范中平，胡悅東，黃寶俊

（1.本溪鋼鐵公司總醫(yī)院 普外科，遼寧 本溪 117000；2.中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 眼科，遼寧 沈陽 110001；3.中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 腫瘤外科，遼寧 沈陽 110001）

論著

胃癌中m i c roRN A-218調(diào)控BM I1基因表達(dá)的作用及機(jī)制*

范中平1，胡悅東2，黃寶俊3

（1.本溪鋼鐵公司總醫(yī)院 普外科，遼寧 本溪 117000；2.中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 眼科，遼寧 沈陽 110001；3.中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 腫瘤外科，遼寧 沈陽 110001）

目的探討胃癌中m i c ro R NA-218（m i R-218）調(diào)控B M I1基因表達(dá)的作用及機(jī)制。方法應(yīng)用實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)（r ea l-t i m e P C R）檢測(cè)胃癌及癌旁組織中m i R-218及B M I1基因的表達(dá)。將m i R-218的前體（m i R-218 p r e c ur s or）轉(zhuǎn)染胃癌B GC823細(xì)胞，W e s t e r n blot檢測(cè)B M I1蛋白的表達(dá)。應(yīng)用熒光素酶實(shí)驗(yàn)分析m i R-218是否與B M I1基因3’非翻譯區(qū)（3’-U T R）結(jié)合。結(jié)果R T-P C R結(jié)果顯示，相對(duì)癌旁組織，胃癌組織中m i R-218的表達(dá)下調(diào)顯著，而B M I1在胃癌組織中的表達(dá)則呈現(xiàn)明顯的上調(diào)，m i R-218與B M I1在胃癌及癌旁組織中的表達(dá)均為明顯的負(fù)相關(guān)。在轉(zhuǎn)染m i R-218 p r e c ur s or的胃癌B GC823細(xì)胞中，B M I1的蛋白表達(dá)顯著下調(diào)。熒光素酶實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)m i R-218能夠特異性地結(jié)合B M I1基因的3’-U T R，并與其表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。結(jié)論m i R-218與B M I1基因的表達(dá)異常與胃癌的發(fā)生相關(guān)，B M I1基因是m i R-218的靶基因，m i R-218在胃癌細(xì)胞中能夠靶向沉默B M I1基因。

胃癌；m i c ro R NA-218；B M I1；B GC823細(xì)胞

胃癌是我國最常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病率居各類腫瘤之首［1］。胃癌的治療方法是以手術(shù)為主，結(jié)合放化療的綜合治療，但部分中晚期患者的預(yù)后不良，治療效果欠佳，因此深入探究胃癌發(fā)生、發(fā)展的分子機(jī)制，尋找效果更佳、特異性更好的治療靶點(diǎn)和方法是胃癌相關(guān)研究的重點(diǎn)。M icro R N A（mi R）是一類在多種生物中廣泛存在的小分子非編碼R N A，能夠與靶基因的3’非翻譯區(qū)（3’-U T R）特異性地互補(bǔ)結(jié)合，通過抑制靶基因m R N A的翻譯或者將m R N A剪切降解，發(fā)揮沉默靶基因表達(dá)的作用［2］。mi R通過抑制靶基因的表達(dá)和功能，參與調(diào)節(jié)增殖分化、凋亡和侵襲轉(zhuǎn)移等多種細(xì)胞生物學(xué)行為，并在多種復(fù)雜疾病及腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用［3-4］。本研究通過分子生物學(xué)方法探究mi R-218在胃癌細(xì)胞中調(diào)控B MI1基因表達(dá)的作用及機(jī)制。

1　材料與方法

1.1材料

選取2010年9月-2013年4月在本溪鋼鐵公司總醫(yī)院普外科及中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院腫瘤外科診斷為胃癌的住院患者38例，男性26例，女性12例；年齡46～61歲，中位年齡56.2歲。取患者組織標(biāo)本，包括腫瘤組織及距腫瘤邊緣＞5 cm的癌旁組織。人胃癌B GC823細(xì)胞系由中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院腫瘤外科提供。

1.2試劑

mi R的提取及檢測(cè)相關(guān)試劑、mi R-218前體（mi R-218 prec u rsor）及mi R對(duì)照購自A mbion公司，B MI1基因 3’-U T R的野生型熒光素酶載體p G L3-W t.U T R（W t） 和突變型熒光素酶載體p G L3-M u t.U T R（M u t，于3’-U T R第1470～1477堿基序列引入突變）由上海吉瑪公司構(gòu)建，熒光素酶活性檢測(cè)試劑盒購自I n v itro g en公司，W estern blot檢測(cè)相關(guān)試劑購自上海碧云天公司，轉(zhuǎn)染試劑Transmessen g er購自Q ia g en公司，B MI1小鼠抗人單克隆抗體購自S anta C r uz公司。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)提取待測(cè)組織標(biāo)本中的小非編碼R N A，對(duì)其進(jìn)行3’端加P oly A處理，然后進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。以管家基因U6為內(nèi)參基因，按照實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)（real-time PC R）檢測(cè)試劑盒說明書進(jìn)行操作，擴(kuò)增mi R-218。所得實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)應(yīng)用比較C t值法，即2-ΔΔCt法進(jìn)行結(jié)果分析。

1.3.2細(xì)胞轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)染前24 h，在6孔板中每孔接種5×104個(gè)B GC823細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)。取試劑盒中的Enhanser R試劑，將30 pmol待轉(zhuǎn)染的mi R與其混合，加入Trans M essen g er試劑4μl混勻，再加入無血清培養(yǎng)基至1 000μl混勻。棄去B GC823細(xì)胞的培養(yǎng)基，將上述混合液加入培養(yǎng)孔內(nèi)，孵育2 h，然后轉(zhuǎn)為正常培養(yǎng)基培養(yǎng)。

1.3.3W e s t e r n blot檢測(cè)收獲待測(cè)細(xì)胞，提取蛋白，定量。蛋白樣品經(jīng)S D S-P A G E電泳后，轉(zhuǎn)印至P V D F膜，再經(jīng)封閉液封閉、抗體雜交孵育和發(fā)光成像等操作后得到包含B MI1蛋白條帶，應(yīng)用凝膠成像分析系統(tǒng)對(duì)條帶進(jìn)行定量分析。

1.3.4熒光素酶實(shí)驗(yàn)分別將mi R-218 prec u rsor 或mi R對(duì)照與野生型或突變型重組載體共轉(zhuǎn)染至胃癌B GC823細(xì)胞中。其中A組B GC823細(xì)胞共轉(zhuǎn)染 mi R-218 prec u rsor和野生型重組載體，B組B GC823細(xì)胞共轉(zhuǎn)染mi R對(duì)照和野生型重組載體，C 組B GC823細(xì)胞共轉(zhuǎn)染mi R-218 prec u rsor和突變型重組載體，D組B GC823細(xì)胞共轉(zhuǎn)染mi R對(duì)照和突變型重組載體。轉(zhuǎn)染后的B GC823細(xì)胞，按照雙熒光素酶試劑盒說明書檢測(cè)熒光素酶相對(duì)活性。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用S P SS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，檢驗(yàn)數(shù)據(jù)的正態(tài)性以確定其分布情況，多組比較用單因素方差分析，兩組比較用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1胃癌組織中m i R-218的表達(dá)

應(yīng)用比較C t值法對(duì)R T-PC R的結(jié)果進(jìn)行相對(duì)定量分析，結(jié)果顯示，mi R-218在胃癌組織中的△C t值為（4.72±0.13），而在癌旁組織中的△C t值為（3.54±0.15），△△C t值為1.18。胃癌組織中mi R-218的表達(dá)量是癌旁組織的44.29%，胃癌組織中mi R-218表達(dá)降低（P＜0.01）。

2.2胃癌組織中BM I1的表達(dá)及其與m i R-218表達(dá)的相關(guān)性

相對(duì)定量分析結(jié)果顯示，B MI1在胃癌組織中的△C t值為（2.96±0.15），而在癌旁組織中的△C t值為（3.8±0.16），△△C t值為-0.91。胃癌組織中B MI1的表達(dá)量為癌旁組織的188.03%，胃癌組織中B MI1的表達(dá)增強(qiáng)（P＜0.01）。P earson相關(guān)性分析顯示，B MI1 和mi R-218在胃癌及其癌旁組織中的表達(dá)均表現(xiàn)出明顯的負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為-0.793。

2.3m i R-218 pre c u rsor轉(zhuǎn)染B G C823細(xì)胞后對(duì)BM I1蛋白表達(dá)的影響

各組 W estern blot結(jié)果見圖 1。未轉(zhuǎn)染的B GC823細(xì)胞和轉(zhuǎn)染mi R對(duì)照的B GC823細(xì)胞間，B MI1蛋白的相對(duì)表達(dá)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；而兩組B GC823細(xì)胞比較，轉(zhuǎn)染 mi R-218 prec u rsor的B GC823細(xì)胞中的B MI1蛋白下調(diào)（P＜0.01）。

2.4熒光素酶實(shí)驗(yàn)

圖1　m i R-218 pre c u rsor對(duì)B G C823細(xì)胞中BM I1蛋白表達(dá)的影響

圖2　熒光素酶實(shí)驗(yàn)報(bào)告的基因表達(dá)驗(yàn)證m i R-218 對(duì)BM I1基因的調(diào)控

在熒光素酶實(shí)驗(yàn)中，mi R-218 prec u rsor或mi R對(duì)照與野生型或突變型重組載體被按照不同的組合形式共轉(zhuǎn)染至胃癌B GC823細(xì)胞中。檢測(cè)被轉(zhuǎn)染細(xì)胞的相對(duì)熒光值，結(jié)果顯示，與轉(zhuǎn)染mi R對(duì)照組B GC823細(xì)胞比較，共轉(zhuǎn)染mi R-218 prec u rsor和野生型重組載體的B GC823細(xì)胞的相對(duì)熒光值下降，提示mi R-218能夠與B MI1基因3’-U T R結(jié)合，并抑制熒光素酶的表達(dá)。而共轉(zhuǎn)染mi R-218 prec u rsor和突變型重組載體的B GC823細(xì)胞的相對(duì)熒光值無明顯改變，說明結(jié)合位點(diǎn)序列的改變使其失去與mi R-218結(jié)合的能力。見圖2。

3　討論

多梳基因家族（polycomb g ro u p g enes，P c G）是一組與細(xì)胞周期和增殖相關(guān)的重要基因，包括一系列轉(zhuǎn)錄抑制子，與多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展相關(guān)［5-6］。1991年發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞特異莫洛尼白血病病毒插入位點(diǎn)1（B MI1）基因亦歸屬于P c G基因家族［7］，其在結(jié)直腸癌和胃癌中的表達(dá)顯著下調(diào)，而且其表達(dá)異常與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲轉(zhuǎn)移以及預(yù)后等多項(xiàng)臨床病理指標(biāo)相關(guān)［8-10］。本研究首先對(duì)38例胃癌組織進(jìn)行B MI1基因表達(dá)檢測(cè)，結(jié)果顯示，與癌旁組織相比，胃癌組織中B MI1基因的m R N A表達(dá)增強(qiáng)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與上述報(bào)道相符，B MI1基因在胃癌組織中確實(shí)存在明顯的表達(dá)異常，B MI1基因可能作為癌基因在胃癌的發(fā)生中發(fā)揮重要作用。但是胃癌中B MI1基因表達(dá)下調(diào)的原因及機(jī)制尚不清楚。

為分析胃癌中B MI1基因表達(dá)下調(diào)的原因，明確mi R N A s是否在其中發(fā)揮作用，本研究采用多種生物信息學(xué)軟件進(jìn)行分析預(yù)測(cè)，分析結(jié)果顯示，B MI1基因m R N A的3’-U T R上存在mi R-218的結(jié)合位點(diǎn)，位于3’-U T R第1470～1477堿基序列。為驗(yàn)證上述預(yù)測(cè)結(jié)果，明確mi R-218能夠作為上游調(diào)控基因參與調(diào)節(jié)B MI I1的表達(dá)和功能，本研究將mi R-218 prec u rsor轉(zhuǎn)染胃癌B GC823細(xì)胞以提高mi R-218的表達(dá)水平。后續(xù)的W estern blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染mi R-218 prec u rsor的B GC823細(xì)胞中，B MI1蛋白的表達(dá)下調(diào)，這提示mi R-218能夠參與調(diào)節(jié)B MI1基因的表達(dá)，B MI1基因可能是mi R-218的靶基因。本研究發(fā)現(xiàn)，mi R-218在胃癌組織的表達(dá)下調(diào)，而且在胃癌組織及對(duì)應(yīng)的癌旁組織中B MI1 m R N A與mi R-218的表達(dá)水平均表現(xiàn)出顯著的負(fù)相關(guān)。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步明確筆者對(duì)于mi R-218能夠作為上游調(diào)控基因參與調(diào)節(jié)B MI1表達(dá)的推測(cè)，但調(diào)控機(jī)制如何，mi R-218是否通過與B MI1基因m R N A 的3’-U T R結(jié)合抑制其翻譯，從而下調(diào)B MI1基因的表達(dá)尚不清楚。熒光素酶實(shí)驗(yàn)分析結(jié)果顯示，mi R-218能夠與B MI1基因3’-U T R的野生型載體結(jié)合，抑制熒光素酶的表達(dá)，而突變型載體則不能引起熒光素酶的表達(dá)下降，說明結(jié)合序列的改變使其失去與mi R-218結(jié)合的能力，也證實(shí)mi R-218確實(shí)是與B MI1基因3’-U T R第1470～1477堿基序列特異性結(jié)合的。

綜上所述，B MI1基因是mi R-218的靶基因之一，mi R-218能夠沉默B MI1基因的表達(dá)。mi R-218在胃癌中表達(dá)下調(diào)，失去沉默B MI1基因表達(dá)的作用，使B MI1基因在胃癌中表達(dá)上調(diào)，B MI1基因作為胃癌的一個(gè)癌基因存在。

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（申海菊 編輯）

Effect and mechanism of m icroRNA-218 in regulation of BM I1 gene in gastric cancer*

Zhong-ping Fan1，Yue-dong Hu2，Bao-jun Huang3
（1.Department of General Surgery，the General Hospital of Benxi Iron&Steel Co.，Benxi，Liaoning 117000，China；2.Department of Ophthalmology，3.Department of Oncosurgery，the First Affiliated Hospital of China Medical University，Shenyang，Liaoning 110001，China）

Objective To explore the mechanism of microRNA-218（miR-218）in regulation of BMI1 gene in gastric cancer.M ethods Quantitative real-time PCR was used to detect the expression of miR-218 and BMI1 mRNA in gastric cancer and adjacent tissues.Western blot was used to investigate BMI1 protein level and luciferase assay was used to verify the ability of miR-218 binding to BMI1 after miR-218 precursor transfected into gastric cancer BGC823 cells.Results Quantitative real-time PCR results showed that miR-218 was down-regulated and BMI1 was up-regulated in gastric cancer tissues compared to the adjacent tissues；in both tissues miR-218 and BMI1 expressions were negatively correlated.Western blot and luciferase assay revealed that miR-218 could negatively regulate BMI1 protein expression by binding to the 3'-UTR of BMI1 gene.Conclusions The abnormal expressions of miR-218 and BMI1 are involved in gastric carcinogenesis；and miR-218 could target and silence BMI1 gene expression in gastric cells.

gastric cancer；miR-218；BMI1；BGC823 cell

R 735.2

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2016.15.012

1005-8982（2016）15-0065-04

2015-12-23

國家自然科學(xué)基金（No：81272716）

黃寶俊，E-mail：h u an g bao j u n2014@163.com