郭昌龍 杜 蒙,2 王啟迪 曹小芳 楊 英 蔡瑞琨 安莉莎 邱 月,2 劉 昕,3 彭左旗 王興宇,3 馬 旭,2*

1.國(guó)家衛(wèi)生計(jì)生委科學(xué)技術(shù)研究所(北京，100081)； 2.北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院研究生院；3. 北京高血壓聯(lián)盟研究所

·基礎(chǔ)研究·

妊娠對(duì)孕婦外周血IGH-CDR3免疫組庫(kù)的影響

郭昌龍1杜 蒙1,2王啟迪1曹小芳1楊 英1蔡瑞琨1安莉莎1邱 月1,2劉 昕1,3彭左旗1王興宇1,3馬 旭1,2*

1.國(guó)家衛(wèi)生計(jì)生委科學(xué)技術(shù)研究所(北京，100081)； 2.北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院研究生院；3. 北京高血壓聯(lián)盟研究所

目的：探討妊娠期女性外周血中IGH-CDR3序列的多樣性與免疫學(xué)特性。方法：分離9例正常妊娠末期和7例非妊娠期女性外周血淋巴細(xì)胞，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA ARM-PCR擴(kuò)增H鏈CDR3區(qū)序列，高通量測(cè)序后通過(guò)與IMGT數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)比，揭示妊娠期IGH-CDR3免疫組庫(kù)的多樣性及免疫學(xué)特征。結(jié)果：妊娠期女性外周血IGH-CDR3 的數(shù)目和種類(lèi)均小于非妊娠女性；妊娠期女性有獨(dú)特的免疫學(xué)特性，包括IGH-CDR3 長(zhǎng)度、N末端堿基的添加數(shù)、V區(qū)域使用偏好基因及末端去除的堿基數(shù)；一些CDR3肽段在妊娠期女性中特有表達(dá)。結(jié)論：妊娠會(huì)降低孕婦外周血循環(huán)中B細(xì)胞的數(shù)量和種類(lèi)并使IGH-CDR3區(qū)的免疫學(xué)特性發(fā)生變化。

妊娠； 免疫組庫(kù)； IGH-CDR3

妊娠期間，母體免疫系統(tǒng)的適度調(diào)節(jié)對(duì)妊娠成功至關(guān)重要，隨著胎兒的生長(zhǎng)發(fā)育，其自身免疫系統(tǒng)逐漸成熟，分泌的細(xì)胞因子可干擾母體免疫系統(tǒng)[1-2]。母體的免疫系統(tǒng)發(fā)生一系列的調(diào)整以維持妊娠：①隨著妊娠的進(jìn)行，母體分泌的Th1型細(xì)胞因子不斷下降，Th2型細(xì)胞因子不斷增加，最終形成免疫功能由Th1 型向Th2型轉(zhuǎn)變，細(xì)胞免疫功能受抑制而體液免疫功能占優(yōu)勢(shì)[3-4]；②HLA-G、HLA-E分子表達(dá)增加，并通過(guò)抑制NK細(xì)胞和CD8+T淋巴細(xì)胞功能產(chǎn)生機(jī)體對(duì)妊娠的免疫耐受[5-7]；③ Th17細(xì)胞比例下降、CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞比例增高，以抑制細(xì)胞免疫功能并維持免疫耐受狀態(tài)[8-9]等。妊娠過(guò)程中B細(xì)胞也會(huì)發(fā)生一些調(diào)整[10]，如母體分泌一些特殊抗體以保護(hù)胎盤(pán)組織免受母體免疫系統(tǒng)的攻擊[11]，調(diào)節(jié)性B細(xì)胞可通過(guò)分泌IL-10抑制Th1型細(xì)胞功能以維持免疫耐受[12]，而一些自身抗體的異常表達(dá)，如AT1-AA[13-14]，可以誘導(dǎo)先兆子癇的發(fā)生。妊娠對(duì)B細(xì)胞免疫學(xué)特性的研究目前尚無(wú)報(bào)道，本研究利用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)妊娠末期和未妊娠女性外周血免疫球蛋白重鏈-互補(bǔ)決定區(qū)3(IGH-CDR3)的多樣性與免疫學(xué)特性進(jìn)行研究，為進(jìn)一步揭示妊娠對(duì)母體免疫系統(tǒng)的影響提供依據(jù)。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

本研究選取的外周血標(biāo)本均從北京婦產(chǎn)醫(yī)院獲得。正常妊娠末期女性入選標(biāo)準(zhǔn)：孕>39周，正常待產(chǎn)，無(wú)妊娠期疾病及感染史；無(wú)家族遺傳病史及血液病史；B超顯示胎兒發(fā)育正常，無(wú)先天畸形。非妊娠健康女性是年齡、籍貫與妊娠孕婦匹配的志愿者。本研究嚴(yán)格遵守赫爾辛基宣言，所有血液標(biāo)本的取得均簽署了知情同意書(shū)，并經(jīng)北京婦產(chǎn)醫(yī)院與本所倫理委員會(huì)通過(guò)。

1.2 實(shí)驗(yàn)程序

1.2.1 PBMC分離 采集每個(gè)研究對(duì)象的外周靜脈血8ml，肝素鈉抗凝， Ficoll法分別分離出淋巴細(xì)胞，細(xì)胞重懸于RNA保護(hù)液并凍存于-80℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 RNA提取 采用Qiagen公司試劑盒，離心柱法。

1.2.3 ARM-PCR擴(kuò)增 取1μg total RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA， 用iRepertoire公司HBHI-M的引物試劑盒對(duì)IGH重鏈區(qū)域進(jìn)行兩步PCR擴(kuò)增反應(yīng)，第一步擴(kuò)增反應(yīng)條件：50℃ 40min；95℃ 15min；94℃ 30s，63℃ 2min，72℃ 30s，15cycle；94℃ 30s，72℃ 2min，10cycle；72℃ 10min。第一步PCR結(jié)束后取2ul反應(yīng)產(chǎn)物作為第二步PCR的模板，反應(yīng)條件：95℃ 15min；94℃ 30s，72℃ 90s，30cycle；72℃，5min。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增效果，切下490-570bp大小的片段做膠回收。

1.2.4 高通量測(cè)序 回收產(chǎn)物定量后用二代測(cè)序儀Miseq進(jìn)行測(cè)序反應(yīng)。

1.3 生物信息學(xué)分析

將測(cè)得的原始測(cè)序數(shù)據(jù)上傳至iRepertoire公司網(wǎng)站，由專(zhuān)業(yè)生物信息人員進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。具體步驟包括：①去除掉數(shù)據(jù)中的冗余序列、短片段序列及測(cè)序質(zhì)量差的序列；②將數(shù)據(jù)與公共數(shù)據(jù)庫(kù)IMGT(http://www.imgt.org/)進(jìn)行比對(duì)查詢，根據(jù)IGH-CDR3區(qū)域V、J、D各區(qū)段的特點(diǎn)鑒定出各個(gè)樣本的CDR3肽段序列；③統(tǒng)計(jì)各樣本的免疫學(xué)特征。

2 結(jié)果

2.1 樣本基本信息

9例正常妊娠末期孕婦和7例未妊娠健康女性的一般情況和樣本基本信息見(jiàn)表1。

表1 研究標(biāo)本基本信息

2.2 樣本擴(kuò)增情況

16例樣本均擴(kuò)增出外周血IGH-CDR3免疫組庫(kù)，結(jié)果顯示妊娠末期孕婦外周血IGH-CDR3 read數(shù)目和種類(lèi)均低于未妊娠健康女性(CDR3數(shù)目：2.06×106/3.63×106；CDR3種類(lèi)：9.34×103/5.86×104。見(jiàn)圖1-A、1-B)。

A：IGH-CDR3總數(shù)比較；B：unique IGH-CDR3總數(shù)比較；C：IGH-CDR3長(zhǎng)度比較；D：N末端添加的堿基數(shù)比較；E：J區(qū)域末端去除堿基數(shù)比較；F：J區(qū)域基因使用頻率比較；G：V區(qū)域末端去除堿基數(shù)比較；H：V區(qū)域基因使用頻率比較

圖1 正常妊娠末期孕婦與未妊娠健康女性外周血IGH-CDR3免疫學(xué)特性的比較

2.3 IGH-V、J基因亞家族的使用偏好性和其他免疫學(xué)特征

與未妊娠女性對(duì)比，妊娠末期女性外周血B細(xì)胞的免疫學(xué)特性發(fā)生一些變化，具體表現(xiàn)為：CDR3區(qū)域的長(zhǎng)度33bp(13個(gè)氨基酸)和45bp(15個(gè)氨基酸)的利用率高于未妊娠女性(圖1C)；N末端添加的堿基數(shù)從0到40bp呈高斯分布， N末端添加的堿基數(shù)比未妊娠女性平均增加2～3個(gè)堿基(頻率最高的堿基數(shù)由12、13個(gè)堿基增加為14、15個(gè)堿基，見(jiàn)圖1D)；二者在J基因末端去除的堿基數(shù)上也有不同，未妊娠女性去除的堿基數(shù)更多集中在0-5bp范圍內(nèi)，而妊娠女性去除的堿基數(shù)更偏向于6-15bp(圖1E)；J基因使用頻率妊娠女性使用J3、J4亞基因較多，未妊娠女性J6基因使用頻率較多，但二者間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖1F)；V基因末端去除的堿基數(shù)二者沒(méi)有明顯規(guī)律性，妊娠女性去除頻率較高的堿基數(shù)分別為0bp、3bp、5bp、7bp(圖1G)；妊娠女性較少使用V1、V2基因家族，而偏好使用V3家族的亞基因，尤其是V3-7、V3-9、V3-11、V3-234個(gè)亞基因的使用頻率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于未妊娠女性(圖1H)。

2.4 妊娠對(duì)IGH-CDR3肽段的影響

IGH-CDR3序列是BCR分子與抗原結(jié)合的主要部分，決定了B細(xì)胞與抗原結(jié)合的特異性和強(qiáng)度，為了研究妊娠對(duì)外周B細(xì)胞功能的影響，分別對(duì)獲取樣本IGH-CDR3肽段數(shù)據(jù)進(jìn)行會(huì)聚研究，建立了妊娠期與非妊娠期女性外周血IGH-CDR3數(shù)據(jù)庫(kù)。結(jié)果顯示在未妊娠7例樣本共表達(dá)了3112種不同的肽段，其中肽段AREDY在全部7例樣品中均有表達(dá)，肽段ARGLDY、AKDRSRTYLYDSSGYDY在6例樣品中表達(dá)；而在9例妊娠樣品中，共有186種肽段表達(dá)，其中樣品間共享頻率最高的肽段ARVCRGHNSCYFDS在5例樣品中表達(dá)，肽段VTVPRIGTAY在4例樣品中表達(dá)，其余的肽段共享頻率均較低。由此可見(jiàn)妊娠末期的女性間共同表達(dá)的肽段顯著少于未妊娠女性，但是肽段ARVCRGHNSCYFDS、VTVPRIGTAY在7例未妊娠女性中均未找到，所以這兩個(gè)肽段是否是妊娠期女性獨(dú)有的肽段尚需進(jìn)一步的研究。

3 討論

高通量測(cè)序技術(shù)的出現(xiàn)為生命科學(xué)的研究提供了巨大便利。本研究首次利用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)末期妊娠女性外周血IGH-CDR3免疫組庫(kù)進(jìn)行了篩查，并通過(guò)與未妊娠女性對(duì)比，揭示妊娠對(duì)女性IGH-CDR3免疫特性的影響。本研究顯示，妊娠使女性IGH-CDR3的免疫學(xué)特性發(fā)生了一些變化，包括N末端添加的堿基數(shù)平均增加2-3bp、J基因末端去除更多的堿基、更偏好使用V3基因家族的亞基因等等，這些改變的具體機(jī)制尚未清楚，推測(cè)這可能與母體細(xì)胞免疫受到抑制、TH2型免疫占優(yōu)勢(shì)、Treg細(xì)胞以及調(diào)節(jié)性B細(xì)胞表達(dá)量增高有密切關(guān)系。另外肽段ARVCRGHNSCYFDS、VTVPRIGTAY在妊娠末期女性中表達(dá)的頻率較高，而在未妊娠7例女性中并未發(fā)現(xiàn)這2個(gè)肽段表達(dá)，提示其與妊娠有密切關(guān)系，但具體作用需要更進(jìn)一步的研究。本研究發(fā)現(xiàn)妊娠女性外周血中循環(huán)CDR3總數(shù)和種類(lèi)均顯著低于未妊娠女性，而且評(píng)價(jià)機(jī)體免疫能力的重要指標(biāo)CDR3種類(lèi)和總數(shù)也顯著低于未妊娠女性，表明妊娠期女性體液免疫總體上處于抑制狀態(tài)。當(dāng)然由于妊娠期平均血容量增加造成的血液稀釋也會(huì)對(duì)循環(huán)CDR3數(shù)量和種類(lèi)有一定影響，妊娠期孕婦平均增加1400～1500ml血容量，約多出全部血容量45%[15-17]。但是由于在本研究中無(wú)論妊娠女性與未妊娠女性均選取等量的外周血淋巴細(xì)胞RNA(1ug)進(jìn)行研究，所以即使考慮到血容量增加的因素，妊娠期女性的CDR3總數(shù)、種類(lèi)也相對(duì)少于未妊娠女性。

綜上所述，本研究利用ARM-PCR擴(kuò)增與高通量測(cè)序技術(shù)成功地揭示了妊娠對(duì)女性IGH-CDR3多樣性和免疫學(xué)特性的影響，為全面揭示免疫耐受在妊娠過(guò)程中的作用和機(jī)制提供了重要的基礎(chǔ)。

[1] Borchers AT，Naguwa SM，Keen CL，et al. The implications of autoimmunity and pregnancy[J]. J Autoimmun，2010，34(3)：1287-1299.

[2] Li M，Huang SJ. Innate immunity, coagulation and placenta-related adverse pregnancy outcomes[J]. Thromb Res，2009，124(6)：656-662.

[3] Yamaguchi T，Takizawa F，F(xiàn)ischer U，et al. Along the Axis between Type 1 and Type2 Immunity; Principles Conserved in Evolution from Fish to Mammals[J]. Biology(Basel)，2015，4(4)：814-859.

[4] Szekeres-Bartho J. Progesterone-mediated immunomodulation in pregnancy: its relevance to leukocyte immunotherapy of recurrent miscarriage[J]. Immunotherapy，2009，1(5)：873-882.

[5] Tilburgs T，Strominger JL. CD8+ effector T cells at the fetal-maternal interface, balancing fetal tolerance and antiviral immunity[J]. Am J Reprod Immunol，2013，69(4)：395-407.

[6] Djurisic S，Hviid TV. HLA Class Ib Molecules and Immune Cells in Pregnancy and Preeclampsia[J]. Front Immunol，2014，5：652，1-17.

[7] Lynge Nilsson L，Djurisic S，Hviid TV. Controlling the Immunological Crosstalk during Conception and Pregnancy: HLA-G in Reproduction[J]. Front Immunol，2014，5：198，1-10.

[8] Figueiredo AS，Schumacher A. The Th17/Treg paradigm in pregnancy[J]. Immunology，2016，148(1)：13-21.

[9] Lee SK，Kim JY，Lee M，et al. Th17 and regulatory T cells in women with recurrent pregnancy loss[J]. Am J Reprod Immunol，2012，67(4)：311-318.

[10] Bottsford-Miller J，Haeri S，Baker AM，et al. B cell acute lymphocytic leukemia in pregnancy[J]. Arch Gynecol Obstet，2011，284(2)：303-306.

[11] Muzzio DO，Soldati R，Ehrhardt J，et al. B cell development undergoes profound modifications and adaptations during pregnancy in mice[J]. Biol Reprod，2014, 91(5)：115，1-11.

[12] Thaxton JE，Sharma S. Interleukin-10: a multi-faceted agent of pregnancy[J]. Am J Reprod Immunol，2010，63(6)：482-491.

[13] LaMarca B，Parrish M，Ray LF，et al. Hypertension in response to autoantibodies to the angiotensin II type I receptor (AT1-AA) in pregnant rats: role of endothelin-1[J]. Hypertension，2009，54(4)：905-909.

[14] LaMarca B，Wallukat G，Llinas M，et al. Autoantibodies to the angiotensin type I receptor in response to placental ischemia and tumor necrosis factor alpha in pregnant rats[J]. Hypertension，2008，52(6) ：1168-1172.

[15] Sanghavi M，Rutherford JD. Cardiovascular physiology of pregnancy[J]. Circulation, 2014，130(12)：1003-1008.

[16] Pritchard JA. Changes in the Blood Volume during Pregnancy and Delivery[J]. Anesthesiology，1965，26：393-399.

[17] Chesley LC. Plasma and red cell volumes during pregnancy[J]. Am J Obstet Gynecol， 1972，112(3)：440-450.

[責(zé)任編輯：董 琳]

Effect of pregnancy on IGH-CDR3 immunerepertoire in peripheral blood of pregnant women

GUO Changlong, DU Meng, WANG Qidi, CAO Xiaofang，YANG Ying， CAI Ruikun，AN LiSha，QIU Yue，LIU Xing，PENG Zuoqi，WANG Xingyu，Ma Xu

1.National Research Institute for Family Planning, Beijing 100081; 2.Peking Union Medical College; 3.Beijing hypertension league institute

*Corresponding author：Ma Xu, Email: xumagroup@163.com

Objective: To investigate the diversity and immunological characteristics of IGH-CDR3 in peripheral blood of pregnant women. Methods: In order to know the diversity and immunological characteristics of IGH-CDR3 of pregnant women, circulating lymphocyte was separated from peripheral blood of 9 pregnant and 7 non-pregnant women, cDNA was reversed from RNA, IGH-CDR3 region was amplified by ARM-PCR, the corresponding PCR products were sequenced using high-throughput sequencing and then blasted with the IMGT database. Results: The number and species of IGH-CDR3 in pregnant women were much lower than that of non-pregnant women. But pregnant women have unique immunological characteristics, which including IGH-CDR3 length, number of N addition and V removal, usage bias of V gene. Some CDR3 peptides were exclusively expressed in pregnant women. Conclusion: Pregnancy can reduce the number and variety of B cells in peripheral blood of women, and the immunological characteristics of IGH - CDR3 district has changed during pregnancy.

Pregnancy; Immunerepertoire; IGH-CDR3

國(guó)家國(guó)際科技合作專(zhuān)項(xiàng)項(xiàng)目(2012DFB30130)、國(guó)家自然科學(xué)基金(81501418)

2016-03-22

2016-04-08

10.3969/j.issn.1004-8189.2016.05

*通訊作者：xumagroup@163.com