袁選舉，王賢和

(湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬人民醫(yī)院腫瘤中心,湖北 十堰 442000)

?

論著

復(fù)方苦參注射液對(duì)宮頸癌細(xì)胞體外放射增敏作用研究

袁選舉，王賢和

(湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬人民醫(yī)院腫瘤中心,湖北 十堰 442000)

[摘要]目的研究復(fù)方苦參注射液對(duì)人宮頸癌 Hela 細(xì)胞株的體外放射增敏作用并初步探討其作用機(jī)制。方法克隆形成法檢測(cè)放射增敏作用及給藥時(shí)序、濃度對(duì)細(xì)胞存活率的影響； DAPI染色法鏡下觀察細(xì)胞凋亡情況；流式細(xì)胞法檢測(cè)細(xì)胞周期分布情況；Western blot法檢測(cè)bcl-2、bax蛋白表達(dá)情況。結(jié)果復(fù)方苦參注射液與射線單獨(dú)或聯(lián)合作用后細(xì)胞存活率均較單純放射組明顯降低(P均<0.05)，不同濃度、不同時(shí)序處理后細(xì)胞存活率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,先照射后給藥效果優(yōu)于先給藥后照射(P<0.05)；復(fù)方苦參注射液與射線均能使Hela細(xì)胞阻滯于G2/M期，聯(lián)用阻滯效果更加顯著(P<0.05)；復(fù)方苦參注射液與射線均能破壞細(xì)胞核，聯(lián)用后細(xì)胞核皺縮、碎裂更加顯著；復(fù)方苦參注射液與射線單獨(dú)及聯(lián)用均能上調(diào)bax蛋白表達(dá)(P均<0.05)，下調(diào)bcl-2蛋白表達(dá)(P均<0.05)。結(jié)論復(fù)方苦參注射液可通過阻滯宮頸癌Hela細(xì)胞周期于G2/M期，下調(diào)bcl-2/bax的比值來誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡并增強(qiáng)其對(duì)放射線的敏感性。

[關(guān)鍵詞]復(fù)方苦參注射液;宮頸癌;放射增敏

復(fù)方苦參注射液是一種廣泛應(yīng)用于臨床、具有廣譜抗腫瘤作用的中藥制劑[1]，其可通過直接殺傷腫瘤細(xì)胞及保護(hù)機(jī)體免疫功能等途徑增強(qiáng)調(diào)強(qiáng)放療和腔內(nèi)后裝對(duì)宮頸癌患者的放療療效并有效減輕放療毒副反應(yīng)[2]，對(duì)宮頸癌具有較好的應(yīng)用前景。但目前有關(guān)復(fù)方苦參注射液在宮頸癌放療增敏方面的基礎(chǔ)研究報(bào)道還較少，為此，筆者在細(xì)胞水平上對(duì)此進(jìn)行了研究，旨在為其今后能夠更好應(yīng)用于臨床提供理論依據(jù)。

1實(shí)驗(yàn)資料

1.1試劑與儀器復(fù)方苦參注射液購自山西振東金晶藥業(yè)公司,1 mL含生藥0.4 g；噻唑藍(lán)(MTT)購自美國Sigma公司；DAPI購自上海拜力公司；兔抗人bcl-2、bax抗體購自美國Santa Cruz biotechnology公司； Clinac 600C/D加速器(美國Varian公司)；流式細(xì)胞儀(美國Beckman Coluter公司)。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)、傳代及照射人宮頸癌Hela細(xì)胞株引自本院臨床醫(yī)學(xué)研究所，接種于含10%新生牛血清、100 IU/mL青霉素、100 IU/mL鏈霉素的1640培養(yǎng)基中，在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2～3 d傳代1次。細(xì)胞采用6 MV X射線照射,劑量4 Gy/min，源皮距100 cm。

1.2.2克隆形成法檢測(cè)放射增敏作用取指數(shù)生長期細(xì)胞接種于96孔板，分為單放組(A組)、藥放1組(照射+20%IC50值)、藥放2組(照射+IC50值)，每組設(shè)3個(gè)平行孔，復(fù)方苦參注射液IC50值參照文獻(xiàn)[3]取200 μL/mL，照射劑量參照文獻(xiàn)[4]取2，4，6，8，12 Gy，單放組與藥放組射線劑量相同。藥放組又分為先給藥后照射、先照射后給藥2個(gè)亞組即20%IC50復(fù)方苦參注射液+照射組、照射+20%IC50復(fù)方苦參注射液組、IC50復(fù)方苦參注射液+照射組、照射+IC50復(fù)方苦參注射液組。先藥后照組：復(fù)方苦參注射液作用24 h后，單放組和藥放組分別接受上述劑量射線照射；先照后藥組：細(xì)胞經(jīng)上述劑量射線照射后，藥放組加入復(fù)方苦參注射液再作用24 h。處理后的細(xì)胞均在溫箱中孵育10～14 d，固定染色后在倒置顯微鏡下計(jì)數(shù)>50個(gè)細(xì)胞的克隆數(shù)，繪制細(xì)胞存活曲線并計(jì)算細(xì)胞克隆形成率和存活率。克隆形成率=克隆數(shù)/接種細(xì)胞數(shù)×100%；細(xì)胞存活率(SF)=受照射克隆形成率(Sx)/對(duì)照組克隆形成率(So)。

1.2.3DAPI染色法檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況取指數(shù)生長期細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，各取1×105個(gè)細(xì)胞接種于25 cm3培養(yǎng)瓶中，分為空白組、單放組、單藥1組、單藥2組、藥放1組及藥放2組，每組設(shè)3個(gè)平行孔。射線劑量均為4 Gy，單藥1組和藥放1組藥物濃度為20%IC50值。單藥2組和藥放2組藥物濃度為IC50值，按照1.2.2結(jié)果取最佳時(shí)序進(jìn)行照射及給藥，PBS洗2次處理完畢的細(xì)胞，各孔加入DAPI(5 mg/mL)200 μL，室溫避光染色20 min， PBS洗3次，每次5 min，于倒置熒光顯微鏡下觀察拍照。

1.2.4流式細(xì)胞法檢測(cè)細(xì)胞周期細(xì)胞分組及處理同1.2.3，收集處理完畢細(xì)胞，70%冷乙醇固定后在4 ℃冰箱中過夜，隔日取出重懸細(xì)胞，各組加入1 μL RNAase(100 μg/mL)、1 mL PI(50 μg/mL)，避光孵育30 min，流式細(xì)胞儀檢測(cè)， Multicycle軟件擬合計(jì)算各周期細(xì)胞比。

1.2.5Western blot法檢測(cè)bcl-2、bax蛋白表達(dá)情況將細(xì)胞以106個(gè)/孔密度接種于6孔板，分為空白組、單放組、單藥組及藥放組，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。單放組和藥放組射線劑量均為4 Gy，單藥組和藥放組復(fù)方苦參注射液濃度取IC50值，各組作用24 h后終止反應(yīng)，收集細(xì)胞，裂解離心收集上清，BCA法測(cè)蛋白濃度后上樣行SDS-PAGE電泳，電泳后轉(zhuǎn)膜，依次加入bcl-2和bax一抗和二抗， ECL顯影并拍照，Quanti Scan軟件行蛋白條帶分析。

2結(jié)果

2.1細(xì)胞存活率各給藥組接受不同劑量射線照射后細(xì)胞存活率均明顯低于相對(duì)應(yīng)的單放組(P均<0.05)，且復(fù)方苦參注射液濃度越高，細(xì)胞存活率越低;另外先放后藥組的細(xì)胞存活率均較先藥后放組低(P均<0.05)。見表1。

表1　各組細(xì)胞存活率比較

注：①與單放組比較，P<0.05；②與20%IC50復(fù)方苦參注射液+照射組比較，P<0.05；③與照射+20%IC50復(fù)方苦參注射液組比較，P<0.05；④與20%IC50復(fù)方苦參注射液+照射組比較，P<0.05；⑤與IC50復(fù)方苦參注射液+照射組比較，P<0.05。

2.2細(xì)胞凋亡情況DAPI染色后熒光顯微鏡下觀察可見未經(jīng)處理的空白組Hela細(xì)胞核形態(tài)規(guī)則，復(fù)方苦參注射液及放射線均可引起細(xì)胞核出現(xiàn)不同程度的皺縮，二者聯(lián)合作用后，細(xì)胞核皺縮、碎裂現(xiàn)象更為明顯，部分細(xì)胞壞死可見凋亡小體，藥物濃度越高上述現(xiàn)象越明顯。見圖1～6。

2.3細(xì)胞周期分布情況復(fù)方苦參注射液及放射線單獨(dú)和聯(lián)合作用對(duì)G0/G1期及S期細(xì)胞數(shù)目影響不大，但均可使G2/M期細(xì)胞比例明顯增高(P均<0.05)，細(xì)胞被阻滯在對(duì)射線敏感的G2/M期。與單獨(dú)照射或單用復(fù)方苦參注射液組比較，二者聯(lián)用對(duì)G2/M期的阻滯作用更加顯著(P均<0.05)，且藥物濃度越大效果越明顯(P均<0.05)。見表2。

2.4bcl-2、bax蛋白表達(dá)情況免疫印跡及灰度掃描結(jié)果發(fā)現(xiàn)單放組bcl-2、bax蛋白表達(dá)量與空白組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)；單藥組和藥放組bcl-2蛋白表達(dá)量均明顯低于單放組(P均<0.05)，bax蛋白表達(dá)量均明顯高于單放組(P均<0.05)，且藥放組下調(diào)bcl-2蛋白作用優(yōu)于單藥組(P<0.05)。見圖7。

圖1　空白組細(xì)胞凋亡情況

圖2　單放組細(xì)胞凋亡情況

圖3　單藥1組細(xì)胞凋亡情況

圖4　單藥2組細(xì)胞凋亡情況

圖5　藥放1組細(xì)胞凋亡情況

圖6　藥放2組細(xì)胞凋亡情況

組別G0/G1期S期G2/M期空白組69.64±0.7720.40±4.817.96±4.04單放組67.44±3.3121.90±3.8221.67±0.51①單藥1組66.64±5.1515.75±6.4319.61±1.28①單藥2組53.70±6.0723.80±7.6425.51±1.57①藥放1組41.60±5.7916.15±7.4334.26±3.64①②藥放2組43.17±9.6018.35±5.8739.56±5.75①③

注:①與空白組比較,P<0.05；②與單藥1組比較,P<0.05；③與單藥2組比較,P<0.05。

圖7　各組bcl-2與bax蛋白表達(dá)水平

3討論

復(fù)方苦參注射液主要含苦參堿、氧化苦參堿、脫氧苦參堿、土茯苓等多種抗癌活性成分，具有抗癌靶點(diǎn)多、作用效果好、毒副作用輕等優(yōu)點(diǎn)[1]。陳芳等[3]采用MTT法觀察了復(fù)方苦參注射液體外對(duì)宮頸癌細(xì)胞的放射增敏作用，但對(duì)其作用濃度、給藥時(shí)序以及作用機(jī)制等并未做更深入的探討。本實(shí)驗(yàn)中，筆者首先采用經(jīng)典的克隆形成法證實(shí)了復(fù)方苦參注射液對(duì)宮頸癌Hela細(xì)胞具有放射增敏作用，且在一定的濃度范圍內(nèi)，復(fù)方苦參注射液的放射增敏作用可隨藥物濃度的升高而增強(qiáng)，推測(cè)其原因可能是高濃度藥物可誘導(dǎo)更多細(xì)胞出現(xiàn)凋亡和死亡從而消除它們對(duì)放射線的抗拒作用。針對(duì)藥物和放射線給藥時(shí)序的研究結(jié)果表明，先照射后給藥較先給藥后照射效果好，分析原因可能是細(xì)胞受到放射線照射后,細(xì)胞線粒體外膜通透性發(fā)生改變,線粒體跨膜電位下降,向細(xì)胞基質(zhì)內(nèi)釋放凋亡因子誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，照射后再加入復(fù)方苦參注射液可使細(xì)胞線粒體跨膜電位持續(xù)下降,線粒體功能進(jìn)一步受損,加重誘導(dǎo)宮頸癌細(xì)胞發(fā)生凋亡[4]，也可能與復(fù)方苦參注射液能夠抑制照射后宮頸癌細(xì)胞DNA損傷修復(fù)有關(guān)。

復(fù)方苦參注射液的抗癌和增敏機(jī)制與細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期分布等因素相關(guān)[5-6]。胡文兵等[7]發(fā)現(xiàn)復(fù)方苦參注射液可通過阻滯肝癌HepG2細(xì)胞周期于放射敏感的G1期來誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，并提高放射敏感性，說明細(xì)胞周期分布是影響腫瘤放射敏感性的重要因素，在細(xì)胞周期中，G2/M期對(duì)放射最敏感，G0/G1期次之，S期特別是晚S期對(duì)放射最為抗拒。bcl-2/bax的比值近年來也被認(rèn)為與腫瘤放射敏感性及預(yù)后密切相關(guān)，下調(diào)bcl-2/bax的比值可增加放射敏感性,是腫瘤放療預(yù)后的重要指標(biāo)之一[8]。本研究通過DAPI染色鏡下觀察、流式細(xì)胞儀檢測(cè)證實(shí)射線及復(fù)方苦參注射液均能夠誘導(dǎo)宮頸癌細(xì)胞凋亡并提高G2/M期的比例，二者聯(lián)用G2/M期細(xì)胞阻滯和凋亡更加顯著；單藥及聯(lián)合照射均能上調(diào)bax蛋白表達(dá)，顯著下調(diào)bcl-2蛋白表達(dá)。說明復(fù)方苦參注射液在細(xì)胞水平上可通過阻滯細(xì)胞周期于G2/M期，下調(diào)bcl-2/bax比值來誘導(dǎo)宮頸癌Hela細(xì)胞發(fā)生凋亡并提高其對(duì)放射線的敏感性。

[參考文獻(xiàn)]

[1]張文謹(jǐn),海麗娜,連增林. 復(fù)方苦參注射液抗腫瘤作用及其機(jī)制實(shí)驗(yàn)研究進(jìn)展[J]. 中國中醫(yī)藥信息雜志,2012,19(8):101-103

[2]鄧守恒,段霞,陳萍. 復(fù)方苦參注射液聯(lián)合調(diào)強(qiáng)放療及腔內(nèi)后裝治療宮頸癌療效觀察[J]. 現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志,2015,24(20):2185-2187

[3]陳芳,黃小陸,梁林. 復(fù)方苦參注射液對(duì)人宮頸癌細(xì)胞株Hela的體外放射增敏作用[J]. 廣東醫(yī)學(xué),2011,32(7):842-844

[4]Beriwal S,Gan GN,Heron DE,et al. Early clinical outcome with concurrent chemotherapy and exteng-field,intensity-modulated radiotherapy for cervical cancer[J]. Int J Radiat Oncol Biol Phys,2007,68(1):166-172

[5]劉曉鳳,簡(jiǎn)曉順. 復(fù)方苦參注射液對(duì)人肝癌SMMC7721細(xì)胞增殖的抑制作用[J]. 中國藥房,2015,26(16):2190-2192

[6]段哲萍,于新江,劉媛媛. 復(fù)方苦參注射液聯(lián)合放射治療對(duì)肺癌Lewis細(xì)胞株在體外的放射增敏作用研究[J]. 中國全科醫(yī)學(xué),2013,16(12C)：4284-4287

[7]胡文兵,高清平. 復(fù)方苦參注射液對(duì)對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞放療的增敏作用觀察[J]. 山東醫(yī)藥,2010,50(45):32-34

[8]黃闐,陳茂懷,吳名耀,等. 自發(fā)性細(xì)胞凋亡及bcl2和bax基因與鼻咽癌放射敏感性關(guān)系的探討[J]. 中國腫瘤臨床與康復(fù),2008,15(5):411

[作者簡(jiǎn)介]袁選舉,男，副主任醫(yī)師,研究方向?yàn)槟[瘤放射治療。 [通信作者]王賢和，E-mail:yychenping@163.com

[基金項(xiàng)目]湖北省教育廳項(xiàng)目(B20122413)

doi:10.3969/j.issn.1008-8849.2016.23.001

[中圖分類號(hào)]R-33

[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A

[文章編號(hào)]1008-8849(2016)23-2509-04

[收稿日期]2016-01-20

Radiosensitization effect of Compound Kushen Injection on cervical cancer Hela cell cultured in vitro

YUAN Xuanju，WANG Xianhe

(The People’s Hospital of Hubei University of Medicine, Shiyan 442000, Hubei,China)

Abstract:Objective It is to investigate the radiosensitization effect of Compound Kushen Injection on cervical cancer Hela cell and to primarily investigate its mechanism. Methods Clone forming assay was used to observe the radiosensitizing effect; Flow cytometry method was used to detect Hela cell cycle distribution; Apoptotic changes was measured by Fluorescence microscope and DAPI staining; The expression of bcl-2 and bax protein was detected by Western blotting. Results Compared with radio alone,the cell survival rates was reduced by combination with Compound Kushen Injection(P<0.05).The cell survival rates were also depended on drug by various schedules and drug concentration(P<0.05). Compound Kushen Injection alone or combined with radiation could arrest cell cycle in G2/M phase(P<0.05),induce cell apoptosis, and the effects of combination were more significant (P<0.05). Compound Kushen Injection and radiation alone or combination all could damage the cell nucleus, the nudeus shrinkage and fragmentation was more significant in combination group (P<0.05). The levels of protein of bcl-2 was decreased and bax was increased by Compound Kushen Injection and radiation alone or combination (P<0.05). Conclusion Compound Kushen Injection has radiosensitization effect on Hela cell cultured in vitro ,which may be related to arrest in G2/M phase, induce cell apoptosis and down-regulating the ratio of bcl-2/bax.

Key words:Compound Kushen Injection; cervical cancer; radiosensitization