王文君　陸　森　吳士超　繆鳳琴　潘　寧　張建瓊

(東南大學醫(yī)學院，南京210009)

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·免疫學技術(shù)與方法·

定量PCR檢測HLA-C等位基因表達方法的建立和初步應用①

王文君陸森②吳士超繆鳳琴潘寧張建瓊

(東南大學醫(yī)學院，南京210009)

①本文受國家自然基金青年科學基金項目(81201601)資助。

②南京醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院普外科肝臟外科，南京210029。

目的：建立實時定量PCR方法檢測同一個體兩條不同的HLA-C等位基因的表達水平。方法：構(gòu)建HLAⅠ類等位基因外顯子2和3數(shù)據(jù)庫，設計等位基因特異性系列引物，建立等位基因定量PCR方法；在數(shù)據(jù)庫和835例漢族人外周血標本中對方法進行理論和實驗驗證；檢測并比較20對肝癌和癌旁組織標本中HLA-C等位基因的表達水平。結(jié)果：本實驗設計的20對引物能檢測23種雜合基因型中不同的HLA-C等位基因，覆蓋漢族人群中出現(xiàn)頻率大于0.96%的個體；55%(11/20)的肝癌組織中HLA-C位點兩條等位基因表達水平變化不一致。結(jié)論：成功建立了針對漢族人群的HLA-C等位基因表達水平的檢測方法；肝癌組織中普遍存在著兩條HLA-C等位基因表達水平變化不一致的現(xiàn)象。

定量PCR；HLA-C；等位基因特異性；肝癌

經(jīng)典HLA(Human leucocyte antigen，HLA)Ⅰ類分子在免疫學上的主要功能是通過與相應受體結(jié)合調(diào)節(jié)CD8+T細胞、NK細胞等效應細胞的活化，大量研究表明經(jīng)典HLAⅠ類分子表達水平異常是腫瘤細胞、病毒感染細胞的常見免疫逃逸方式，顯著影響著腫瘤免疫、感染免疫以及自身免疫等疾病進程[1,2]。

經(jīng)典HLAⅠ類基因包括HLA-A、-B、-C三個基因座位，在人群中具有高度多態(tài)性，絕大多數(shù)個體的這三個位點為雜合子。經(jīng)典HLAⅠ類基因呈共顯性表達，即來自父母的兩種等位基因產(chǎn)物均表達于有核細胞表面。因此，除了少數(shù)純合個體外，大部分個體的HLA-A、-B、-C位點在細胞表面表達兩種不同的等位基因。然而，以往研究在檢測經(jīng)典HLAⅠ類分子表達水平時，通常對一個位點的兩種不同等位基因產(chǎn)物并不加以區(qū)分，即檢測到的是同一基因座位兩種等位基因疊加的表達水平。

現(xiàn)有研究已明確，不同等位基因編碼的HLA Ⅰ類分子在調(diào)節(jié)免疫效應細胞功能中常常發(fā)揮不同作用。比如，某些等位基因的產(chǎn)物和NK細胞上的受體分子結(jié)合，參與調(diào)節(jié)NK細胞的活化[3]；特定的等位基因產(chǎn)物結(jié)合特定抗原肽，與TCR結(jié)合，在特異性T細胞的活化中發(fā)揮關(guān)鍵作用[4]。而且，針對白血病細胞的研究發(fā)現(xiàn)，不同等位基因編碼的HLAⅠ類分子表達水平變化確實不同[5]。因此，區(qū)分檢測同一基因座位不同等位基因的表達水平，對于理解機體在生理和病理條件下的免疫調(diào)節(jié)機制非常必要。

由于HLAⅠ類等位基因間具有高度多態(tài)性和相似性，目前尚無足夠的抗體可以區(qū)分各等位基因所編碼的蛋白，因此蛋白水平的檢測無法覆蓋絕大多數(shù)個體。實時定量PCR方法敏感性高，且依賴引物序列特異性檢測目標基因?，F(xiàn)有的實時定量PCR方法僅能區(qū)分HLA-A、-B、-C不同基因座位的mRNA表達水平，不能區(qū)分同一基因座位兩條等位基因的mRNA表達水平[6]。因此，需要建立新的實時定量PCR方法，用于檢測絕大多數(shù)個體的HLA等位基因mRNA表達水平。

經(jīng)典HLAⅠ類等位基因數(shù)高達9 000多個，主要集中在外顯子2和3區(qū)域，具有高度多態(tài)性和相似性，為保證僅擴增兩條等位基因中的一條，需要設計高度特異性的系列引物對大多數(shù)個體進行等位基因mRNA表達水平的定量分析。本實驗室已經(jīng)成功建立了HLA-A、-B等位基因mRNA表達水平的定量PCR方法，本實驗旨在建立檢測HLA-C等位基因mRNA表達水平的定量PCR方法，為后續(xù)經(jīng)典HLAⅠ類等位基因mRNA表達水平的研究提供實驗基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1血標本DNA實驗室現(xiàn)存835例中國漢族人群外周血標本DNA，所有標本HLA-C位點經(jīng)過PCR-SBT(聚合酶鏈反應-測序分型方法)高分辨率分型[7-10]。

1.1.2肝癌標本cDNA來自實驗室收取新鮮肝癌及癌旁組織，采用PCR-SBT方法進行HLA-C位點高分辨率分型[7]，隨機選取20例HLA-C位點雜合的組織。Trizol法提取標本總RNA，DNA酶處理去除基因組DNA，加入Oligo(dT)，M-MLV，dNTP，RNAase抑制劑，DEPC水，總共20 μl逆轉(zhuǎn)錄反應體系，獲得CDNA保存于-20℃。

1.1.3主要儀器試劑和引物設計軟件Real-time qPCR儀 (ABI Stepone Plus，Applied Biosystems，美國)； Beacon Designer 8.02定量PCR引物設計軟件；SYBR Green PCR Master Mix (ABI， 美國；Vazyme，中國)；HiScriptTMQ RT SuperMix for qPCR(Vazyme，中國)。

1.2方法

1.2.1構(gòu)建經(jīng)典HLAⅠ類等位基因位點特異性堿基數(shù)據(jù)庫IMGT/HLA數(shù)據(jù)庫收錄了經(jīng)WHO命名委員會確認的全部HLA 基因數(shù)據(jù)，以IMGT/HLA(Release3.19.0)數(shù)據(jù)庫為基礎(chǔ)，構(gòu)建包含HLA-A,-B,-C位點所有等位基因的位點特異性堿基數(shù)據(jù)庫。

1.2.2引物設計根據(jù)構(gòu)建的數(shù)據(jù)庫尋找特異性位點，作為引物3′末端堿基，設計等位基因特異性引物(一般16～24 bp)，然后使用Beacon DesignerTM8.02定量PCR引物設計軟件，設計出另外一條對應引物，參照軟件的評分選擇最佳引物。

1.2.3方法建立和驗證通過比對NCBI/Primer-Blast數(shù)據(jù)庫和HLA數(shù)據(jù)庫中的核酸序列，在理論上驗證所設計引物的特異性。以本實驗室HLA-C已分型的漢族人群為目標樣本，優(yōu)化退火溫度及引物濃度，確定最適PCR反應條件；選取適宜陰性對照從實驗上驗證方法特異性。目標標本擴增曲線典型，溶解曲線為單峰，陰性參照未出現(xiàn)明顯擴增曲線，則視為該引物驗證成功。采用系列稀釋法檢測擴增效率。

1.2.4實時定量PCR反應體系及條件本實驗采用SYBR Green染料法進行Real-time PCR，反應體系20 μl，包括：2×SYBR? Green PCR Master Mix(Vazyme)10 μl，10 μmol/L上下游引物200 nmol/L，cDNA模板1 μl，加雙蒸水補足20 μl。PCR反應條件：95℃ 10 min；95℃ 15 s，退火(各引物最適退火溫度)15 s，72℃30 s，40個循環(huán)。

1.2.5肝癌及癌旁組織定量PCR內(nèi)參引物選擇在檢測肝癌及癌旁標本時，選用TBP和HPRT-1作為內(nèi)參基因，取二者Ct值的幾何平均值作為內(nèi)參基因的Ct值，內(nèi)參引物序列如表1所示。

1.2.6肝癌及癌旁組織定量PCR結(jié)果的數(shù)據(jù)處理方法檢測肝癌及癌旁HLA-C等位基因cDNA水平時，每對等位基因特異性的引物和內(nèi)參引物定量PCR擴增時均作3個復孔，結(jié)果取其平均值。采用相對定量的方法分析數(shù)據(jù)，即2-△△Ct法。其中：△△Ct=△Ct肝癌-△Ct癌旁，△Ct=Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因。

表1　內(nèi)參基因引物序列及產(chǎn)物長度Tab.1　Sequences and product length of reference gene primers

圖1　經(jīng)典HLAⅠ等位基因位點特異性堿基數(shù)據(jù)庫Fig.1　Classical HLA class Ⅰ alleles database

2　結(jié)果

2.1構(gòu)建經(jīng)典HLAⅠ類等位基因位點特異性堿基數(shù)據(jù)庫以IMGT/HLA(Release3.19.0)數(shù)據(jù)庫為基礎(chǔ)，將經(jīng)典HLAⅠ類基因的外顯子2和3的基因序列(共546 bp)，從1到546進行排列，每一個位點可能出現(xiàn)1～4個不同的堿基；列出每個位點上不同堿基對應的所有等位基因以及對應的所有等位基因亞型及數(shù)目(如圖1)，用于后續(xù)引物設計過程中查找和確定特異性的位點。

2.2設計等位基因特異性引物根據(jù)構(gòu)建的經(jīng)典HLAⅠ類等位基因位點特異性堿基數(shù)據(jù)庫，查找具有多態(tài)性的堿基位點，以該位點作為引物3′末端堿基。引物特異性堿基篩選遵循以下標準：①理論上這一位點堿基對應的所有等位基因包括同一血清型的所有亞型，圖1中是外顯子2的第216位點對應的經(jīng)典HLAⅠ類等位基因，灰色陰影標注區(qū)域，216位堿基是G，以該位點作為特異性堿基位點，可擴增C*01、C*04、C*06和C*07，并不混雜其他HLA-C等位基因及HLA-A，-B等位基因(其他位點208位堿基為A)；②上游引物位于外顯子2區(qū)域，下游引物位于外顯子3區(qū)域，跨內(nèi)含子2從而排除基因組DNA的影響，產(chǎn)物長度在80～240 bp之間；③設計的引物GC含量在30%～70%之間，無發(fā)夾二級結(jié)構(gòu)，引物長度保持在16～24 bp之間，且上下游引物Tm值相差不超過3℃，以保證引物擴增效率；④設計的引物滿足通用SYBR Green染料法的要求。

表2　等位基因特異性驗證方法舉例Tab.2　An example of how to verify allelic specificity

根據(jù)選定的特異性3′末端堿基設計一條引物，使用Beacon DesignerTM8.02定量PCR引物設計軟件，設計出另外一條引物。根據(jù)以上標準及軟件評分選擇最佳引物。最終設計完成20對符合以上原則的HLA-C等位基因定量PCR引物。

2.3定量PCR方法的驗證

2.3.1數(shù)據(jù)庫驗證引物特異性本實驗所構(gòu)建的基于HLA-A、-B、-C等位基因數(shù)據(jù)庫已經(jīng)避開三個位點之間的非特異擴增，但仍需檢驗引物與其他基因的互補程度。①通過NCBI/Primer-Blast數(shù)據(jù)庫驗證，檢驗是否能擴增出其他非HLA基因。②非經(jīng)典HLAⅠ類基因與經(jīng)典基因相似度亦非常高，通過IMGT/HLA專業(yè)數(shù)據(jù)庫，驗證所得引物是否能夠擴增HLA-E、-F、-G等非經(jīng)典等位基因。20對引物均在以上兩個數(shù)據(jù)庫完成驗證，未發(fā)現(xiàn)與以上非目的基因匹配。

2.3.2實驗驗證驗證方法的特異性和擴增效率。

2.3.2.1驗證方法的等位基因特異性在已知HLA-C等位基因的835例漢族人群標本中按照出現(xiàn)頻率從高到低依次選取樣本，作為目標樣本。根據(jù)等位基因序列選擇適宜引物，逐一擴增每個目標樣本的兩條等位基因，同時驗證每條等位基因擴增的特異性。表2以其中一份標本為例(C*01:02:01G；C*08:01:01G)說明驗證過程：序列分析顯示引物對C-07僅能擴增C*01:02:01G，而不能擴增C*08:01:01G，因此選取引物對C-07擴增C*01:02:01G。陰性對照選擇一條等位基因為C*08:01:01G，且另一條等位基因亦不能被C-07擴增的標本(C*07:02:01G；C*08:01:01G)。

采用C-07同時擴增目標標本和陰性對照(圖2)，擴增曲線和產(chǎn)物溶解曲線均顯示，目標標本得到擴增，陰性對照未有擴增，證明該反應僅擴增目標標本中的C*01:02:01G，而未擴增其另一條等位基因C*08:01:01G。

采用以上流程，同樣方法擴增目標標本另一等位基因C*08:01:01G，并驗證其特異性。選取20對引物的不同組合，能夠擴增出漢族人群中23種基因型的每條等位基因，且相應陰性參照均無擴增。

2.3.2.2檢測擴增效率將目標標本cDNA系列稀釋，實時定量PCR擴增目標基因并計算擴增效率。本研究所有體系擴增效率在90%～110%之間。

2.4引物序列及應用范圍本實驗最終采用20對HLA-C等位基因定量PCR引物(表3、4)，能夠特異性擴增835例漢族人群中HLA-C基因型頻率大于0.96%個體的所有等位基因(共23種基因型)。表3列出了按照基因型頻率從高到低排列的漢族人群中23種基因型，以及擴增每條等位基因所選取的引物對及其退火溫度。

2.5肝癌及癌旁組織中HLA-C等位基因mRNA水平檢測選取20對HLA-C位點為雜合子的肝癌及癌旁組織cDNA，根據(jù)其等位基因選取適宜的等位基因特異性定量PCR引物，檢測并比較HLA-C等位基因的mRNA表達水平(表5)。

實時定量PCR結(jié)果顯示，所設計等位基因特異性定量PCR引物能特異性區(qū)分不同HLA-C等位基因。在20例肝癌組織中，與癌旁組織相比，肝癌組織中HLA-C等位基因上調(diào)表達17.50%，表達一致47.50%，下調(diào)表達35.0%；同時發(fā)現(xiàn)，在HLA-C位點雜合的個體中，55.0%個體存在著兩條等位基因表達水平變化不一致的現(xiàn)象。

圖2　目標標本和陰性對照的擴增結(jié)果Fig.2　Amplification of target sample and negative control Note: The amplification plot(A) and melt curve (B) of target sample and negative control.

表3　HLA-C等位基因特異性定量PCR引物可區(qū)分漢族人群基因型Tab.3　Allelic primers distinguishing two HLA-C alleles in Han population

表4　HLA-C等位基因特異性定量PCR引物序列Tab.4　Sequences of HLA-C allelic primers

表5　肝癌相比癌旁組織HLA-C等位基因mRNA表達變化Tab.5　mRNA expression level of HLA-C alleles in HCC tissue

3　討論

本實驗設計的HLA-C引物能區(qū)分漢族人群常見等位基因，對于低頻等位基因或雜合子中兩條等位基因不能用以上引物區(qū)分，可以通過相似流程對個別等位基因進行單獨引物設計(如等位基因C*06:53，C*14:03，C*15:04)。本文建立的方法能區(qū)分HLA-C等位基因mRNA水平的表達，但是其局限在于無法反映轉(zhuǎn)錄后加工過程。

以往對于白血病細胞的研究發(fā)現(xiàn)，同一白血病細胞表面的不同等位基因編碼的HLAⅠ類分子，其表達水平變化并不相同：其規(guī)律是作為NK細胞抑制性配體的某些HLA等位基因產(chǎn)物在表面表達水平正常，而其他非抑制性HLA等位基因產(chǎn)物則存在明顯下調(diào)，可能反映了白血病細胞在NK細胞和T細胞雙重免疫監(jiān)視壓力下精細的逃逸方式[5]。在肝癌中，本實驗室以往研究發(fā)現(xiàn)，HLA及其配體基因多態(tài)性影響了肝癌的發(fā)生[7,10]，且其表面HLAⅠ類分子也存在著明顯的異常表達，但從未有研究對其等位基因表達水平進行檢測。本次對20例新鮮肝癌和癌旁組織的檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，同一例肝癌組織HLA-C位點的兩條等位基因表達水平變化存在明顯差異，一方面表明在肝癌中區(qū)分檢測同一基因座位不同等位基因表達水平非常必要，另一方面也為我們進一步研究肝癌細胞精細的免疫逃逸機制奠定了實驗基礎(chǔ)。

本實驗建立了針對漢族人群的HLA-C等位基因特異性定量PCR檢測方法，設計、驗證等位基因定量PCR引物并明確引物實際應用范圍，為經(jīng)典HLAⅠ類基因mRNA表達水平的研究建立實驗方法和提供了技術(shù)基礎(chǔ)，在HLA表達相關(guān)的病毒免疫、腫瘤免疫、自身免疫等領(lǐng)域研究中具有應用價值。

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[收稿2015-12-31修回2016-04-01]

(編輯倪鵬)

A novel real-time quantitative PCR method for analyzing HLA-C allele expression level

WANG Wen-Jun,LU Sen,WU Shi-Chao,MIAO Feng-Qin,PAN Ning,ZHANG Jian-Qiong.Southeast University Medical School,Nanjing 210009,China

Objective:To establish real-time qPCR method to analyze each HLA-C allele expression level of individual.Methods: Database including exon 2 & 3 sequences of HLA class Ⅰ alleles was built,HLA-C allelic specific primers were designed and the real-time quantitative PCR method for analyzing HLA-C allele expression level was built.The allelic specificity of these primers were confirmed in database and 835 normal peripheral blood samples of Han population.The mRNA level of each HLA-C allele from 20 pairs of liver tumor tissues and non-tumor tissues was analyzed by the qPCR method we built.Results: 20 pairs of allelic specific primers were designed to distinguish the two HLA-C alleles of each individual with frequency over 0.96% in 835 cases of Han population.Among 55% of the liver cancer tissues,the expression levels of the two HLA-C alleles from the same tumor tissue changes differently compared to that of the relevant non-tumor tissue.Conclusion: This study provides method for HLA-C allele expression level analysis of Han population and each HLA-C allele expression level is inconsistent of liver cancer tissue.

Real time qPCR;HLA-C;Allelic specific;Liver cancer

10.3969/j.issn.1000-484X.2016.08.018

R392.33文獻標志碼A

1000-484X(2016)08-1165-06

王文君(1989年-)，女，碩士，主要從事腫瘤免疫學方面研究，E-mail：wwj2832@163.com。

及指導教師：潘寧(1976年-)，女，博士，講師，主要從事腫瘤免疫學方面研究，E-mail：panningmicro@aliyun.com。