于慶生　經(jīng)文善　宋加奎　張　琦　劉舉達(dá)

(1 安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院普外科，合肥，230031； 2 安徽省中醫(yī)藥科學(xué)院中醫(yī)外科研究所，合肥，230061)

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丹參及其聯(lián)合5-FU對(duì)人胃癌SGC-7901細(xì)胞凋亡的影響

于慶生1,2經(jīng)文善1宋加奎1張琦1,2劉舉達(dá)1,2

(1 安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院普外科，合肥，230031； 2 安徽省中醫(yī)藥科學(xué)院中醫(yī)外科研究所，合肥，230061)

目的：探討中藥丹參對(duì)人胃癌SGC-7901細(xì)胞凋亡的影響。方法：采用Annexin V-FITC/PI雙染法，使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)不同濃度丹參、5-FU及二者聯(lián)合對(duì)人胃癌SGC-7901細(xì)胞的凋亡率影響。采用熒光顯微鏡觀察不同濃度丹參、5-FU及二者聯(lián)合對(duì)人胃癌SGC-7901細(xì)胞凋亡數(shù)量的影響。結(jié)果：1)不同濃度丹參溶液作用于人胃腺癌SGC-7901細(xì)胞后，細(xì)胞的凋亡率大于陰性對(duì)照組，且隨藥物濃度的增加而增加；2)丹參、5-FU聯(lián)合用藥作用于人胃癌SGC-7901細(xì)胞后，細(xì)胞的凋亡率大于單純丹參組和5-FU組，且隨丹參藥物濃度的增加而增加；3)通過熒光顯微鏡觀察可見聯(lián)合用藥組細(xì)胞數(shù)量少于陰性對(duì)照組，凋亡細(xì)胞數(shù)隨藥物濃度的增加而增多。結(jié)論：丹參能引起人胃癌SGC-7901細(xì)胞形態(tài)變化，能促進(jìn)5-FU誘導(dǎo)胃癌SGC-7901細(xì)胞凋亡，且有劑量依賴性。

丹參；人胃腺癌SGC-7901細(xì)胞；凋亡

胃癌是臨床常見的惡性腫瘤，占消化道腫瘤發(fā)病的第1位，確診時(shí)90%已屬進(jìn)展期，盡管給予了包括廣泛淋巴結(jié)清掃的腫瘤根治性切除，但仍有半數(shù)在5年內(nèi)復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，并最終導(dǎo)致死亡。直至目前，化療被認(rèn)為是防治胃癌術(shù)后復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的最主要方法，但其總體療效令人悲觀，主要原因是腫瘤細(xì)胞存在著廣泛的耐藥性，且各種化療藥物都存在較大的不良反應(yīng)。5-FU是臨床胃癌化療最常用的藥物，眾多研究表明[1-4]，中藥丹參不僅能提高5-FU的抗癌療效，而且可以減少其不良反應(yīng)，但其確切機(jī)制尚未闡明。本文通過觀察丹參對(duì)人胃癌SGC-7901細(xì)胞凋亡的影響，揭示其抗腫瘤機(jī)制，為臨床應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1腫瘤細(xì)胞人胃腺癌SGC-7901細(xì)胞由安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室提供，來源于上海腫瘤研究所生物細(xì)胞庫(kù)。

1.1.2藥物與試劑注射用丹參(凍干)，哈藥集團(tuán)中藥二廠生產(chǎn)，400 mg/支，生產(chǎn)批號(hào)：1310317；氟尿嘧啶注射液，天津金耀氨基酸有限公司生產(chǎn)，250 mg/支，生產(chǎn)批號(hào)：1310261；DMEM(高糖)培養(yǎng)基，自賽默飛世爾生物化學(xué)制品(北京)有限公司，批號(hào)：NXK0732；胎牛血清，購(gòu)自浙江天杭生物科技有限公司，批號(hào)：NVW0526；四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)，北京綠生源科技有限公司；胰蛋白酶細(xì)胞消化液，自碧云天生物技術(shù)研究所，批號(hào)：CD201；二甲基亞礬(DMSO)，Sigma公司，批號(hào)：D8418；Annexin V-FITC/PI雙染細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒：上海貝博生物試劑公司，批號(hào)：401002。

1.1.3儀器潔凈工作臺(tái)：蘇凈集團(tuán)安泰公司；FACS Calibur流式細(xì)胞儀：美國(guó)Becton Dickinson公司；熒光顯微鏡：德國(guó)徠卡DMI-6000B；5%二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱：日本Sanyo公司；CK2型倒置顯微鏡：日本Olympus公司；電子精密天平：上海精密科學(xué)儀器有限公司；培養(yǎng)/干燥箱：上海一恒科技有限公司；LD4-8型低速離心機(jī)：北京醫(yī)用離心機(jī)廠；滅菌鍋：日本Tomy KOQYO公司；培養(yǎng)瓶、96孔培養(yǎng)板：美國(guó)Corning公司；HF Super NW系列超純水儀：上海康雷分析儀器有限公司；WD-9405B搖床：北京市六一儀器廠；垂直板電泳槽：BIO-RAD(PowerPac BasiC)公司；電熱恒溫箱：上海三發(fā)；漩渦混合器：其林貝爾儀器制造公司；離心機(jī)：安徽嘉文；雙向磁力攪拌器：江蘇省金壇市金城國(guó)勝實(shí)驗(yàn)儀器廠。

1.2方法

1.2.1分組方法本實(shí)驗(yàn)分組有聯(lián)合用藥組、對(duì)照組和丹參組，其中聯(lián)合用藥組分3亞組，分別為：高劑量聯(lián)合用藥組(高聯(lián)組)、中劑量聯(lián)合用藥組(中聯(lián)組)、低劑量聯(lián)合用藥組(低聯(lián)組)；對(duì)照組分2亞組，分別為：陽(yáng)性對(duì)照組(陽(yáng)性組)、陰性對(duì)照組(正常組)；丹參組分3亞組，分別為高劑量丹參組(高丹組)、中劑量丹參組(中丹組)、低劑量丹參組(低丹組)。

1.2.2給藥方法給藥劑量根據(jù)對(duì)丹參安全劑量及5-FU半數(shù)抑制濃度的篩選而定，高聯(lián)組予丹參最大安全劑量及5-FU IC50值劑量，中聯(lián)組給予丹參最大安全劑量的1/2及5-FU IC50值劑量，低聯(lián)組予以丹參最大安全劑量1/4及5-FU IC50值劑量。陽(yáng)性對(duì)照組(陽(yáng)性組)和陰性對(duì)照組(正常組)分別予以5-FU IC50值劑量和完全培養(yǎng)基。高丹組予丹參最大安全劑量，中丹組予丹參最大安全劑量的1/2，低丹組予丹參最大安全劑量的1/4。

1.2.3藥物配置方法取丹參凍干粉一支，用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液稀釋成10 mL丹參母液(濃度為40 000 mg/L)，吹打混勻后置于15 mL離心管中。同樣，氟尿嘧啶注射液1支(2 500 mg∶10 mL)，用10 mL注射器輕輕吸取液體藥物置于15 mL離心管中，分別存入-20 ℃冰箱避光保存，使用時(shí)將其按要求稀釋到相應(yīng)的工作濃度進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.4細(xì)胞培養(yǎng)方法將人胃癌SGC-7901細(xì)胞用含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)液，置37 ℃、5%CO2的飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔天全量換液。待貼壁細(xì)胞長(zhǎng)滿培養(yǎng)瓶底80%呈基本融合的狀態(tài)時(shí)，予以胰酶消化后傳代，約2～3 d傳代1次，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.5測(cè)定丹參對(duì)人胃癌SGC-7901細(xì)胞生長(zhǎng)抑制作用的安全濃度方法將濃度為2×104/mL的細(xì)胞懸液接種到96孔板中，100 μL/孔；置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，然后分別加入配制的1 000 μg/mL、500 μg/mL、250 μg/mL、125 μg/mL和62.5 μg/mL 5個(gè)濃度的丹參完全培養(yǎng)液，同時(shí)設(shè)立陰性對(duì)照組(正常組)和空白對(duì)照組，陰性對(duì)照組加入不含藥物的完全培養(yǎng)液，空白對(duì)照組在不含細(xì)胞的孔中加入完全培養(yǎng)液，終體積為200 μL/孔，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，分別作用24 h、48 h和72 h。作用時(shí)間到后，將細(xì)胞與5 mg/mL MTT溶液共同置于37 ℃下孵育4 h，吸棄上清液，每孔加入150 μL DMSO，低速搖床上輕輕震蕩15 min，在酶標(biāo)儀570 nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔吸光度值(OD值)。將結(jié)果代入公式計(jì)算不同濃度的丹參對(duì)胃癌SGC-7901細(xì)胞抑制率。

抑制率(%)=[1-(實(shí)驗(yàn)組OD值-空白對(duì)照組OD值)/(陰性對(duì)照組(正常組)OD值-空白孔OD值)]×100%。經(jīng)計(jì)算得出丹參作用于人胃腺癌SGC-7901細(xì)胞24 h/48 h/72 h的安全濃度分別≤250 μg/mL、≤125 μg/mL、≤62.5 μg/mL。

1.2.6測(cè)定5-FU不同濃度對(duì)人胃癌SGC-7901細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度(IC50值)方法將濃度為2×104/mL的細(xì)胞懸液接種到96孔板中，每孔100 μL；置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，接種于96孔板中的細(xì)胞分別加入配制的125 μg/mL、62.5 μg/mL、31.25 μg/mL、15.625 μg/mL和7.812 5 μg/mL 5個(gè)濃度的5-FU完全培養(yǎng)液，并設(shè)立陰性對(duì)照組(正常組)和空白對(duì)照組，方法同上，最后在酶標(biāo)儀570 nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔吸光度值(OD值)，求出5-氟尿嘧啶對(duì)成纖維細(xì)胞半數(shù)抑制濃度(IC50值)。

抑制率(%)=[1-(實(shí)驗(yàn)組OD值-空白對(duì)照組OD值)/(陰性對(duì)照組(正常組)OD值-空白孔OD值)]×100%。經(jīng)計(jì)算得出5-FU作用于人胃癌SGC-7901細(xì)胞24/48/72 h的IC50濃度值分別為279.043 μg/mL、62.533 μg/mL、13.509 μg/mL。

1.2.7觀察指標(biāo)及其檢測(cè)方法

1.2.7.1人胃癌SGC-7901細(xì)胞的凋亡率流式細(xì)胞儀檢測(cè)不同濃度丹參、5-FU及二者聯(lián)合對(duì)人胃癌SGC-7901細(xì)胞的凋亡率(Annexin V-FITC/PI雙染法)。

取人胃癌SGC-7901細(xì)胞，經(jīng)0.25%胰蛋白酶消化成單細(xì)胞懸液，用10%胎牛血清的DMEM全培養(yǎng)液將細(xì)胞濃度調(diào)成4×104cells/mL。細(xì)胞以每瓶2 mL的細(xì)胞懸液接種到培養(yǎng)瓶中，再加入3 mL培養(yǎng)液，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱。培養(yǎng)24 h后棄上清，PBS清洗兩次，分別加入之前配制的125 μg/mL丹參+62.5 μg/mL 5-FU溶液、62.5 μg/mL丹參+62.5 μg/mL 5-FU溶液、31.25 μg/mL丹參+62.5 μg/mL 5-FU溶液和62.5 μg/mL 5-FU溶液4個(gè)濃度的溶液，即分別對(duì)應(yīng)為高聯(lián)組、中聯(lián)組、低聯(lián)組和陽(yáng)性組；正常組為加入不含藥物的新鮮完全培養(yǎng)液；同時(shí)設(shè)立丹參組：125 μg/mL丹參溶液、62.5 μg/mL丹參溶液和31.5 μg/mL丹參溶液，即分別對(duì)應(yīng)為高丹組、中丹組和低丹組。每瓶細(xì)胞所加溶液量各5 mL，每個(gè)濃度組2瓶細(xì)胞，置于37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。同時(shí)設(shè)立一個(gè)空白組，2個(gè)單染組(3組均為加入5 mL不含藥物的新鮮完全培養(yǎng)液)。培養(yǎng)結(jié)束后PBS清洗2次，用不含EDTA的胰酶消化后離心，收集細(xì)胞PBS清洗后，加入400 μL 1×Annexin V結(jié)合液，制成濃度大約為1×106cells/mL細(xì)胞懸浮液。在細(xì)胞懸浮液中先后加入5 μL Annexin V-FITC染色液和10 μL PI染色液染色?？瞻捉M不加染色劑，2個(gè)單染組分別只加5 μL Annexin V-FITC染色液和10 μL PI染色液。采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.2.7.2凋亡細(xì)胞熒光顯微鏡下觀察熒光顯微鏡下觀察不同濃度丹參、5-FU及二者聯(lián)合對(duì)人胃癌SGC-7901細(xì)胞凋亡情況。

表1　不同濃度丹參、5-FU以及兩者合用人胃癌SGC-7901細(xì)胞凋亡率

注：**：與陽(yáng)性對(duì)照組相比P<0.01，*：與陽(yáng)性對(duì)照組相比P<0.05。

2　結(jié)果

2.1人胃癌SGC-7901細(xì)胞的凋亡率結(jié)果如表1，藥物作用于人胃癌SGC-7901細(xì)胞48 h后，安全劑量區(qū)間內(nèi)丹參(31.25 μg/mL、62.5 μg/mL、125 μg/mL)各組對(duì)人胃癌SGC-7901細(xì)胞的凋亡率均大于正常組(P<0.05)。并且藥物丹參與5-FU之間存在交互作用(P<0.01)。其中，高劑量聯(lián)合用藥組與陽(yáng)性對(duì)照組相比較后有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，中劑量聯(lián)合用藥組與陽(yáng)性對(duì)照組相比較后有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，低劑量聯(lián)合用藥組與陽(yáng)性對(duì)照組相比較后無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.2凋亡人胃癌SGC-7901細(xì)胞熒光顯微鏡下觀察結(jié)果如圖1所示，染色后熒光顯微鏡下觀察可見聯(lián)合用藥組、陽(yáng)性對(duì)照組與正常組(陰性對(duì)照組)相比較，正常貼壁細(xì)胞密度變小，出現(xiàn)大量被染成綠色和紅色的凋亡和壞死細(xì)胞。高劑量聯(lián)合用藥組、中劑量聯(lián)合用藥組與陽(yáng)性對(duì)照組處理組變化亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，低劑量聯(lián)合用藥組與陽(yáng)性對(duì)照組處理組變化不太明顯。安全劑量?jī)?nèi)丹參(31.25 μg/mL、62.5 μg/mL、125 μg/mL)各組與正常組相比較組間總體統(tǒng)計(jì)學(xué)意義不明顯，但丹參組有少量凋亡細(xì)胞出現(xiàn)，特別是中劑量丹參組和高劑量丹參組。

圖1　丹參、5-FU以及兩者合用對(duì)SGC-7901細(xì)胞作用48 h染色后熒光顯微鏡鏡下觀察

注：A：高劑量聯(lián)合用藥組(125 μg/mL丹參+62.5 μg/mL 5-FU)；B：中劑量聯(lián)合用藥組(62.5 μg/mL丹參+62.5 μg/mL 5-FU)；C：低劑量聯(lián)合用藥組(31.25 μg/mL丹參+62.5 μg/mL 5-FU)；D：陽(yáng)性對(duì)照組(62.5 μg/mL 5-FU)；E：陰性對(duì)照組：無(wú)藥物的完全培養(yǎng)液；F：低劑量丹參組(31.25 μg/mL丹參)；G：中劑量丹參組(62.5 μg/mL丹參)；H：高劑量丹參組(125 μg/mL丹參)。

3　討論

細(xì)胞凋亡是生物細(xì)胞為維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定而受基因調(diào)控的主動(dòng)自殺過程，可以清除多余無(wú)用、衰老、突變的細(xì)胞，是機(jī)體生長(zhǎng)發(fā)育、維持健康的基礎(chǔ)[5]。而腫瘤細(xì)胞的特征之一就是缺乏這種程序性的死亡過程，細(xì)胞凋亡受阻在腫瘤的發(fā)生中占有重要地位，如何誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡已作為腫瘤治療研究的新熱點(diǎn)[6]。

細(xì)胞凋亡檢測(cè)方法多樣。Annexin V可與早期凋亡細(xì)胞轉(zhuǎn)移至胞膜外的磷脂酞絲氨酸及已凋亡細(xì)胞外側(cè)的磷脂酞絲氨酸結(jié)合染色[7]；碘化丙啶(PI)可以透過凋亡中晚期及凋亡細(xì)胞的細(xì)胞膜而使細(xì)胞核染色，但不能通過完整的細(xì)胞膜[8]。單獨(dú)用Annexin V-FITC法不能區(qū)分細(xì)胞凋亡各期，因此采用Annexin V-FITC/PI 雙染可以將凋亡各期細(xì)胞及已凋亡細(xì)胞區(qū)分開來[7-8]。流式細(xì)胞儀是對(duì)高速直線流動(dòng)單細(xì)胞懸液進(jìn)行快速定量測(cè)定和分析的儀器，其優(yōu)點(diǎn)是簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確、靈敏，當(dāng)細(xì)胞發(fā)生凋亡緩慢和不一致時(shí)，檢測(cè)更為準(zhǔn)確[9-10]。采用Annexin V-FITC/PI雙染法，使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)不同濃度丹參、5-FU及2者聯(lián)合對(duì)人胃癌SGC-7901細(xì)胞的凋亡率影響，結(jié)果表明，不同濃度丹參溶液作用于人胃腺癌SGC-7901細(xì)胞后，細(xì)胞的凋亡率大于陰性對(duì)照組，且隨藥物濃度的增加而增加；丹參、5-FU聯(lián)合用藥作用于人胃癌SGC-7901細(xì)胞后，細(xì)胞的凋亡率大于單純丹參組和5-FU組，且隨丹參藥物濃度的增加而增加。熒光顯微鏡觀察是以紫外線為光源，照射染色后的物體，較為直觀的觀察細(xì)胞形態(tài)，是檢測(cè)細(xì)胞凋亡的重要手段之一[11]。本研究采用熒光顯微鏡觀察不同濃度丹參、5-FU及2者聯(lián)合對(duì)人胃癌SGC-7901細(xì)胞凋亡數(shù)量的影響。結(jié)果表明，聯(lián)合用藥組細(xì)胞數(shù)量少于陰性對(duì)照組，凋亡細(xì)胞數(shù)隨藥物濃度的增加而增多。

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，機(jī)體實(shí)體腫瘤多是痰、瘀互結(jié)的結(jié)果，活血化瘀、化痰散結(jié)是中醫(yī)治療惡性腫瘤的最基本法則。研究表明[12-13]，中醫(yī)中藥可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，提高腫瘤的治療效果。丹參味苦，性微寒，入心、肝經(jīng)，是傳統(tǒng)具有代表性的活血化瘀藥，很容易推測(cè)該藥可能具有抗腫瘤作用。諸多的臨床和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)[14-18]，丹參具有廣譜的抗腫瘤作用，當(dāng)?shù)⒙?lián)合5-FU使用時(shí)可以顯著提高腫瘤的治療效果，并且可能與促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡關(guān)系密切[19-21]。但對(duì)人胃癌SGC-7901細(xì)胞的影響及其機(jī)制尚不清楚。

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(2015-08-23收稿責(zé)任編輯：徐穎)

The Effect of Salvia Miltiorrhiza and its Combination with 5-FU on Apoptosis of Human Gastric Cancer SGC-7901 Cells

Yu Qingsheng1,2, Jing Wenshan1, Song Jiakui1, Zhang Qi1,2, Liu Juda1,2

(1DepartmentofGeneralSurgery,theFirstAffiliatedHospitalofAnhuiTraditionalChineseMedicineUniversity,Hefei230031,China; 2InstituteofChineseMedicineSurgery,AnhuiChineseMedicineAcademyofSciences,Hefei230061,China)

Objective: To observe the effects of Salvia miltiorrhiza on apoptosis of human gastric cancer SGC-7901 cells. Methods: To test the effects of different concentrations of Salvia miltiorrhiza, different concentrations of 5-FU, and the mixtures on apoptosis rate of human gastric cancer SGC-7901 cells by flowing cytometry after AnnexinV-FITC/PI staining. To observe the effects of different concentrations of Salvia miltiorrhiza, different concentrations of 5-FU, and the mixtures on number of apoptosis of human gastric cancer SGC-7901 cells by fluorescence microscope. Results: 1) The apoptosis rate of human gastric cancer SGC-7901 cells that disposed with different concentrations of Salvia miltiorrhiza is higher than the control group, and the apoptosis rate has raised with the increase of concentration of Salvia miltiorrhiza.2) The apoptosis rate of human gastric cancer SGC-7901 cells that disposed with combination therapy group is higher than that of the group disposed by only Salvia miltiorrhiza or 5-FU, and the apoptosis rate increased with the increase of concentration of Salvia miltiorrhiza. 3)Using the Fluorescence microscopy, we can find that the number of the intact cells in Salvia miltiorrhiza combined with 5-Fu groups were all lower than the control group, and the number of apoptotic cells has increased with the drug concentration increasing. Conclusion: Salvia miltiorrhiza can cause human gastric cancer SGC-7901 cell morphological changes and accelerate 5-FU induce the apoptosis of cell, which was correlated with dose.

Salvia; Human gastric cancer SGC-7901 cells; Apoptosis

十二五國(guó)家臨床重點(diǎn)?？平ㄔO(shè)項(xiàng)目(編號(hào)：財(cái)社〔2013〕239號(hào))

于慶生(1963.12—)，男，教授，主任醫(yī)師，博士生導(dǎo)師，安徽省中醫(yī)藥科學(xué)院中醫(yī)外科研究所所長(zhǎng)，普外科主任，外科教研室主任，研究方向：胃腸外科基礎(chǔ)與臨床，E-mail：qsy6312@163.com

R285

A doi：10.3969/j.issn.1673-7202.2016.07.043