李　靜，楊雅娟，李常娟，馮　艷

(河北省邯鄲市第一醫(yī)院，河北 邯鄲 056002)

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牛黃酸對CCl4所致大鼠肝纖維化抑制作用的研究

李靜，楊雅娟，李常娟，馮艷

(河北省邯鄲市第一醫(yī)院，河北 邯鄲 056002)

[摘要]目的研究?；撬釋Cl4所致大鼠肝纖維化的抑制作用。方法將120只SD大鼠隨機分為正常對照組、模型組及牛磺酸150，300，600 mg/kg組和復方鱉甲軟肝片540 mg/kg組，每組20只。除正常對照組外，其余組均采用CCl4復合法制備肝硬化門靜脈高壓大鼠模型。造模成功后，各給藥組灌胃相應(yīng)劑量藥物，正常對照組、模型組灌胃等容積生理鹽水，均每天1次，連續(xù)4周。灌胃結(jié)束后測定各組血清ALT、AST、TBil及肝纖維化四項(CⅣ、PCⅢ、LN、HA)水平， HE染色法觀察各組大鼠肝臟組織病理形態(tài)學變化并對肝細胞壞死、纖維組織增生程度進行分級評分，測定肝組織中羥脯氨酸(HYP)、一氧化氮(NO)、環(huán)鳥苷酸(cGMP)含量及內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)活性。結(jié)果牛磺酸300，600 mg/kg組和復方鱉甲軟肝片540 mg/kg組血清ALT、AST、TBil、CⅣ、PCⅢ、HA水平均明顯低于模型組(P均<0.05)，?；撬?00 mg/kg組和復方鱉甲軟肝片540 mg/kg組LN水平均明顯低于模型組(P均<0.05)；?；撬岣鹘M肝臟組織纖維化病變明顯改善，其中以600 mg/kg組最為顯著；?；撬?00，600 mg/kg組和復方鱉甲軟肝片540 mg/kg組肝臟組織中HYP含量均明顯低于模型組(P均<0.05)，NO含量明顯高于模型組(P均<0.05)，?；撬?00 mg/kg組eNOS活性和cGMP含量均明顯高于模型組(P均<0.05)。結(jié)論?；撬釋Cl4所致大鼠肝臟組織纖維化具有抑制作用，可能與其能夠有效上調(diào)eNOS表達、提高NO和cGMP含量、保肝降酶以及改善肝功能有關(guān)。

[關(guān)鍵詞]?；撬?；CCl4；肝纖維化；復方鱉甲軟肝片

肝纖維化是多種慢性肝病向肝硬化發(fā)展的必經(jīng)階段，但具有可逆性。因此，在肝纖維化階段進行藥物干預治療，阻斷其發(fā)生和發(fā)展或許是防治肝硬化的有效途徑[1]，所以尋找能夠有效抑制甚至逆轉(zhuǎn)肝纖維化的藥物具有非常重要的醫(yī)學價值。?；撬崾且环N含硫β-氨基酸，為名貴中藥牛黃的重要成分之一，具有促進膽汁排泄、改善肝硬化大鼠肝臟組織病變和細胞超微結(jié)構(gòu)病變、抑制心肌組織纖維化等藥理學作用[1-3]，但?；撬崾欠衲軌蛲ㄟ^抑制肝組織纖維化而對肝硬化的發(fā)生發(fā)展起到防治作用尚少見報道。本實驗通過CCl4復合法制備肝纖維化大鼠模型，探討?；撬釋Cl4所致肝纖維化的抑制作用，現(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1實驗資料

1.1藥物與試劑?；撬?美國Sigma公司，批號：140213，含量≥98%)；復方鱉甲軟肝片(內(nèi)蒙古福瑞中蒙藥科技股份有限公司，批號：20140624)；ALT、AST、TBil測定試劑盒購自深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司；CⅣ、PCⅢ、LN、HA、羥脯氨酸(HYP)、一氧化氮(NO)、環(huán)鳥苷酸(cGMP)及內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)試劑盒均購自北京博奧森生物工程有限公司。

1.2動物雄性SPF級SD大鼠120只，7周齡，體質(zhì)量200～250 g，購自河北省實驗動物中心，動物許可證號：SCXK(冀)2013-1-003，動物合格證號：201504016。

1.3方法

1.3.1動物分組、模型制備與給藥將120只雄性SD大鼠隨機分為正常對照組、模型組及?；撬?50，300，600 mg/kg組和復方鱉甲軟肝片540 mg/kg組，每組20只。除正常對照組外，其余各組大鼠經(jīng)皮下注射CCl4溶液(濃度40%，0.3 mL/100 g)，每3 d 1次，喂給高脂高膽固醇飼料，并飲用15%乙醇，6周后隨機取模型組大鼠2只進行病理學檢查，證實造模成功后，各給藥組灌胃相應(yīng)劑量藥物，正常對照組、模型組灌胃等容積生理鹽水，劑量為2 mL/kg，均每天1次，連續(xù)4周。

1.3.2血清ALT、AST、TBil及肝纖維化四項指標水平測定灌胃結(jié)束后，麻醉大鼠后開腹經(jīng)腹主動脈取血，離心(1 500 r/min，10 min)取血清，然后按照試劑盒操作方法步驟通過生化檢測儀測定各組大鼠血清ALT、AST、TBil水平，通過酶標儀平行測定各組大鼠血清CⅣ、PCⅢ、LN、HA水平。

1.3.3肝臟組織病理形態(tài)觀察及半定量分析每組隨機選取10只大鼠，取肝臟組織，置于4%多聚甲醛溶液中固定72 h，依次行石蠟包埋、切片(厚度約5 μm)和展片處理，然后行常規(guī)HE染色，通過倒置光學顯微鏡觀察各組大鼠肝臟組織病理形態(tài)結(jié)構(gòu)。參照馬玉珍等[4]報道的方法對肝細胞壞死、纖維組織增生程度進行分級和評分。肝細胞壞死：呈點灶狀壞死、彌散分布()計3分，分布范圍較廣()計2分，散在分布(+)計1分，無變化為(-)計0分。肝纖維組織增生：膠原纖維呈寬條索狀、增加明顯，表現(xiàn)為分隔成假小葉()，計3分；膠原纖維呈細條索狀、散在分布，表現(xiàn)為不完全假小葉()，計2分；膠原纖維含量增加，很少形成條索狀，可見匯管區(qū)擴大，纖維化(+)，計1分；無變化為(-)，計0分。

1.3.4肝臟組織中HYP、NO、cGMP含量及eNOS活性測定取每組剩余的大鼠，麻醉后開腹取肝臟組織，剪碎后研磨勻漿，低溫離心(4 ℃，12 000 r/min，15 min)后取上清液。按照ELISA試劑盒操作方法、通過酶標儀平行測定各組大鼠肝臟組織中HYP含量，通過硝酸還原酶法測定NO含量，化學比色法測定eNOS活性，放射免疫法測定cGMP含量。

2結(jié)果

2.1各組大鼠血清ALT、AST、TBil水平比較模型組大鼠血清ALT、AST、TBil水平均明顯高于正常對照組(P均<0.05)；?；撬?00，600 mg/kg組和復方鱉甲軟肝片540 mg/kg組血清ALT、AST、TBil水平均明顯低于模型組(P均<0.05)。見表1。

表1　各組大鼠血清ALT、AST、TBil水平比較

注：①與正常對照組比較，P<0.05；②與模型組比較，P<0.05。

2.2各組大鼠血清CⅣ、PCⅢ、LN、HA水平比較模型組大鼠血清CⅣ、PCⅢ、LN、HA水平均明顯高于正常對照組(P均<0.05)；?；撬?00，600 mg/kg組和復方鱉甲軟肝片540 mg/kg組血清CⅣ、PCⅢ、HA水平均明顯低于模型組(P均<0.05)，?；撬?00 mg/kg組和復方鱉甲軟肝片540 mg/kg組血清LN水平均明顯低于模型組(P均<0.05)。見表2。

表2　各組大鼠血清CⅣ、PCⅢ、LN、HA水平

注：①與正常對照組比較，P<0.05；②與模型組比較，P<0.05。

2.3各組大鼠肝臟組織形態(tài)結(jié)構(gòu)及肝細胞壞死、纖維組織增生程度比較正常對照組大鼠肝臟組織形態(tài)和細胞結(jié)構(gòu)均未見異常，見圖1；模型組大鼠肝臟組織呈纖維組織增生、纖維間隔形成、匯管區(qū)及中央靜脈周圍可見炎細胞浸潤等明顯的病理性改變，見圖2；與模型組比較，各給藥組大鼠肝臟組織病變呈不同程度改善，其中以?；撬?00 mg/kg組改善效果最為顯著，見圖3～6。通過對肝細胞壞死和肝纖維組織增生程度進行分級評分發(fā)現(xiàn)：模型組肝細胞壞死和肝纖維組織增生程度顯著高于正常對照組，牛磺酸300，600 mg/kg組和復方鱉甲軟肝片540 mg/kg組肝細胞壞死和肝纖維組織增生程度與模型組比較顯著減輕(P均<0.05)，見表3。

圖1　正常對照組大鼠肝臟組織形態(tài)結(jié)構(gòu)表現(xiàn)(HE，×200)

圖2　模型組大鼠肝臟組織形態(tài)結(jié)構(gòu)表現(xiàn)(HE，×200)

圖3　牛磺酸150 mg/kg組大鼠肝臟組織形態(tài)結(jié)構(gòu)表現(xiàn)(HE，×200)

圖4　牛磺酸300 mg/kg組大鼠肝臟組織形態(tài)結(jié)構(gòu)表現(xiàn)(HE，×200)

圖5　牛磺酸600 mg/kg組大鼠肝臟組織形態(tài)結(jié)構(gòu)表現(xiàn)(HE，×200)

圖6　復方鱉甲軟肝片540 mg/kg組大鼠肝臟組織

2.4各組大鼠肝臟組織中HYP、NO、cGMP含量及eNOS活性比較模型組大鼠肝臟組織中HYP含量明顯高于正常對照組(P<0.05)，NO、cGMP含量及eNOS活性均明顯低于正常對照組(P均<0.05)；?；撬?00，600 mg/kg組和復方鱉甲軟肝片540 mg/kg組肝臟組織中HYP含量均明顯低于模型組(P均<0.05)，NO含量明顯高于模型組(P均<0.05)，?；撬?00 mg/kg組eNOS活性和cGMP含量均明顯高于模型組(P均<0.05)。見表4。

表3　各組大鼠肝細胞壞死、纖維組織增生程度比較±s)

注：①與正常對照組比較，P<0.05；②與模型組比較，P<0.05。

3討論

CCl4復合法誘導制備的肝纖維化大鼠模型具有與人類類似的肝硬化病理生理特征，多用于抗肝纖維化的藥物治療研究[5-6]。CⅣ、PCⅢ、LN、HA是臨床上用來監(jiān)測肝纖維化的常用指標；另外在肝纖維化發(fā)生發(fā)展過程中，膠原纖維大量增生，其主要成分為膠原蛋白，而HYP主要存在于膠原蛋白中，因此其含量也能夠反映肝硬化程度[7]。?；撬崾且环N含硫β-氨基酸，具有抗氧化、保護心血管、抑制肝組織纖維化等多種生物學作用，本實驗通過CCl4復合法制備肝纖維化大鼠模型進行研究發(fā)現(xiàn)，牛磺酸能夠有效降低肝纖維化大鼠血清CⅣ、PCⅢ、LN、HA、ALT、AST、TBil水平及肝組織中HYP含量，改善肝臟組織病理形態(tài)變化并抑制肝細胞壞死和肝纖維組織增生，上述作用均以?；撬岣邉┝拷M效果最為顯著，提示?；撬釋Cl4所致肝纖維化具有劑量依賴性的抑制作用。

表4　各組大鼠肝臟組織中HYP含量、NO含量、eNOS活性、cGMP含量

注：①與正常對照組比較，P<0.05；②與模型組比較，P<0.05。

NO是一種信號分子，能夠通過激活可溶性腺苷酸環(huán)化酶、升高細胞內(nèi)cCMP水平而發(fā)揮刺激血管舒張，促進血液循環(huán)的生理作用[8]，而eNOS是體內(nèi)催化NO生成的生物酶。本實驗研究發(fā)現(xiàn)，牛磺酸能夠有效促進肝纖維化大鼠肝臟組織中eNOS表達，提高NO及cGMP含量，提示?；撬崮軌蛲ㄟ^調(diào)節(jié)NO信號傳導通路而表現(xiàn)出降低肝內(nèi)血管阻力的作用。

綜上所述，牛磺酸對CCl4所致大鼠肝臟組織纖維化具有抑制作用，可能與其能夠有效上調(diào)eNOS表達、提高NO和cGMP含量、保肝降酶以及改善肝功能有關(guān)。

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[作者簡介]李靜，女，碩士，主治醫(yī)師，主要從事消化內(nèi)科疾病研究工作。

doi:10.3969/j.issn.1008-8849.2016.23.005

[中圖分類號]R-332

[文獻標識碼]A

[文章編號]1008-8849(2016)23-2522-04

[收稿日期]2016-03-10

Inhibitory effects of Taurine on liver fibrosis induced by CCl4in rats

LI Jing, YANG Yajuan, LI Changjuan, FENG Yan

(The First Hospital of Handan, Handan 056002,Hebei,China)

Abstract:Objective It is to investigate the inhibitory effects of Taurine(Tau) on liver fibrosis induced by CCl4 in rats. Methods One hundred and twenty experimental rats were randomly divided into six groups: normal control group, model group, Tau(150, 300 and 600 mg/kg) groups and Fufangbiejiarangan tablet 540 mg/kg group,each group had 20 rats. The cirrhosis rat models were established by injecting CCl4.The drugs were given by intragastric administration for 4 weeks, once a day. The content of ALT, AST, TBil, CⅣ, PCⅢ, LN, HA in serum and the level of HYP in hepatic tissue were determined; the histopathological changes of the hepatic tissue was observed by HE staining and were semi-quantitative analyzed; the content of NO, cGMP and the activity of eNOS in hepatic tissue were determined. Results Compared with model control group, the contents of ALT, AST,TBil, CⅣ, PCⅢ, HA in serum and the HYP in hepatic tissue of Tau 300, 600 mg/kg groups were significantly decreased (P<0.05), and the content of LN in 600 mg/kg groups was significantly decreased(P<0.05); the hepatic tissue histopathological changes of Tau treated groups were significantly improved, especially in the Tau 600 mg/kg group the improvements were more significant; the content of NO in hepatic tissue of Tau 300, 600 mg/kg groups were significantly increased(P<0.05), the eNOS expression of Tau 600 mg/kg treated group was significantly increased (P<0.05) and the content of cGMP was significantly decreased (P<0.05). Conclusion Tau had inhibitory effects on liver fibrosis induced by CCl4 in rats, which perhaps related to its effects on upregulating eNOS expression, enhancing the content of NO and cGMP, enzyme activity inhibition and hepatic tissue protection, improving liver function.

Key words:Taurine; CCl4; liver fibrosis; protecting effect