，與OA組比較。

圖7Sirt1表達(dá)上調(diào)后對OA軟骨細(xì)胞中Bax及Bcl-2表達(dá)量的影響

*：P<0.01，與OA組比較。

圖8Sirt1表達(dá)上調(diào)后對OA軟骨細(xì)胞中>Caspase-3活性的影響

*：P<0.01，與OA組比較。

圖9Sirt1表達(dá)上調(diào)后對OA軟骨細(xì)胞mTOR信號通路的影響

2.5Sirt1表達(dá)上調(diào)后對OA軟骨細(xì)胞凋亡的影響與OA軟骨細(xì)胞組比較，白藜蘆醇刺激Sirt1表達(dá)上調(diào)后，OA軟骨細(xì)胞凋亡率顯著下降[(28.71±3.24)%vs.(6.76±0.39)%,P<0.01)]，并上調(diào)Bcl-2蛋白表達(dá)(P<0.01)，下調(diào)Bax蛋白表達(dá)(P<0.01)，抑制Caspase-3活性(P<0.01)，見圖6～8。

2.6Sirt1表達(dá)上調(diào)后對OA軟骨細(xì)胞mTOR信號通路的影響與OA軟骨細(xì)胞組比較，白藜蘆醇刺激Sirt1表達(dá)上調(diào)后，OA軟骨細(xì)胞中mTOR磷酸化水平顯著降低(P<0.01)，見圖9。

3討論

細(xì)胞自噬是生物體在生理或病理?xiàng)l件下的應(yīng)激反應(yīng)，可通過溶酶體清除受損或老化的細(xì)胞器，從而維持細(xì)胞內(nèi)外環(huán)境穩(wěn)定和代謝平衡。研究發(fā)現(xiàn)，自噬功能的缺失或增強(qiáng)，在神經(jīng)性疾病、骨骼肌病變、腫瘤、炎癥及衰老等病理過程中起著重要作用[6]。自噬也可稱之為Ⅱ型程序性細(xì)胞死亡，參與OA軟骨退變，Caramés等[10]研究發(fā)現(xiàn)小鼠OA模型中自噬相關(guān)蛋白ULK1，Beclin1，LC3的表達(dá)量減少。Almonte-Becerril等[11]通過免疫組織化學(xué)和Western blot證實(shí)動(dòng)物OA模型中同時(shí)存在細(xì)胞凋亡及細(xì)胞自噬。后續(xù)的研究也證實(shí)通過提高OA自噬水平能顯著的抑制OA軟骨退變[12]。本研究結(jié)果與上述報(bào)道一致，OA軟骨細(xì)胞中自噬水平顯著低于正常軟骨細(xì)胞。所以研究軟骨細(xì)胞自噬作用機(jī)制有助于一步了解OA發(fā)病機(jī)制，同時(shí)也為OA治療提供新的思路。

研究已證實(shí)Sirt1與OA的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。如Fujita等[13]證實(shí)OA關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞比正常關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞中表達(dá)量降低。與本研究結(jié)果相一致，在人OA軟骨組織Sirt1表達(dá)量顯著低于正常軟骨組織。同時(shí)Matsuzaki等[14]證實(shí)Sirt1-CKO小鼠比野生型8周C57BL6/J小鼠更容易發(fā)展為OA，并伴隨著膠原X，人基質(zhì)金屬蛋白酶13(MMP-13)水平的上升，提示軟骨細(xì)胞中Sirt1的缺失加速小鼠OA模型的形成。Gabay 等[15]進(jìn)一步證實(shí)Sirt1 KO小鼠軟骨表達(dá)發(fā)生變化，凋亡程度提高，軟骨退變加速。Gagarina等[16]證實(shí)Sirt1能促進(jìn)OA軟骨特異性基因表達(dá)。說明Sirt1在OA中起著保護(hù)性作用。本研究進(jìn)一步通過Person分析發(fā)現(xiàn)，OA軟骨中Sirt1低表達(dá)水平與低自噬水平正相關(guān)，同時(shí)Marino等[9]提出Sirt1能通過調(diào)節(jié)自噬蛋白乙?；交虻鞍姿絹碚{(diào)控細(xì)胞的自噬水平。Powell等[17]進(jìn)一步研究Sirt1促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞自噬體成熟。從而說明OA中Sirt1不僅與軟骨自噬水平相關(guān)，還可參與調(diào)控軟骨細(xì)胞自噬。所以，在此基礎(chǔ)上本研究進(jìn)一步探討Sirt1對于OA自噬水平的調(diào)控作用。

Li等[18]證實(shí)白藜蘆醇通過提高OA小鼠中Sirt1活性，降低缺氧誘導(dǎo)因子2α(HIF-2α)，MMP13及一氧化氮合成酶(iNOS)表達(dá)，從而抑制OA小鼠軟骨退變。siRNA干擾人軟骨細(xì)胞中Sirt1的表達(dá)，促使TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)目，聚ADP核糖聚合酶(PARP)及Caspases-3，9片段數(shù)量，Bax表達(dá)量都顯著提高，Bcl-2表達(dá)量下降，而白藜蘆醇激活Sirt1表達(dá)，能扭轉(zhuǎn)此變化[19]。從而說明Sirt1有可能通過上調(diào)OA軟骨細(xì)胞自噬水平，達(dá)到抑制軟骨細(xì)胞凋亡的作用。因此本研究采用Sirt1激動(dòng)劑白藜蘆醇干預(yù)OA軟骨細(xì)胞，結(jié)果表明白藜蘆醇能使OA軟骨細(xì)胞自噬水平顯著提高，同時(shí)自噬蛋白Beclin1及LC3表達(dá)量顯著上調(diào)。進(jìn)一步檢測OA凋亡情況，結(jié)果表明OA軟骨細(xì)胞凋亡率下降。Bax表達(dá)量顯著降低，Bcl-2表達(dá)量顯著上升，Caspase-3活性下降，說明Sirt1能通過調(diào)節(jié)OA軟骨細(xì)胞自噬水平影響OA軟骨細(xì)胞凋亡。

細(xì)胞的自噬作用受多種信號通路的影響，如絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號通路，mTOR信號通路，Bcl-2信號通路等。其中mTOR信號研究最為廣泛，已經(jīng)證實(shí)mTOR信號通路能調(diào)控腎臟上皮細(xì)胞，心肌細(xì)胞，神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，腫瘤細(xì)胞，淋巴細(xì)胞等多種細(xì)胞中自噬功能的產(chǎn)生[20]。Bohensky等[21]證實(shí)通過HIF/AMPK/mTOR信號途徑調(diào)節(jié)軟骨細(xì)胞自噬。Caramés等[22]研究證實(shí)mTOR抑制劑雷帕霉素可以通過誘導(dǎo)自噬起到保護(hù)OA軟骨的作用。Zhang等[23]也發(fā)現(xiàn)通過阻斷mTOR信號通路可以防止大鼠OA的發(fā)生。因此本研究探討了白藜蘆醇刺激OA軟骨Sirt1表達(dá)上調(diào)后，mTOR信號通路的激活情況，結(jié)果表明白藜蘆醇干預(yù)后，OA軟骨細(xì)胞中mTOR磷酸化水平顯著提高。同時(shí)mTOR信號通路對細(xì)胞增殖也具有調(diào)控作用[24]。并且Zhao等[25]證實(shí)外源性刺激單倍體干細(xì)胞能促進(jìn)Sirt1表達(dá)，且是通過mTOR通路產(chǎn)生的，而單倍體干細(xì)胞中Sirt1敲除后，會導(dǎo)致細(xì)胞凋亡并伴隨p53及Caspase-3的激活。從而推測Sirt1不僅通過阻斷mTOR信號通路來干擾OA軟骨細(xì)胞的自噬水平，也通過此信號通路來干預(yù)OA軟骨細(xì)胞凋亡情況。

綜上所述，Sirt1在OA軟骨組織中低表達(dá)，并與軟骨細(xì)胞自噬水平正相關(guān)，通過上調(diào)Sirt1表達(dá)水平，可顯著上調(diào)OA軟骨細(xì)胞自噬水平，并進(jìn)一步抑制細(xì)胞凋亡及調(diào)控凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)，此過程可能與mTOR信號通路有關(guān)。

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作者簡介：李春亮(1978-)，主治醫(yī)師，碩士，主要從事四肢創(chuàng)傷研究。 △通訊作者，E-mail:lizhaowei5120@sina.com。

doi:·經(jīng)驗(yàn)交流·10.3969/j.issn.1671-8348.2016.15.029

[中圖分類號]R684.3

[文獻(xiàn)標(biāo)識碼]B

[文章編號]1671-8348(2016)15-2118-05

(收稿日期：2015-11-08修回日期：2016-02-11)