韓　華，趙　靜，趙紅偉，李　潔，閆　萍

(河北省人民醫(yī)院,河北 石家莊 050051)

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凍存復(fù)蘇對臍帶間充質(zhì)干細胞生物學特性的影響

韓華，趙靜，趙紅偉，李潔，閆萍

(河北省人民醫(yī)院,河北 石家莊 050051)

[摘要]目的觀察臍帶間充質(zhì)干細胞經(jīng)凍存復(fù)蘇后的生物學特性，并鑒定其是否具有間充質(zhì)干細胞的特征。方法采用組織塊貼壁法從人臍帶組織中分離培養(yǎng)間充質(zhì)干細胞，將傳至第3代的細胞進行凍存6個月后復(fù)蘇，觀察凍存前和凍存復(fù)蘇后細胞的形態(tài)學變化，比較凍存前后細胞的存活率，測定細胞生長曲線，并用流式細胞儀檢測凍存后細胞表面抗原的表達情況。結(jié)果組織塊貼壁法可以成功地分離培養(yǎng)臍帶間充質(zhì)干細胞；經(jīng)低溫凍存復(fù)蘇后細胞仍保持貼壁生長的特性，形態(tài)未發(fā)生明顯變化；復(fù)蘇后細胞存活率與未凍存細胞相比差異無統(tǒng)計學意義；凍存前后細胞的生長曲線相似；流式細胞儀分析凍存后細胞表面高表達間充質(zhì)干細胞抗原CD29、CD90、CD44、CD105，低表達或不表達造血干細胞抗原CD34、CD45和白細胞相關(guān)抗原HLA-DR。結(jié)論凍存復(fù)蘇對臍帶間充質(zhì)干細胞的生物學特性無明顯影響，凍存后細胞符合間充質(zhì)干細胞的基本要求。

[關(guān)鍵詞]間充質(zhì)干細胞；臍帶；凍存；生物學特性

間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cells, MSCs)是一種重要的種子細胞，具有高度自我更新和多向分化潛能，能夠支持造血和調(diào)節(jié)免疫功能[1-2]，并且在特定的條件下，可以誘導分化成骨、軟骨、脂肪、心肌、骨骼肌等多種組織細胞[3-4]，能廣泛應(yīng)用于組織工程研究以及臨床各種疾病的治療[5]。間充質(zhì)干細胞的來源廣泛，最早是從骨髓中發(fā)現(xiàn)，后經(jīng)研究證實在脂肪、肌肉、外周血、臍血、臍帶等組織中均存在間充質(zhì)干細胞[6]。對于間充質(zhì)干細胞的獲得，以前應(yīng)用較多的是從骨髓組織中提取，但長期研究證明骨髓間充質(zhì)干細胞的數(shù)量和其分化擴增能力隨年齡的增長而逐漸減少和減弱，而且骨髓的獲取是一種有創(chuàng)操作，不易采集，在細胞培養(yǎng)的過程中又容易感染，因而其應(yīng)用受到限制。近年來，許多研究者逐漸嘗試從人臍帶組織中提取間充質(zhì)干細胞，被稱為臍帶間充質(zhì)干細胞(UC-MSCs)。由于臍帶是來源于妊娠分娩時的廢棄物，來源廣泛，取材方便，不會引起倫理學方面的問題，并且臍帶間充質(zhì)干細胞容易提取，增殖能力強，免疫原性低，成為目前細胞組織工程研究的熱點[7]。因而，如何高效、穩(wěn)定地從臍帶組織中獲取間充質(zhì)干細胞并將細胞進行儲存是研究中需要關(guān)注的方向[8-9]。本實驗中運用組織塊貼壁法從臍帶中分離培養(yǎng)間充質(zhì)干細胞，并對獲取的細胞進行低溫凍存，觀察凍存復(fù)蘇后細胞的生物學特性和細胞活力，旨在為間充質(zhì)干細胞的保存提供實驗依據(jù)。

1實驗資料

1.1標本采集采集2015年3—5月在河北省人民醫(yī)院婦產(chǎn)科正常足月妊娠剖宮產(chǎn)健康胎兒的臍帶，母體檢查乙肝五項+丙抗、人類免疫缺陷病毒、梅毒等傳染性指標均為陰性，排除母體家族遺傳病及胎兒先天性疾病，征得產(chǎn)婦和家屬的知情同意，實驗過程符合醫(yī)學倫理學標準并經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準。

1.2實驗所用試劑及儀器DMEM/F12培養(yǎng)液(美國Hyclone公司)，胎牛血清(FBS)(美國Hyclone公司)，胰蛋白酶(美國Hyclone公司)，小鼠抗人抗體藻紅蛋白(PE)標記的CD29、CD44、CD90、CD105、CD34，異硫氰酸熒光素(FITC)標記的CD45，人類白細胞抗原(HLA)-DR(美國BD公司)，二甲基亞砜(美國Sigma公司)，多功能酶標儀(美國Molecular Devices公司)，XDZ-2型倒置顯微鏡(重慶精密儀器廠)，EPICS-XL4流式細胞儀(美國Beckman Coulter公司)，3K15臺式冷凍離心機(美國Sigma公司)，CO2培養(yǎng)箱(美國Thermo Forma公司)，Leica凝膠成像系統(tǒng)(德國Leica公司)，超凈工作臺，無菌培養(yǎng)瓶，乙醇等。

1.3臍帶間充質(zhì)干細胞的分離、培養(yǎng)于無菌條件下取剖宮產(chǎn)新鮮臍帶，長約10 cm，用生理鹽水沖洗掉臍帶中殘留血液，將其剪成長2～3 cm的多個小段，然后再次漂洗，在超凈工作臺上縱向剖開臍帶，用組織鑷剔除2條臍動脈、1條臍靜脈，采集血管與血管之間、血管與外膜之間的凝膠狀物即華通膠組織，將其撕成細條狀。用眼科剪將剝離的華通膠組織剪碎成1～2 mm3的小組織塊，平鋪至細胞培養(yǎng)瓶中，然后加入含有體積分數(shù)10%的胎牛血清、100 IU/mL青霉素和100 mg/L鏈霉素的DMEM/F12培養(yǎng)液，放入5%CO2、37 ℃的培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，利用新生細胞的貼壁生長特性進行分離培養(yǎng)。倒置顯微鏡每天觀察貼壁組織周圍細胞的生長情況，根據(jù)細胞生長情況3～4 d換液1次。當細胞從組織塊中爬出，并且細胞生長至80%～90%融合時，以吸管吹打貼壁細胞，用胰蛋白酶/EDTA消化液進行消化，并在顯微鏡下控制消化時間，PBS沖洗，離心，以1∶3進行傳代培養(yǎng)。

1.4臍帶間充質(zhì)干細胞的凍存及復(fù)蘇細胞凍存：取培養(yǎng)的第3代細胞，待生長至80%～90%融合時，常規(guī)胰酶消化細胞，PBS緩沖液洗滌3次，離心去除上清，緩慢加入凍存保護劑(體積分數(shù)為20%胎牛血清+70%DMEM/F12培養(yǎng)液+10%二甲基亞砜)重懸細胞，進行梯度凍存，先置入4 ℃冰箱20～30 min，-20 ℃冰箱1 h，然后置入-80 ℃冰箱過夜，第2天轉(zhuǎn)入-196 ℃液氮罐中保存。細胞復(fù)蘇：凍存6個月后從液氮中取出凍存管，立即投入37 ℃水浴箱中快速融化解凍，PBS洗滌，離心，向其加入含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液，混懸后置入培養(yǎng)瓶中，在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細胞達80%～90%融合后，常規(guī)胰酶消化，1∶3傳代進一步細胞擴增。

1.5凍存前后細胞的形態(tài)學觀察在倒置顯微鏡下連續(xù)觀察凍存前細胞以及凍存復(fù)蘇后細胞的形態(tài)學變化，并隨機選取視野照相，記錄觀察結(jié)果。

1.6凍存前后細胞存活率的計算對未凍存的第3代細胞和凍存復(fù)蘇后的細胞懸液分別用臺盼藍染色，滴至細胞計數(shù)板，靜置2 min，在顯微鏡下于計數(shù)板上計數(shù)著色細胞和未著色細胞(著色細胞為死細胞，未著色細胞為活細胞)，至少計數(shù)200個細胞，細胞存活率(%)=未著色細胞/(著色細胞+未著色細胞)×100%。

1.7凍存前后細胞生長曲線測定分別取未凍存的第3代細胞和凍存復(fù)蘇后的細胞，胰蛋白酶/EDTA消化，按每孔1×104個細胞接種于24孔培養(yǎng)板上，在5%CO2、37 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天固定時間觀察細胞生長情況，臺盼藍染色，當活細胞達到95%以上時進行細胞計數(shù)，以培養(yǎng)時間為橫軸、細胞數(shù)量為縱軸，繪制未凍存細胞和凍存復(fù)蘇細胞的生長曲線。

1.8凍存前后細胞的免疫表型鑒定取未凍存的第3代細胞和凍存復(fù)蘇后培養(yǎng)的第3代細胞，達80%～90%融合時，胰蛋白酶/EDTA消化液消化，離心，PBS制成濃度為1×106/mL的單細胞懸液，分別加入鼠抗人PE標記的CD29、CD44、CD90、CD105、CD34及FITC標記的CD45、HLA-DR單克隆抗體，4 ℃避光孵育30 min，離心后棄去上清液，PBS洗滌2遍，重新制成細胞懸液，用流式細胞儀檢測表面抗原的表達水平，鑒定凍存前后培養(yǎng)的細胞是否都含有臍帶間充質(zhì)干細胞的生物學標記。

1.9統(tǒng)計學方法數(shù)據(jù)運用SPSS 13.0軟件進行統(tǒng)計學處理，計數(shù)資料的比較采用2檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2結(jié)果

2.1凍存前后臍帶間充質(zhì)干細胞的形態(tài)學比較用組織塊貼壁法進行培養(yǎng)，在接種后1～2 d組織塊開始貼壁，7～8 d后可以看到少量細胞從組織塊中爬出，呈梭形或紡錘形，之后細胞增長速度較快，培養(yǎng)14d左右細胞似成纖維細胞形態(tài)，呈漩渦狀生長，且平行排列，可形成片狀融合，達80%～90%，見圖1。此后可進行傳代，傳代后細胞的形態(tài)未見明顯改變，細胞生長速度加快，形成典型的漩渦狀排列生長 ，見圖2。將培養(yǎng)的第3代細胞凍存6個月后再復(fù)蘇，可見復(fù)蘇細胞在24 h內(nèi)貼壁生長，呈紡錘形或多角形，細胞形態(tài)飽滿，生長狀態(tài)良好，待7～8 d細胞長滿瓶壁，排列有序，達到80%～90%融合，見圖3；進行1∶3傳代后的細胞生長速度加快，形態(tài)均一，生長良好，與未凍存的細胞形態(tài)基本一致。

2.2凍存前后細胞存活率比較經(jīng)倒置顯微鏡觀察，未凍存的第3代細胞平均存活率為94.1%，凍存復(fù)蘇后的細胞平均存活率為92.7%，兩者平均存活率比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

圖1　原代細胞培養(yǎng)第14天的細胞形態(tài)(×100)

圖2　第3代細胞培養(yǎng)第5天的細胞形態(tài)(×100)

圖3　凍存復(fù)蘇后細胞培養(yǎng)至第5天的細胞形態(tài)(×100)

2.3凍存前后細胞生長曲線比較未凍存第3代細胞和凍存復(fù)蘇后細胞的生長曲線相似，均呈S型，其中前1～2 d為潛伏期，細胞無明顯增殖，自接種后第3天開始細胞生長速度增快，數(shù)量明顯增多，進入對數(shù)生長期，第7—8天細胞可達80%～90%融合，之后細胞生長停滯，進入平臺期。見圖4。

圖4　未凍存細胞和凍存復(fù)蘇后細胞的生長曲線

2.4凍存前后細胞免疫表型分析未凍存細胞與凍存復(fù)蘇后細胞均高表達基質(zhì)細胞抗原CD29、CD90、CD44、CD105，低表達或不表達造血干細胞抗原CD34、CD45和白細胞相關(guān)抗原HLA-DR，說明凍存復(fù)蘇后的細胞免疫表型符合間充質(zhì)干細胞的表型特征。

3討論

間充質(zhì)干細胞是目前組織工程研究的熱點，其已經(jīng)在心血管疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、糖尿病、肝臟疾病、脊髓損傷等多個學科領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用，對于治療一些自身免疫性疾病以及退行性病變等有很好的臨床價值，具有非常廣闊的前景。既往研究已經(jīng)從骨髓、外周血、臍帶血及臍帶組織中通過不同的培養(yǎng)方法分離獲得了間充質(zhì)干細胞，與其他來源的間充質(zhì)干細胞相比，臍帶源性間充質(zhì)干細胞具有如下優(yōu)點：來源廣泛，采集容易，對產(chǎn)婦和胎兒均無任何危害，不存在法律和倫理學方面的爭議；細胞培養(yǎng)方法簡便，擴增能力強[10]；受病毒污染的概率低；臍帶免疫原性低，不易引起移植物抗宿主病[11]。這些優(yōu)點使得臍帶間充質(zhì)干細胞在組織工程領(lǐng)域應(yīng)用日益廣泛[12]。

運用組織塊貼壁法從人臍帶華通膠中分離培養(yǎng)間充質(zhì)干細胞，避免了酶消化法繁瑣的操作過程以及酶對細胞的毒性作用，可保持細胞良好的生物學特性，提高培養(yǎng)的成功率[13]。本研究結(jié)果顯示，在標準培養(yǎng)條件下，從臍帶華通膠提取的間充質(zhì)干細胞沿培養(yǎng)瓶貼壁生長，呈梭形或紡錘形，漩渦狀生長，并可穩(wěn)定傳代，傳代后細胞生長能力強，形態(tài)未見明顯改變；通過流式細胞儀檢測細胞的免疫表型顯示，細胞高表達間充質(zhì)干細胞的表面特異抗原，幾乎不表達造血干細胞的標志性抗原，說明提取的細胞符合間充質(zhì)干細胞的鑒定標準。

在細胞培養(yǎng)過程中，筆者也遇到一些問題，比如臍帶間充質(zhì)干細胞長期培養(yǎng)會造成細胞衰老、分化和過剩，以及培養(yǎng)條件變化、培養(yǎng)箱故障等致使細胞污染，這些都會導致細胞、試劑和材料的浪費。既往研究已經(jīng)證實骨髓源性的間充質(zhì)干細胞能夠進行低溫凍存，并且凍存復(fù)蘇后仍能保持細胞的生物學特性[14-15]，因此，筆者嘗試用同樣的方法對臍帶間充質(zhì)干細胞進行凍存，用來儲備細胞以備移植時使用。本研究將培養(yǎng)的第3代細胞放入液氮中凍存6個月，經(jīng)復(fù)蘇后觀察細胞仍貼壁生長，形態(tài)未見明顯改變，同樣可以擴增、傳代培養(yǎng)，細胞存活率與凍存前細胞比較差異無統(tǒng)計學意義，均達到90%以上，而且凍存前后細胞的生長曲線相似，說明凍存復(fù)蘇后細胞增殖活性未受影響，低溫凍存沒有改變臍帶間充質(zhì)干細胞的生物學特性。進一步用流式細胞儀檢測凍存復(fù)蘇后細胞的免疫表型，結(jié)果顯示凍存后細胞仍保留間充質(zhì)干細胞表面抗原的特性。

綜上所述，低溫凍存可以作為長期保存臍帶間充質(zhì)干細胞的一種有效方法，經(jīng)凍存復(fù)蘇后的細胞保持了原有細胞的生物學特性，符合間充質(zhì)干細胞的基本要求，滿足了人們對種子細胞的需求，使得臍帶間充質(zhì)干細胞在組織工程研究及臨床應(yīng)用中更加方便和廣泛。

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[作者簡介]韓華，女，主治醫(yī)師，碩士，主要從事婦產(chǎn)科干細胞移植修復(fù)方面的研究。

[基金項目]河北省衛(wèi)生廳青年科技課題(20150122)

doi:10.3969/j.issn.1008-8849.2016.23.002

[中圖分類號]R-33

[文獻標識碼]A

[文章編號]1008-8849(2016)23-2512-04

[收稿日期]2016-04-30

Effects of cryopreservation and resuscitation on the biological characteristics of umbilical cord mesenchymal stem cells

HAN Hua, ZHAO Jing, ZHAO Hongwei, LI Jie, YAN Ping

(Hebei General Hospital, Shijiazhuang 050051, Hebei, China)

Abstract:Objective It is to observe the biological characteristics of umbilical cord mesenchymal stem cells after cryopreservation, and identify whether it has the characteristic of mesenchymal stem cells. Methods By tissue explants adherent method, the MSCs were isolated and cultured from umbilical cord. And the third passage cells were frozen and thawed after six month. Then the morphological changes before freezing and frozen thawed cells were observed, the survival rate was compared, the cell growth curve was determined, and the expression of cell surface antigen was detected by flow cytometry. Results MSCs were successfully obtained from Wharton’s jelly of human umbilical cord via the proposed approach of tissue adherence. After cryopreservation, the cells still maintained the characteristics of adherent growth, and the morphology did not change significantly. The survival rate of frozen thawed cells had no significant difference compared with that of the non frozen cells. Cell growth curve was similar before and after cryopreservation. The flow cytometry analysis showed that frozen thawed cells highly expressed CD29, CD90, CD44, CD105 of stromal cell antigen, but low expression of hematopoietic stem cell associated antigens CD34, CD45 and leukocyte antigen HLA-DR. Conclusion The biological characteristics of human umbilical cord mesenchymal stem cells were not significantly changed after cryopreservation, and the cells were in accordance with the basic requirements of mesenchymal stem cells after cryopreservation.

Key words:mesenchyma stem cells; umbilical cord; cryopreservation; biological characteristics