龐小剛，畢春玉，于華蕓，武　冰，吳智春，王志宏

(山東中醫(yī)藥大學(xué)，山東 濟南 250355)

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加味孔圣枕中丹對慢性腦缺血癡呆大鼠VEGF表達和微血管密度的影響

龐小剛，畢春玉，于華蕓，武冰，吳智春，王志宏

(山東中醫(yī)藥大學(xué)，山東 濟南 250355)

[摘要]目的觀察加味孔圣枕中丹對慢性腦缺血致血管性癡呆(VD)大鼠學(xué)習(xí)記憶能力及腦血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)表達和微血管密度(MVD)的影響，探討該方影響血管生成、改善學(xué)習(xí)記憶能力的可能機制。方法將SD大鼠隨機分為假手術(shù)組、模型組、加味孔圣枕中丹組和貝伐單抗組，除假手術(shù)組外，其余組均采用雙側(cè)頸總動脈永久結(jié)扎法建立慢性腦缺血癡呆大鼠模型。造模24 h后，加味孔圣枕中丹組及貝伐單抗組均給予加味孔圣枕中丹水煎濃縮液16 mL/(kg·d)灌胃，模型組和假手術(shù)組給予等容量生理鹽水灌胃，均1次/d，連續(xù)30 d。貝伐單抗組另給予貝伐珠單抗注射液2 mg/kg腹腔注射，1次/2周。干預(yù)結(jié)束后，Morris水迷宮檢測各組大鼠逃避潛伏期評價學(xué)習(xí)記憶能力，免疫組化法檢測皮質(zhì)及胼胝體VEGF和CD34表達情況，以CD34標記MVD。結(jié)果與假手術(shù)組比較，模型組大鼠逃避潛伏期明顯延長(P<0.05)，胼胝體VEGF表達水平升高(P<0.05)，皮質(zhì)和胼胝體MVD顯著升高(P均<0.05)；與模型組比較，加味孔圣枕中丹組大鼠逃避潛伏期縮短(P<0.05)，皮質(zhì)及胼胝體VEGF表達水平、MVD均顯著升高(P均<0.05)；與貝伐單抗組比較，加味孔圣枕中丹組皮質(zhì)VEGF表達水平及MVD均顯著升高(P均<0.05)。結(jié)論加味孔圣枕中丹能上調(diào)慢性腦缺血大鼠腦組織VEGF表達，促進腦組織血管生成，這可能是其改善癡呆模型大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的作用機制之一。

[關(guān)鍵詞]加味孔圣枕中丹；血管性癡呆；血管內(nèi)皮生長因子；微血管密度

血管性癡呆(vascular dementia,VD)是腦血管病后的主要并發(fā)癥，是以健忘、呆笨為主要臨床表現(xiàn)的一種腦功能衰退性疾病[1]。隨著人口老齡化及腦血管病發(fā)病率增長，VD將會成為全球第一大癡呆類型[2]，嚴重威脅人類身心健康。慢性腦缺血是VD 發(fā)生的重要病理學(xué)基礎(chǔ)，慢性持續(xù)性腦血流量下降使大腦參與認知的重要部位如額、顳葉皮質(zhì)，海馬以及白質(zhì)區(qū)等長期處于缺血狀態(tài)，逐漸出現(xiàn)認知功能障礙[3-4]，改善和恢復(fù)局部的血供可能是治療本病的有效手段。加味孔圣枕中丹方由龜板、山茱萸、川芎等組成，功可補腎活血開竅，前期研究發(fā)現(xiàn)其對VD大鼠腦細胞具有一定保護作用[5]。本次研究擬建立慢性腦缺血VD大鼠模型，觀察其對VD大鼠皮質(zhì)及胼胝體血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)表達及微血管密度(MVD)的影響，進一步探究其可能機制。

1實驗資料

1.1實驗動物雄性SD大鼠40只，體質(zhì)量(250±10)g，清潔級，由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供，動物許可證號：SCXK(京)2012-0001。

1.2主要藥物貝伐珠單抗注射液購自瑞士羅氏制藥公司。加味孔圣枕中丹由山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院藥劑科負責(zé)煎制，每毫升含龜板0.33 g、生龍骨0.33 g、山茱萸0.28 g、肉蓯蓉0.22 g、石菖蒲0.17 g、遠志0.17 g、丹參0.28 g、川芎0.22 g。

1.3主要試劑與儀器VEGF單克隆抗體(Lot.GR58038-1)和CD34單克隆抗體(lot. GR55967-1)購自英國ABCAM公司。濃縮型DAB試劑盒(Lot.15111A03)購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。多功能真彩色細胞圖像分析管理系統(tǒng)(美國Media Cybernetics 公司)，LEICARASP300全自動脫水機(德國徠卡公司)，OLYMPUS CX41光學(xué)顯微鏡(日本Olympus公司)。

1.4實驗方法將SD大鼠隨機分為假手術(shù)組、模型組、加味孔圣枕中丹組、加味孔圣枕中丹加貝伐珠單抗組(簡稱貝伐單抗組)，每組10只，4組大鼠飼養(yǎng)環(huán)境相同。除假手術(shù)組外，其余組大鼠均采用雙側(cè)頸總動脈永久結(jié)扎法(2-VO)建立VD大鼠模型[6]：4%水合氯醛6.5 mL/kg腹腔注射麻醉，仰臥位固定，頸部常規(guī)備毛、消毒，頸部中線正中切開，分離雙側(cè)頸總動脈，無菌絲線雙結(jié)扎，剪斷頸總動脈。假手術(shù)組僅分離雙側(cè)頸總動脈，不結(jié)扎剪斷。逐層縫合傷口，外敷少許青霉素鈉。模型制備24 h后，加味孔圣枕中丹組及貝伐單抗組均給予加味孔圣枕中丹水煎濃縮液16 mL/(kg·d)灌胃，模型組和假手術(shù)組給予等容量生理鹽水灌胃，均1次/d，連續(xù)30 d。貝伐單抗組另給予貝伐珠單抗注射液2 mg/kg腹腔注射，1次/2周。

1.5觀察指標

1.5.1Morris水迷宮逃避潛伏期干預(yù)結(jié)束后進行Morris水迷宮實驗。Morris水迷宮裝置參照文獻[7]，選用大鼠通用型圓桶，在圓桶上緣設(shè)等距離的東、西、南、北4個標記點，將水面和水桶分成4個象限。實驗時向水桶加水至37 cm，水溫控制在23～25 ℃，水內(nèi)添加墨汁，使其呈黑色不透明狀。先將大鼠放入水池中進行自由游泳訓(xùn)練2 min，使其熟悉環(huán)境。實驗共歷時4 d，每天定于固定時間段，每個時間段訓(xùn)練4次。實驗時，將高度為35 cm、直徑為8 cm的平臺設(shè)置于東北象限，將大鼠先由遠離平臺的西南象限入水[8]，然后分別由其他3個象限入水，至其找到平臺，記錄其逃避潛伏期，并在臺上停留2 min。如果2 min未能找到，則將實驗動物放在平臺上2 min，潛伏期記錄為120 s。每日以大鼠4次訓(xùn)練潛伏期的平均值作為大鼠當日的學(xué)習(xí)成績。

1.5.2皮質(zhì)及胼胝體VEGF及CD34表達情況Morris水迷宮實驗結(jié)束后，麻醉大鼠取腦組織，4%多聚甲醛固定，石蠟包埋制片，常規(guī)脫蠟及抗原修復(fù)，按試劑盒說明書逐步進行免疫組化染色，用SABC法。VEGF蛋白在細胞漿表達，陽性細胞可見棕黃色或棕褐色顆粒，Image Pro Plus醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)進行圖像分析，400倍鏡下，隨機取3個視野，測出VEGF陽性反應(yīng)細胞的積分光密度(IOD)。CD34陽性染色時細胞內(nèi)有淺棕色至深棕色顆粒沉著，每張染色切片于低倍鏡下(×40)尋找3個微血管密集區(qū)，隨后于高倍鏡下(×200)計數(shù)5個不同視野中的微血管數(shù)，取平均值代表MVD值。

2結(jié)果

2.1各組大鼠Morris水迷宮逃避潛伏期比較隨著大鼠學(xué)習(xí)次數(shù)的增加，各組逃避潛伏期逐漸縮短。從第2天開始，模型組大鼠潛伏期明顯長于假手術(shù)組(P均<0.05)；第3天和第4天，加味孔圣枕中丹組大鼠潛伏期均顯著短于模型組(P均<0.05)；加味孔圣枕中丹組和貝伐單抗組各時段潛伏期比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)。見表1。

注：①與假手術(shù)組比較，P<0.05；②與模型組比較，P<0.05。

2.2各組大鼠皮質(zhì)及胼胝體VEGF表達IOD及MVD比較與假手術(shù)組比較，模型組大鼠胼胝體VEGF表達水平明顯升高(P<0.05)，皮質(zhì)和胼胝體MVD顯著增加(P均<0.05)；與模型組比較，加味孔圣枕中丹組皮質(zhì)及胼胝體VEGF表達水平及MVD均顯著升高(P均<0.05)；與貝伐單抗組比較，加味孔圣枕中丹組皮質(zhì)VEGF表達水平及MVD均顯著升高(P均<0.05)。見表2。各組皮質(zhì)及胼胝體VEGF和CD34染色表現(xiàn)見圖1及圖2。

表2　各組大鼠皮質(zhì)及胼胝體VEGF表達IOD及MVD比較

注：①與假手術(shù)組比較，P<0.05; ②與模型組比較，P<0.05；③與貝伐單抗組比較，P<0.05。

圖1　各組大鼠胼胝體及皮質(zhì)VEGF染色表現(xiàn)(SABC，×400)

圖2　各組大鼠胼胝體及皮質(zhì)CD34染色表現(xiàn)(SABC，×200)

3討論

慢性腦缺血是多種原因?qū)е麻L期的腦灌流不足[11]，其引起的能量代謝障礙、離子通道功能失調(diào)、神經(jīng)遞質(zhì)分泌失調(diào)以及炎癥因子釋放等各種損傷因素協(xié)同作用，逐漸引起皮質(zhì)、海馬以及大腦白質(zhì)等與學(xué)習(xí)記憶密切相關(guān)腦組織產(chǎn)生不可逆的損傷[12-13]，導(dǎo)致認知功能障礙。因而改善受損腦組織的血液供應(yīng)、減輕缺血程度是改善VD臨床癥狀，控制其病情進展的有效手段。長期以來，腦缺血研究多集中在神經(jīng)元或灰質(zhì)的損傷反應(yīng)上，忽視對腦白質(zhì)損傷的研究。從腦缺血后神經(jīng)功能恢復(fù)的角度來看，所有與缺血有關(guān)的腦區(qū)、細胞類型和細胞成分都應(yīng)受到保護，不僅要保護灰質(zhì)，亦應(yīng)保護白質(zhì)。

VD是現(xiàn)今唯一可預(yù)防的癡呆類型，早期積極防治病情具有可逆性。本病屬祖國醫(yī)學(xué)“癡呆”“呆證”“善忘”等范疇，發(fā)病部位在腦，功能物質(zhì)基礎(chǔ)為髓，乃本虛標實之證，腎精虧虛為致病之本[14]，瘀阻竅閉乃致病之標，臨證治當補腎益髓、活血開竅[15]。加味孔圣枕中丹是在“補腎益髓”治則指導(dǎo)下，以《備急千金要方》孔圣枕中丹加山茱萸、肉蓯蓉、川芎、丹參而成，方中重用龜板為君，補腎、活血，標本兼顧；臣以山茱萸益陰補精，肉蓯蓉填精益髓、溫助腎陽。君臣相配，陰陽并補，以治腎精虧虛之本。佐以川芎、丹參活血祛瘀；石菖蒲開竅醒神；遠志安神定志、益智強識；龍骨鎮(zhèn)驚安神。諸藥相合，共奏補腎益精、活血開竅之功。補腎填精、溫陽益火即可生精益髓，益智健腦，且精氣血旺盛，利于活血祛瘀；活血開竅以除病標，使瘀祛竅通，神識自復(fù)。本研究中Morris水迷宮實驗結(jié)果顯示，隨著大鼠學(xué)習(xí)次數(shù)的增加，各組逃避潛伏期的時間逐漸縮短，表明所有大鼠均具有通過訓(xùn)練學(xué)習(xí)產(chǎn)生記憶的能力；模型組大鼠逃避潛伏期較假手術(shù)組長，而加味孔圣枕中丹組大鼠潛伏期縮短，提示加味孔圣枕中丹能夠改善VD大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。

VEGF作為一種重要的血管發(fā)育調(diào)節(jié)因子，是影響缺血后大腦重塑的重要調(diào)控因子之一。腦缺氧缺血后，VEGF表達增高，與其受體結(jié)合促進血管內(nèi)皮細胞增殖, 誘導(dǎo)新生血管的生成[16]，促進側(cè)支循環(huán)建立，增加缺血區(qū)供血供氧，起直接保護作用[17]。CD34是一種階段特異性白細胞分化抗原, 選擇性地表達于人類造血干細胞、祖細胞和血管內(nèi)皮細胞表面[18]，是一種與新生小血管相關(guān)的抗原，被作為最敏感的新生血管內(nèi)皮標記物[19]。本實驗結(jié)果顯示，加味孔圣枕中丹組大鼠皮質(zhì)及胼胝體VEGF表達水平和MVD均顯著高于模型組，提示加味孔圣枕中丹可促進VEGF表達，誘導(dǎo)腦血管生成，從而恢復(fù)、改善皮質(zhì)及白質(zhì)缺血區(qū)血供，具有全腦保護效應(yīng)，這可能是其改善VD大鼠模型學(xué)習(xí)記憶能力的機制之一。

貝伐單抗是VEGF阻斷劑，本實驗結(jié)果顯示，加味孔圣枕中丹和貝伐單抗聯(lián)合使用組大鼠腦VEGF和MVD與模型組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，與加味孔圣枕中丹組比較皮質(zhì)VEGF表達水平和MVD則顯著降低，提示影響VEGF生物學(xué)效應(yīng)是加味孔圣枕中丹的作用靶點之一。Morris水迷宮實驗結(jié)果顯示，貝伐單抗組逃避潛伏期明顯短于模型組，但與加味孔圣枕中丹組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，提示加味孔圣枕中丹改善學(xué)習(xí)記憶能力的機制除與影響VEGF相關(guān)外，可能還有其他方面的機制，有待于進一步探討。

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[作者簡介]龐小剛，男，碩士，講師，研究方向為中西醫(yī)結(jié)合防治腦血管病藥物作用途徑及分子機制研究。 [通信作者]王志宏,E-mail:hong62w@126.com

[基金項目]國家自然科學(xué)基金資助項目(81202641)；山東省博士后創(chuàng)新項目(201302021)

doi:10.3969/j.issn.1008-8849.2016.23.003

[中圖分類號]R-332

[文獻標識碼]A

[文章編號]1008-8849(2016)23-2515-04

[收稿日期]2016-04-10

Impacts of modified Kongshengzhenzhong Pills on expression of VEGF and MVD in VD rats induced by chronic cerebral ischemia

PANG Xiaogang，BI Chunyu，YU Huayun,WU Bing, WU Zhichun,WANG Zhihong

(Shandong University of Traditional Chinese Medicine,Jinan 250355,Shandong,China)

Abstract：Objective It is to observe the impacts of modified Kongshengzhenzhong Pills on the ability of learning and memory，as well as the expression of VEGF protein and the micro vessel density(MVD)in brain tissue of the vascular dementia(VD)rats induced by chronic cerebral ischemia，and to explore the effects of this decoction on angiogenesis and its mechanism of improving learning and memorizing ability. Methods Rat models of VD induced by chronic cerebral ischemia was prepared by bilateral common carotid artery ligation. The experimental animals were randomly divided into sham operation group, model group, modified Kongshengzhenzhong Pills group, and Bevacizumab group. Drug intervention was carried out for 30days.The ability of learning and memorizing of the rats was assessed by Morris water maze experiment. The expression of VEGF protein and CD34 both in cortex and callosum were detected by immunohistochemistry, and MVD was calculated. Results Compared with the sham operation group, the average escape latent period prolonged, the expression of VEGF in callosum, MVD both in cortex and callosum increased in the model group (P<0.05). Compared with the model group, the average escape latent period shortened, the expression of VEGF and MVD both in cortex and callosum increased significantly in modified Kongshengzhenzhong Pills group(P<0.05).Conclusion Modified Kongshengzhenzhong Pills can elevate the expression of VEGF protein and promote blood vessel formation in brain tissue of VD rats. And these effects may serve as one of its mechanisms of improving learning and memorizing ability of VD rats.

Key wordsmodified Kongshengzhenzhong Pills; vascular dementia; vascular endothelial growth factor; microvessel density