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(首都醫(yī)科大學附屬北京佑安醫(yī)院，北京100069)

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·臨床免疫學·

中國北京男男同性戀艾滋病感染者HLA分型及與疾病進展分析①

孫堅萍孫煥芹劉寧劉桂海叢佳②張永宏③

(首都醫(yī)科大學附屬北京佑安醫(yī)院，北京100069)

①本文為國家十二五傳染病重大專項(2012ZX10001006-001-008,2013ZX10001004-001-002)、北京市科委(D131100005313004，D131100005313005，D141100000314005和D141100000314002)。

②首都醫(yī)科大學附屬北京同仁醫(yī)院血液科，北京100730。

目的：分析中國北京男男同性戀艾滋病感染者HLA-A、HLA-B、HLA-C基因頻率以及HLA基因分型與疾病進展關(guān)系。方法：序列特異性引物的PCR擴增(PCR-sequence specific primer typing,PCR-SSP)對310名隨機中國北京男男同性戀艾滋病感染者HLA-A、HLA-B、HLA-C基因進行分型,采用HIV Molecular Immunology Database中HLA Analysis Tools方法計算等位基因頻率。結(jié)果：在北京男男同性戀艾滋病感染者隊列中，HLA-A*1101(34.52%)基因頻率最高，其次為HLA-A*0201(31.94%)、HLA-C*0102(27.10%)以及HLA-A*2402(26.45%)。根據(jù)艾滋病感染者1年內(nèi)CD4細胞計數(shù)變化來判斷感染者是否為快速進展者，結(jié)果發(fā)現(xiàn)快速進展者134例，非快速進展者176例?？焖龠M展者中存在低水平的HLA-B*4403(快速進展者1.12%，非快速進展者為4.27%,P=0.0276)，HLA-B*1511(非快速進展者5.98%,快速進展者2.25%,P=0.0282),HLA-B*5701(非快速進展者2.56%,快速進展者0.37%,P=0.0491)表達，而HLA-C*0304則在快速進展者中高表達(非快速進展者4.56%,快速進展者8.96%,P=0.0319)。結(jié)論：本研究獲得了中國北京男男同性戀艾滋病感染者HLA-A、 HLA-B、HLA-C基因的等位基因分布頻率數(shù)據(jù)，并發(fā)現(xiàn)HLA-B*4403、HLA-B*1511、HLA-B*5701與延緩艾滋病疾病進展有關(guān)，而HLA-C*0304則與加速艾滋病疾病進展相關(guān)。

HIV;人類白細胞抗原;男男同性戀

盡管國內(nèi)外對艾滋病已經(jīng)研究了很多年，但是艾滋病依然是國際上最嚴重的傳染病之一。根據(jù)疾控部門權(quán)威數(shù)據(jù)統(tǒng)計，目前性傳播已成為中國艾滋病傳播主要途徑，其中男男性行為者(Men who have sex with men,MSM)是我國當前艾滋病新發(fā)感染的主體人群[1,2]。如何控制MSM人群的HIV傳播風險關(guān)系到我國艾滋病防治工作的成敗。艾滋病感染的發(fā)生發(fā)展除了與HIV(Human Immunodeficiency Virus,HIV)病毒本身的病原學特征有關(guān)外，還與機體的遺傳基因、免疫因素密切相關(guān)。其中人類白細胞抗原(Human leucocyte antigen,HLA)是人類最重要的免疫遺傳基因和器官移植免疫基因,與艾滋病病毒感染密切相關(guān)。

HLA定位于第6對染色體短臂(6p21.31)，按基因產(chǎn)物和功能不同可分為HLA-Ⅰ類(包括HLA-A、HLA-B和HLA-C)； HLA-Ⅱ類(包括HLA-DP、HLA-DQ和HLA-DR)；HLA-Ⅲ類(包括補體分子、腫瘤壞死因子等)[3]。艾滋病是少數(shù)幾個與HLA明確相關(guān)的感染性疾病，已有很多研究報道HLA分型和艾滋病疾病進展相關(guān)。如HLA-B*58與非洲大陸人種的HIV-1感染性相關(guān)[4]。HLA-B*57是一個潛在的與HIV不易感性密切相關(guān)的多態(tài)性位點[5]。HLA-B*27和 HLA-B*57在白種人群中與延緩疾病進展相關(guān)[6,7]。在本研究中，我們主要對中國北京男男同性戀艾滋病感染者的HLA等位基因分型進行分析，并探討HLA等位基因分型和男男同性戀艾滋病感染者疾病進展間的相關(guān)關(guān)系。

HLA基因分型技術(shù)隨著分子生物學方法的快速進展也得到了進一步發(fā)展。原先屬于同一個血清學特異性的抗原往往可被數(shù)個甚至數(shù)十個不同的等位基因所編碼，表明同一個特異性的HLA抗原實際上由多個亞型組成。其中基于DNA測序的方法能夠比較全面的描述HLA基因的復雜性和多樣性。具體方法包括PCR產(chǎn)物的序列特異寡核苷酸探針雜交(PCR-sequence specific oligonucleotide hybridization typing,PCR-SSO)、序列特異性引物的PCR擴增(PCR-sequence specific primer typing,PCR-SSP)和序列直接分型(PCR-sequencing based typing,PCR-SBT)?；贒NA測序結(jié)果發(fā)現(xiàn)編碼HLA-A2抗原的等位基因數(shù)已經(jīng)超過100個；編碼HLA-DR4的等位基因也至少有36個。DNA測序結(jié)果對某一個等位基因，先寫出座位名，下接*號，再用4個數(shù)字代表這個等位基因的名字。例如B*2707、DRB1*0405、DQB1*0301等。*號后面的4位數(shù)中前兩位是指這個等位基因相應的血清學特異性；后兩位數(shù)則代表該等位基因序號。在本研究中，我們對HLA等位基因進行了4位數(shù)字的分析。

我們利用PCR-SSP方法對中國北京MSM人群進行了HLA-Ⅰ類(包括HLA-A、HLA-B、HLA-C)分型，并進一步分析HLA分型和艾滋病感染者疾病進展間的相關(guān)關(guān)系。

1　材料與方法

1.1研究對象根據(jù)知情同意原則，在首都醫(yī)科大學附屬北京佑安醫(yī)院收集HIV-1陽性男男同性戀感染者310例(隨訪時間為2007年～2014年)。全部感染者均為男性，年齡為18～60歲，平均(31.2±6.9)歲，民族主要為漢族，其他民族包括滿族、回族、朝鮮族、蒙族、蒙古族、苗族，均未接受抗病毒治療。全部感染者均經(jīng)Western印跡試驗確認陽性。EDTA抗凝管采集感染者外周靜脈血，6 h內(nèi)常規(guī)離心分離血漿和全血，分裝后-80℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2人基因組DNA提取采用QIAamp DNA Blood mini Kit(德國Qiagen公司)從200 μl全血中提取人基因組DNA，具體按照試劑盒說明書進行。DNA溶于50 μl無DNA酶及RNA酶的水中，-20℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.1HLA等位基因型測定采用PCR方法對目的片段進行擴增,擴增用的DNA 聚合酶，LA Taq DNA聚合酶等試劑購自TaKaRa公司。引物根據(jù)NCBI中人類HLA-A、B、C三個基因的序列，分別設(shè)計合成引物用于擴增上述三個基因的這三個外顯子(exon2、3、4)的全長序列。HLA-C擴增不容易成功，又補充設(shè)計合成了一對引物，用于擴增HLA-C位點全長序列。PCR循環(huán)結(jié)束后取PCR產(chǎn)物用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。檢測有目的條帶的樣品，切膠純化后使用雙向引物進行測序,每個位點對應的雙向測序結(jié)果用ChromasPro軟件進行分析，確定雜合位點，然后導入IMGT/HLA database(http://www.ebi.ac.uk/imat/hla/)確定每個位點對應的基因型(委托北京諾賽有限公司)。引物序列見表1。1.2.2HLA等位基因型分析應用HIV Molecular Immunology Database中HLA Analysis Tools(http：//www.hiv.lanl.gov/content/immuno-logy/to-ols-links.ht ml)進行HLA等位基因頻率分析及組間對比分析。

1.2.3感染者CD4/CD8細胞計數(shù)常規(guī)檢測感染者不同時間點的CD3/CD4/CD8絕對計數(shù)，檢測采用TriTEST三色試劑(BD Company,FranklinLakes,New Jersey,USA)進行檢測，用MultiSET軟件進行分析。組間比較采用非配對t檢驗進行統(tǒng)計學分析(ttests，GraphPad Prism 6)。

表1　擴增HLA-A、B、C目的片段的引物序列和擴增片段長度Tab.1　Sequence of PCR primer for HLA-A,B,C

2　結(jié)果

2.1HLA等位基因型頻率本研究在310例艾滋病感染者中共檢出29種HLA-A等位基因，48種HLA-B等位基因和25種HLA-C等位基因(圖1)。在HLA-A等位基因中，HLA-A*1101(34.52%)基因頻率最高，其次為HLA-A*0201(31.94%)、HLA-A*2402(26.45%)?；蝾l率最高的HLA-B等位基因型為HLA-B*4001(15.16%)，其次為HLA-B*1501(14.84%)，HLA-B*4601(14.84%)。HLA-C等位基因中HLA-C*0102頻率最高(27.10%)，其次為HLA-C*0303(22.90%)、HLA-C*0702(22.26%)。本研究中，等位基因頻率超過10%的HLA等位基因型由高到低的順序分別為HLA-A*1101、HLA-A*0201、HLA-C*0102、HLA-A*2402、HLA-C*0303、HLA-C*0702、HLA-C*0602、HLA-B*4001、HLA-C*0801、HLA-B*1501、HLA-B*4601、HLA-C*0304、HLA-B*5101、HLA-C*1402、HLA-A*0206、HLA-B*3501、HLA-A*0207、HLA-C*0401、HLA-B*1302(表2)。

2.2艾滋病感染者疾病進展分組對男男同性戀高危人群進行隨訪，在艾滋病抗體檢測陽性后繼續(xù)對感染者進行隨訪，根據(jù)隨訪者的CD4計數(shù)進行疾病進展判斷，快速進展者為接受抗病毒治療時CD4計數(shù)低于350個/μl，或感染者在檢測陽性后1年內(nèi)CD4計數(shù)低于350個/μl[8]。在本研究中，310例感染者分為兩組，一組為快速進展者(n=134例,平均年齡30.77±7.73歲)，另一組為非快速進展者[n=176例，平均年齡(31.88±7.99)歲]，兩組間平均年齡不存在統(tǒng)計學差異(P>0.05)。比較兩組間陽性時的CD4細胞計數(shù)，結(jié)果見圖2，兩組間檢測陽性時CD4細胞計數(shù)存在顯著差異(快速進展者313.5個/μl±12.06，非快速進展者521.3個/μl±15.44，P<0.0001)。比較兩組間陽性時CD8細胞計數(shù)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)CD8細胞計數(shù)快速進展組雖然高于非快速進展者，但是兩者之間不存在統(tǒng)計學差異(快速進展者1 188個/μl±65.76，非快速進展者1 153個/μl±56.37，P=0.702 6)。

圖1　中國北京男男同性戀艾滋病感染者HLA分型頻率Fig.1　Frequency of HLA in MSM cohort

表2　HLA基因分型在男男同性戀艾滋病感染者人群中的分布頻率Tab.2　HLA allelic frequencies and population frequencies in MSM cohort

圖2　快速進展組和非快速進展組CD4/CD8細胞計數(shù)比較(mann-whitney test)Fig.2　Compare CD4 T cell counts and CD8 T cell counts in rapid progressors and nonprogressors(mann-whitney test)

圖3　快速進展組和非快速進展組HLA分型頻率比較Fig.3　Compare HLA frequencies in rapid progressors and nonprogressorsNote: Population 1 is nonprogressors and population 2 is rapid prognessors by HIV.

2.3HLA基因分型和艾滋病疾病進展利用HIV Molecular Immunology Database對快速進展者和非快速進展者的HLA基因分型表達頻率進行比較。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在快速進展組，HLA基因分型主要為HLA-A*1101(20.90%)、HLA-A*0201(16.04%)、HLA-C*0102(16.04%)、HLA-A*2402(15.67%)；在非快速進展組中，HLA分型主要為HLA-A*0201(18.75%)、HLA-A*1101(18.18%)、HLA-C*0602(13.68%)、HLA-A*2402(13.64%)。比較快速進展組和非快速進展組的HLA分型表達頻率差異，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在這兩組中存在四種HLA分型表達差異(圖3)，包括HLA-B*4403(非快速進展者為4.27%,快速進展者1.12%,P=0.027 6)，HLA-B*1511(非快速進展者5.98%,快速進展者2.25%,P=0.028 2),C*0304(非快速進展者4.56%,快速進展者8.96,P=0.031 9),B*5701(非快速進展者2.56%,快速進展者0.37%,P=0.049 1)。

3　討論

研究報道在艾滋病感染的三種途徑中，母嬰傳播、血液傳播(特別是靜脈注射傳播)得到有效控制的同時，性途徑的傳播并未得到有效遏制，其中男男性接觸人群中的艾滋病(Men sex with men，MSM)疫情正在迅速蔓延，男男同性戀在北京市HIV感染者中的比例也在逐年上升[1,2]。

人白細胞抗原系統(tǒng)的高度多態(tài)性顯示了遺傳背景的多樣性，在我們前期研究中發(fā)現(xiàn)在中國中部SM隊列(90年代經(jīng)靜脈采血途徑感染艾滋病的感染者隊列)中，HLA分布為HLA-A02(52%)、HLA-A11(25%)、HLA-A24(29%)、HLA-A30(20%)、HLA-B40(26%)、HLA-C03(32%)、HLA-C07(29%)、HLA-C06(28%)、HLA-C08(22%)和HLA-C01(19%)。而在本研究中，我們采用PCR-SSP方法對MSM感染者進行了更為精確的4位HLA分型分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在MSM隊列中HLA-A*1101(34.52%)基因頻率最高，其次為HLA-A*0201(31.94%)、HLA-A*2402(26.45%)?；蝾l率最高的HLA-B等位基因型為HLA-B*4001(15.16%)，其次為HLA-B*1501(14.84%)、HLA-B*4601(14.84%)，HLA-C中HLA-C*0102頻率最高(27.10%)，其次為HLA-C*0303(22.90%)、HLA-C*0702(22.26%)。這些結(jié)果提示在不同的艾滋病感染者中，由于區(qū)域的不同導致了艾滋病感染者HLA分型的不同，我們的結(jié)果為了解不同區(qū)域艾滋病感染者的HLA分型提供了更精確的數(shù)據(jù)。

根據(jù)感染者CD4細胞計數(shù)的隨訪結(jié)果，310例MSM艾滋病感染者分為兩組，比較這兩組的HLA基因分型我們發(fā)現(xiàn)，HLA-B*4403(非快速進展者為4.27%,快速進展者1.12%,P=0.027 6)，HLA-B*1511(非快速進展者5.98%,快速進展者2.25%,P=0.028 2),HLA-B*5701(非快速進展者2.56%,快速進展者0.37%,P=0.049 1)與艾滋病疾病的延緩相關(guān)，而HLA-C*0304則與加速艾滋病疾病進展相關(guān)(非快速進展者4.56%,快速進展者8.96,P=0.031 9)。有文獻報道HLA-B等位基因在所有HLA中最具有多態(tài)性(http://www.ebi.ac.uk/imgt/hla),因此對HIV感染的結(jié)局有很大的影響。大量研究顯示HIV感染者CD8+T細胞對HIV的反應受到HLA-B的制約，并且病毒載量的變化與HLA-B基因多態(tài)性有關(guān)[9]。其中HLA-B27、HLA-B57和HLA-B35是研究的較為明確與HIV進展關(guān)系密切的HLA-B等位基因[4-7,10]。在我們的研究中，也顯示主要是HLA-B等位基因(HLA-B*4403、HLA-B*1511和HLA-B*5701)和艾滋病疾病進展相關(guān)。

此外，我們前期研究發(fā)現(xiàn)在SM隊列中有17.90%的感染者為HLA-B51陽性，明顯高于普通

中國人群中HLA-B51的百分率[11]。另外，在HLA-B51陽性的HIV-1 患者中其病毒載量明顯低于HLA-B51陰性患者，提示在該研究隊列中HLA-B51與延緩HIV-1疾病病情進展密切相關(guān)[12]。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)MSM感染者中HLA-B51的陽性率為12.58%。根據(jù)本研究結(jié)果，更精確分析發(fā)現(xiàn)HLA-B*5101占主要部分(12.26%)而HLA-B*5102只占0.97%。而且根據(jù)CD4細胞計數(shù)來判斷艾滋病疾病進展時，未發(fā)現(xiàn)HLA-B51(HLA-B*5101或HLA-B*5102)與MSM感染者的艾滋病疾病進展相關(guān)。原因可能包括：①艾滋病感染者所處區(qū)域的不同：SM隊列為中國中部地區(qū)，而MSM隊列為中國北京；②艾滋病感染者感染時間不同：SM隊列為長期感染不進展者，感染HIV時間長，而MSM隊列為HIV病毒抗體檢測陽性后隨訪1年。

本研究主要對中國北京MSM感染者進行了4位數(shù)字的HLA等位基因分型分析，并初步探討了HLA等位基因分型和艾滋病疾病進展間的相關(guān)關(guān)系，該研究結(jié)果為科學控制MSM感染者艾滋病疾病的進展提供了基礎(chǔ)和依據(jù)。

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[收稿2015-11-19修回2015-12-11]

(編輯倪鵬)

Frequency of HLA gene in MSM cohort and correlation with AIDS disease progression

SUN Jian-Ping,SUN Huan-Qin,LIU Ning,LIU Gui-Hai,CONG Jia,ZHANG Yong-Hong.Beijing Youan Hospital,Capital Medical University,Beijing 100069，China

Objective:HIV-1 infection was associated with a variety of host genetic factors,and HLA was one of the factors that contribute to the progression of disease.We analyze the frequency of HLA-A,HLA-B,HLA-C in MSM cohort,and the relationship between HLA gene with disease progression.Methods: PCR-sequence specific primer typing HLA typing was used to detect the allele frequency of HLA gene in 310 patients.HIV Molecular Immunology Database(HLA Analysis Tools)to analysis the frequency of HLA.Results: In MSM cohort,HLA-A*1101(34.52%) gene was the highest,followed by HLA-A*0201(31.94%),HLA-C*0102(27.10%) and HLA-A*2402(26.45%).According to the CD4 cell count of HIV infected patients,the results showed that there were low levels of HLA-B*4403(1.12%,P=0.0276),HLA-B*1511(2.25%,P=0.0282) and HLA-B*5701(0.37%,P=0.0491) in rapid progressors,while the HLA-C*0304(8.96%,P=0.0319) was higher than that of nonprogressors(4.56%).Conclusion: We obtained the distribution frequency data of HLA-A,HLA-B and HLA-C in MSM cohort.Our data presented here may offer potential correlation between dominant effect of HLA alleles and HIV-1 disease progression.And found that the HLA-B*4403,HLA-B*1511,HLA-B*5701 related to slow HIV disease progression and HLA-C*0304 related to accelerate HIV disease progression.

HIV;HLA;Men who have sex with men

10.3969/j.issn.1000-484X.2016.08.022

R512.91文獻標志碼A

1000-484X(2016)08-1183-05

③，E-mail:13810108505@163.com。

孫堅萍(1977年-)，女，博士，副研究員，主要從事病毒免疫學方面研究。