張立娟

(航空總醫(yī)院檢驗(yàn)科，北京100012)

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磁微?；瘜W(xué)發(fā)光法與酶聯(lián)免疫吸附法測定抗中性粒細(xì)胞胞漿抗體的結(jié)果比較

張立娟

(航空總醫(yī)院檢驗(yàn)科，北京100012)

目的：比較分析磁微粒化學(xué)發(fā)光法與酶聯(lián)免疫吸附法測定抗PR3抗體、抗MPO抗體的檢測結(jié)果。方法：分別采用磁微?；瘜W(xué)發(fā)光法(A方法)和酶聯(lián)免疫吸附法(B方法)對166例自身免疫病患者血清、50例健康者血清中抗PR3抗體、抗MPO抗體進(jìn)行定量檢測，對檢測結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果：A方法測定高、中、低質(zhì)控血清的批內(nèi)和批間重復(fù)性優(yōu)于B方法，A、B方法測定質(zhì)控血清的準(zhǔn)確度均符合要求；A、B方法測定抗PR3抗體、抗MPO抗體臨床樣本的線性相關(guān)系數(shù)r分別為0.987 8，0.989 6；A、B方法的檢測結(jié)果采用kappa分析，kappa系數(shù)分別為0.897和0.882。結(jié)論：磁微?；瘜W(xué)發(fā)光法(A方法)測定抗PR3抗體、抗MPO抗體優(yōu)于酶聯(lián)免疫吸附法(B方法)，更符合臨床應(yīng)用要求。

抗中性粒細(xì)胞胞漿抗體；髓過氧化物酶；蛋白酶3；酶聯(lián)免疫吸附法；磁微?；瘜W(xué)發(fā)光法

抗中性粒細(xì)胞胞漿抗體(ANCA)是能與中性粒細(xì)胞胞漿中的顆粒成分以及單核細(xì)胞內(nèi)的溶酶體反應(yīng)的一組自身抗體，其本質(zhì)是免疫球蛋白[1]。根據(jù)間接免疫熒光法(IIF)陽性熒光區(qū)域的差異，可分為胞漿型ANCA(cNACA)和核周型ANCA(pANCA)，相應(yīng)的主要靶抗原分別為PR3和MPO[2]?？筆R3抗體和抗MPO抗體主要與系統(tǒng)性血管炎相關(guān)，可作為系統(tǒng)性小血管炎的特異性血清學(xué)診斷指標(biāo)[3]。目前定量測定抗PR3抗體和抗MPO抗體均采用ELISA方法，磁微?；瘜W(xué)發(fā)光法是近幾年快速發(fā)展的檢測方法，具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、線性范圍寬、簡單快速、安全無毒等優(yōu)點(diǎn)。本研究采用磁微?；瘜W(xué)發(fā)光法和酶聯(lián)免疫吸附法分別測定臨床不同人群抗PR3抗體和抗MPO抗體，并將兩種方法學(xué)測得的結(jié)果進(jìn)行了比較，報(bào)告如下。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1臨床樣本166例自身免疫性疾病患者均為航空總醫(yī)院門診、住院確診病例，其中確認(rèn)韋格納肉芽腫(WG)86例、顯微鏡下多動脈炎(MPA)28例，Churg-Strauss綜合征52例，臨床診斷符合國內(nèi)或國際的相應(yīng)診斷標(biāo)準(zhǔn)。收集50例健康人群血清作為正常對照組。

選取無溶血、乳糜、黃疸及細(xì)菌污染的高、中、低值3例血清作為質(zhì)控血清，分裝后冷凍保存。每次檢測前取1支室溫融化備用，考察兩種檢測方法的重復(fù)性和準(zhǔn)確度。

1.1.2儀器及試劑全自動化學(xué)發(fā)光免疫分析儀(北京中航賽維生物科技有限公司)；全自動酶聯(lián)免疫分析儀(意大利ELese)?？顾柽^氧化物酶抗體(Anti-MPO)測定試劑盒(磁微?；瘜W(xué)發(fā)光法)、抗蛋白酶3抗體(Anti-PR3)測定試劑盒(磁微?；瘜W(xué)發(fā)光法)由北京中航賽維生物科技有限公司提供?？顾柽^氧化物酶抗體檢測試劑盒(ELISA)、抗蛋白酶3抗體檢測試劑盒(ELISA)購自歐蒙醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)診斷股份公司。

1.2方法

1.2.1磁微粒化學(xué)發(fā)光法(A方法)按照全自動操作流程測試樣本，由軟件自動顯示測試結(jié)果?？筆R3抗體和抗MPO抗體正常參考值均為0～20 RU/ml，超過20 RU/ml則判為陽性結(jié)果。

1.2.2酶聯(lián)免疫吸附法(B方法)參照說明書進(jìn)行操作，簡要步驟如下:待測血清使用樣本稀釋液以1∶101稀釋，加樣量為100 μl，根據(jù)微孔板定標(biāo)曲線計(jì)算待測血清相應(yīng)抗體濃度，當(dāng)抗PR3抗體和抗MPO抗體濃度≥20 RU/ml，判定為陽性結(jié)果。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

1.3.1使用SPSS18.0軟件對兩種方法測定抗PR3抗體和抗MPO抗體質(zhì)控血清的批內(nèi)和批間變異系數(shù)進(jìn)行成對樣本的t檢驗(yàn)。

1.3.2以酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)為比較方法(X)，磁微粒化學(xué)發(fā)光法(CMIA)為實(shí)驗(yàn)方法(Y)，分別計(jì)算兩種方法測定抗PR3抗體和抗MPO抗體臨床血清的線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)r。

1.3.3使用SPSS18.0軟件對兩種方法測定抗PR3抗體和抗MPO抗體臨床血清的陰陽性符合情況進(jìn)行Kappa分析。

2　結(jié)果

2.1批內(nèi)和批間重復(fù)性選取低、中、高三個不同濃度的質(zhì)控血清，每份血清連續(xù)重復(fù)檢測10次，分別計(jì)算各測定結(jié)果的均值、標(biāo)準(zhǔn)差以及批內(nèi)的變異系數(shù)，結(jié)果：測試抗PR3抗體，使用A方法檢測3份血清標(biāo)本的批內(nèi)變異系數(shù)分別為5.48%、4.22%、3.65%(見表1)；使用B方法檢測批內(nèi)變異系數(shù)分別為8.73%、7.18%、5.67%(見表2)。測試抗MPO抗體，使用A方法檢測3份血清標(biāo)本的批內(nèi)變異系數(shù)分別為5.52%、4.78%、4.29%(見表3)；使用B方法檢測批內(nèi)變異系數(shù)分別為8.50%、6.39%、6.16%(見表4)。同期進(jìn)行抗PR3抗體和抗MPO抗體批間試驗(yàn)，每天1次、連續(xù)測定10 d后，使用A方法測定抗PR3抗體求出三份血清標(biāo)本的批間變異系數(shù)分別為7.87%、6.55%、6.07%(見表1)，使用B方法測試批間變異系數(shù)分別為10.84%、8.54%、7.67%(見表2)，測試抗MPO抗體使用A方法求出三份血清標(biāo)本的批間變異系數(shù)分別為8.19%、7.34%、5.93%(見表3)，使用B方法測試批間變異系數(shù)分別為9.28%、8.32%、6.81%(見表4)。A方法與B方法比較，測定抗PR3抗體、抗MPO抗體批內(nèi)和批間重復(fù)性的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，即認(rèn)為A方法測定結(jié)果的批內(nèi)和批間重復(fù)性優(yōu)于B方法。

2.2準(zhǔn)確度在高、中、低三個不同標(biāo)本中分別加入一定濃度的定標(biāo)液，比較理論值和檢測值，按下列公式計(jì)算回收率：回收率= 檢測值/理論值×100%，A方法回收率在96%～105%之間，平均回收率99.2%，B方法回收率93%～101%，平均回收率97.7%，兩者均符合回收率的要求。

表1　A方法檢測抗PR3抗體質(zhì)控血清結(jié)果(n=10)Tab.1　Anti-PR3 concentration of control serum deter-mined by method A(n=10)

表2　B方法檢測抗PR3抗體質(zhì)控血清結(jié)果(n=10)Tab.2　Anti-PR3 concentration of control serum deter-mined by method B(n=10)

表3　A方法檢測抗MPO抗體質(zhì)控血清結(jié)果(n=10)Tab.3　Anti-MPO concentration of control serum deter-mined by method A(n=10)

表4　B方法試劑盒檢測抗MPO抗體質(zhì)控血清結(jié)果(n=10)Tab.4　Anti-MPO concentration of control serum deter-mined by method B(n=10)

圖1　兩種方法測試抗PR3抗體及抗MPO抗體線性相關(guān)性結(jié)果Fig.1　Linear correlation between two methods testing Anti-PR3 and Anti-MPO

表5　兩種方法測定抗PR3抗體結(jié)果的一致性Tab.5　Consistency of Anti-PR3 tested between two methods

2.3檢測結(jié)果的相關(guān)性分析將兩種方法測定抗PR3抗體(WG患者86例，健康人群50例，共計(jì)136例血清樣本)、抗MPO抗體(MPA患者28例，Churg-Strauss綜合征患者52例，健康人群50例，共計(jì)130例血清樣本)的結(jié)果進(jìn)行線性相關(guān)分析，結(jié)果兩種方法測試抗PR3抗體相關(guān)系數(shù)r=0.987 8,測試抗MPO抗體相關(guān)系數(shù)r=0.989 6，兩種方法測試結(jié)果具有高度的相關(guān)性。見圖1。

2.4檢測結(jié)果的一致性將兩種方法測定抗PR3抗體(136例血清樣本)和抗MPO抗體(130例血清樣本)的測試結(jié)果轉(zhuǎn)化為陰陽性符合情況，進(jìn)行Kappa一致性分析，兩種方法測試結(jié)果顯示出高度一致性，Kappa系數(shù)分別為0.897，0.882，結(jié)果見表5、6 。

表6　兩種方法測定抗MPO抗體結(jié)果的一致性Tab.6　Consistency of Anti-MPO tested between two methods

3　討論

原發(fā)性小血管炎是目前尚未明確病因的一組小血管炎，研究認(rèn)為該類疾病的發(fā)生可能是在某些遺傳背景下由某些環(huán)境因素誘發(fā)的。主要侵犯小動脈、微動脈等，表現(xiàn)為血管壁壞死性炎癥、纖維素樣壞死等病理特征，屬于一類自身免疫疾病[4]，20世紀(jì)80年代后期的大量研究表明，ANCA對原發(fā)性小血管炎的協(xié)助診斷、判斷療效、預(yù)測復(fù)發(fā)等均具有重要意義[5]?？筆R3抗體陽性多見于活動性韋格納氏肉芽腫。抗MPO抗體陽性主要見于特發(fā)性壞死性新月體性腎小球腎炎(NCGN)、顯微鏡下多動脈炎( MPA) 、Churg-Strauss綜合征(CSS) 、結(jié)節(jié)性多動脈炎(PAN) 、系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE) 、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RA) 、干燥綜合征(SS) 、系統(tǒng)性硬化癥(SSc) 等[6]。

經(jīng)典的ANCA檢測方法為間接免疫熒光法，但該方法為定性檢測，操作復(fù)雜且主觀性高，目前臨床采用的其他定性方法還包括免疫印跡法(IB)、斑點(diǎn)雜交法(dotblotting)、流式細(xì)胞法(FCM)等[7]。目前臨床采用的定量方法均為酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)，但也有其局限性：如固/液反應(yīng)接觸面積小，反應(yīng)不徹底，測量結(jié)果變異系數(shù)大，靈敏度較低等[8]。磁微粒化學(xué)發(fā)光法將化學(xué)發(fā)光分析技術(shù)與磁性微粒分離技術(shù)相結(jié)合，在可操作性、準(zhǔn)確度、重復(fù)性、靈敏度和特異性等方面都有了全面提高。

從本實(shí)驗(yàn)結(jié)果來看，針對抗PR3抗體和抗MPO抗體的質(zhì)控血清測試，磁微?；瘜W(xué)發(fā)光法的批內(nèi)、批間重復(fù)性都優(yōu)于酶聯(lián)免疫吸附法，并且準(zhǔn)確度符合要求，說明在保證測量結(jié)果可靠的前提下，磁微?；瘜W(xué)發(fā)光法的可重復(fù)性更好；二者檢測相同臨床標(biāo)本的相關(guān)性分析r>0.9，說明兩種方法的測定結(jié)果相關(guān)性較好；測試結(jié)果統(tǒng)計(jì)陰陽性符合情況，計(jì)算出的kappa系數(shù)分別為0.897、0.882，說明兩種方法的測試結(jié)果具有高度一致性。應(yīng)用全自動化學(xué)發(fā)光免疫分析儀采用磁微粒化學(xué)發(fā)光法檢測抗PR3抗體和抗MPO抗體，儀器自動完成樣品的稀釋、加樣、檢測和結(jié)果的輸出，步驟和方法簡單易行，便于操作，大幅度減少了醫(yī)院檢驗(yàn)科的工作量；由于儀器自動儲存標(biāo)準(zhǔn)曲線，不僅可以實(shí)現(xiàn)批量檢測，同時還可以完成單個樣本隨時上機(jī)測定，避免了酶聯(lián)免疫吸附法不能進(jìn)行單個樣本檢測的不足，極大滿足臨床患者的需求。目前酶聯(lián)免疫吸附法定量測定上述兩種自身抗體，反應(yīng)時間通常為1.5～2 h，而磁微粒化學(xué)發(fā)光法反應(yīng)時間僅需半小時左右，反應(yīng)時間大大縮短，可以更快地給出測定結(jié)果，減少臨床醫(yī)生和患者等待的時間。同時，磁微?；瘜W(xué)發(fā)光法的免疫反應(yīng)在準(zhǔn)液相條件下進(jìn)行、反應(yīng)時間短，可以盡可能地避免固/液反應(yīng)非特異性吸附和非特異性分子的結(jié)合，提高反應(yīng)的特異性和精度。由此可見，磁微?；瘜W(xué)發(fā)光法檢測抗PR3抗體和抗MPO抗體，能夠更好地滿足臨床應(yīng)用的要求，與酶聯(lián)免疫吸附法相比，在ANCA相關(guān)疾病的診斷方面更上一個新的臺階。

[1]Alpa M,Ferrero B,Cavallo R,etal.Anti-GML and anti-sulphatide antibodies in systemic idiophatic vasculitis，systemic lupus erythematosus and mixed cryoglobulinaemia:serum detection and clinical and electro-physiologic correlations [J].G Ital Nefrol,2002,19(6):617-621.

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[收稿2016-01-18修回2016-02-23]

(編輯張曉舟)

Comparison of chemiluminescent microparticle immunoassay and enzyme-linked immunosorbent assay for determination of anti-neutrophil cytoplasm antibodies

ZHANG Li-Juan.Department of Clinical Laboratory,Aviation General Hospital,Beijing 100012,China

Objective:To compare the performance of chemiluminescent microparticle immunoassay(CMIA) and enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA) for the determination of Anti-PR3 and Anti-MPO.Methods: Concentration of Anti-PR3 and Anti-MPO in serum samples from 166 patients with autoimmune diseases and 50 healthy donors were determined by using CMIA(Method A) and ELISA(Method B),respectively.The results from both assays were analyzed and compared by statistical methods.Results: Method A showed better intra-assay reproducibility and inter-assay reproducibility than Method B for the determination of high,medium and low levels of control serum.Both methods met the accuracy requirement.The correlation coefficient of Anti-PR3 and Anti-MPO were 0.987 8 and 0.989 6 for Method A and Method B,respectively.And the Kappa coefficients were 0.897 and 0.882 for Method A and Method B,respectively.Conclusion: The performance of Method A is superior to Method B for the deter-mination of Anti-PR3 and Anti-MPO,which makes Method A to be a potentially better choice for clinical application.

Anti-neutrophil cytoplasm antibodies(ANCA)；Myeloperoxidase(MPO)；proteinase 3(PR3)；Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay；Chemiluminescent Microparticle ImmunoAssay

10.3969/j.issn.1000-484X.2016.08.020

R446.61文獻(xiàn)標(biāo)志碼A

1000-484X(2016)08-1175-04

張立娟(1972年-)，女，副主任檢驗(yàn)師，主要從事免疫學(xué)檢驗(yàn)方面的研究，E-mail：immunitylab361@163.com。