黃麗

（安徽省銅陵市立醫(yī)院 檢驗(yàn)科，安徽 銅陵 244000）

萬(wàn)古霉素聯(lián)合阿奇霉素對(duì)形成生物被膜耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的體外抗菌效果分析

黃麗

（安徽省銅陵市立醫(yī)院 檢驗(yàn)科，安徽 銅陵 244000）

目的探討體外萬(wàn)古霉素與阿奇霉素聯(lián)合應(yīng)用對(duì)形成生物被膜的耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（M R SA）的抗菌效果。方法使用頭孢西丁紙片擴(kuò)散法和M R SA膠乳凝集實(shí)驗(yàn)確定M R SA，采用剛果紅培養(yǎng)基判斷生物被膜的形成，通過(guò)肉湯稀釋法將萬(wàn)古霉素和阿奇霉素進(jìn)行棋盤(pán)格聯(lián)合藥敏試驗(yàn)，測(cè)出不同濃度下的抑菌指數(shù)（F I C），據(jù)此判定兩藥聯(lián)用后所呈現(xiàn)出的相關(guān)效應(yīng)。結(jié)果萬(wàn)古霉素和阿奇霉素聯(lián)用組最小抑菌濃度（M I C）明顯低于各單藥組，兩藥聯(lián)用主要表現(xiàn)為相加作用（88.2%）和協(xié)同作用（11.8%），無(wú)無(wú)關(guān)作用和拮抗作用。相加作用時(shí)F I C為0.5～1.0；協(xié)同作用時(shí)F I C≤0.5。結(jié)論萬(wàn)古霉素聯(lián)用阿奇霉素對(duì)生物被膜形成的M R SA具有明顯的體外抑菌效果，可以指導(dǎo)臨床有效地降低藥物使用劑量，減少毒副作用。

耐甲氧西林金黃色葡萄球菌；棋盤(pán)格稀釋法；生物被膜；萬(wàn)古霉素/阿奇霉素

耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（M RS A）已成為臨床感染的主要病原菌，對(duì)大多數(shù)抗菌藥物耐藥。生物被膜（B F）的形成也是導(dǎo)致金黃色葡萄球菌多重耐藥的主要原因之一［1］。萬(wàn)古霉素是治療M RS A的首選藥物，目前該藥物的使用濃度已經(jīng)呈現(xiàn)高度飄移的現(xiàn)象。聯(lián)合使用現(xiàn)有的抗菌藥物治療臨床多重耐藥的細(xì)菌感染，能夠有效地降低藥物使用劑量、延緩細(xì)菌的耐藥性。國(guó)內(nèi)已有阿奇霉素對(duì)細(xì)菌生物被膜的抑制干擾作用的報(bào)道，但聯(lián)合萬(wàn)古霉素用于生物被膜形成的革蘭陽(yáng)性球菌的報(bào)道較少見(jiàn)。本研究將萬(wàn)古霉素與阿奇霉素在不同濃度下聯(lián)合使用，觀察所表現(xiàn)出的體外相關(guān)效應(yīng)，為臨床上有效治療生物被膜形成的M RS A感染提供科學(xué)用藥的依據(jù)。

1　資料與方法

1.1菌株

選取2014年7月～2015年6月于銅陵市立醫(yī)院臨床分離的17株生物被膜形成的M RS A，無(wú)重復(fù)菌株。質(zhì)控菌株金黃色葡萄球菌（A T CC25923，A T C C29213），表皮葡萄球菌A T CC12228均購(gòu)自衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心。

1.2儀器與試劑

M icro S can 40全自動(dòng)微生物鑒定儀，M-H瓊脂、陽(yáng)離子調(diào)整的M-H肉湯為英國(guó)O X O I D產(chǎn)品，M RS A膠乳凝集試劑購(gòu)自梅里埃公司，藥敏紙片萬(wàn)古霉素（V A N）、阿奇霉素（A Z M）、頭孢西?。‵ O X）均為英國(guó)O X O I D產(chǎn)品，剛果紅培養(yǎng)基為上海遠(yuǎn)慕生物公司產(chǎn)品，棋盤(pán)格稀釋法使用的阿奇霉素和鹽酸去甲萬(wàn)古霉素分別購(gòu)自浙江亞太制藥公司和美國(guó)禮來(lái)公司。

1.3方法

1.3.1M R SA的檢出①頭孢西丁紙片法（C LS I）。以K-B紙片法進(jìn)行篩選，金黃色葡萄球菌A T CC25923（敏感株）、A T CC29213（耐藥株）作為質(zhì)控菌株，按照C LS I 2015版標(biāo)準(zhǔn)判讀抑菌圈結(jié)果：頭孢西丁抑菌圈≤21mm（M RS A），抑菌圈≥22mm（M SS A）。②乳膠凝集試驗(yàn)。嚴(yán)格按照試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行P B P2a提取。在2個(gè)試劑反應(yīng)圈內(nèi)分別加入含抗P B P2a單克隆抗體致敏的測(cè)試膠乳試劑1滴和陰性質(zhì)控膠乳1滴，然后各滴加提取的上清液50μl，均勻地涂布整個(gè)反應(yīng)圈，搖動(dòng)反應(yīng)3min后觀察凝集現(xiàn)象。判斷結(jié)果：測(cè)試乳膠反應(yīng)圈內(nèi)產(chǎn)生肉眼可見(jiàn)的凝集為P B P2a陽(yáng)性（M RS A）；反應(yīng)圈內(nèi)勻質(zhì)分布，均無(wú)凝集為P B P2a陰性（M SS A）。

1.3.2生物被膜形成株的檢出采用剛果紅培養(yǎng)基法篩選生物被膜菌株［2］，染液剛果紅可以與形成生物被膜的黏液膜、胞外多糖如黏附素（PI A）等因子發(fā)生產(chǎn)色反應(yīng)［3］。將確定為M RS A的菌株接種于剛果紅培養(yǎng)基，35℃、48 h后判斷結(jié)果。以金黃色葡萄球菌A T CC29213產(chǎn)生的菌落形態(tài)為標(biāo)準(zhǔn)［4］，菌落為黑色或有干燥結(jié)晶并且周?chē)囵B(yǎng)基顏色淡化者判定為生物被膜形成陽(yáng)性菌株，不變色者為生物被膜形成陰性。設(shè)表皮葡萄球菌A T CC12228為陰性對(duì)照組。

1.3.3棋盤(pán)格稀釋法聯(lián)合藥敏試驗(yàn)①菌液制備。選取血平板純培養(yǎng)的新鮮菌落4、5個(gè)，M-H肉湯增菌6 h后，配制成0.5麥?zhǔn)蠁挝坏木鷳乙?，并用肉湯稀釋?×105C F U/ml的菌液備用；②藥物母液的配制。分別用無(wú)水乙醇和蒸餾水將阿奇霉素、萬(wàn)古霉素配制成濃度為1 280μg/ml的母液，置入4℃冰箱保存?zhèn)溆茫虎蹤z測(cè)時(shí)，先用M-H肉湯倍比稀釋備用的藥物母液，使母液的濃度遞減，依次為128、64、32、16、8、4、2、1、0.500、0.250、0.125和0.0625μg/ml。先檢測(cè)萬(wàn)古霉素和阿奇霉素的單用最小抑菌濃度（minimal inhibitory concentrations，MIC），然后確定各藥物2倍的MIC為該藥物的最高濃度［5］，將選擇好的6個(gè)稀釋度依次對(duì)倍稀釋。操作時(shí)，采取兩兩組合，將含有2種抗菌藥物不同濃度的混合液1ml分別加入36個(gè)試管中，各管加50μl，35℃溫育24 h后觀察結(jié)果。通過(guò)公式計(jì)算抑菌指數(shù)（F IC），依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)判斷萬(wàn)古霉素和阿奇霉素二者間的相關(guān)作用。

F IC計(jì)算與判斷標(biāo)準(zhǔn)：

判斷標(biāo)準(zhǔn)：協(xié)同作用F IC≤0.5；相加作用0.5＜F IC≤1；無(wú)關(guān)作用1＜F IC≤2；拮抗作用F IC＞2。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用S P SS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩組間數(shù)據(jù)比較用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1聯(lián)合藥敏結(jié)果

17株生物被膜形成的M RS A，萬(wàn)古霉素及阿奇霉素聯(lián)合使用時(shí)的MIC比單獨(dú)用藥時(shí)降低，兩藥物之間相加作用為88.2%（0.5＜F IC≤1），協(xié)同作用為11.8%（F IC≤0.5），確定無(wú)無(wú)關(guān)作用和拮抗作用。見(jiàn)表1。

2.2萬(wàn)古霉素與阿奇霉素單、聯(lián)用結(jié)果

萬(wàn)古霉素與阿奇霉素單用及聯(lián)用的組間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），萬(wàn)古霉素聯(lián)用后MIC由單用時(shí)的1.21m g/L降至0.38m g/L，阿奇霉素聯(lián)用后MIC由單用時(shí)的60.24m g/L降至18.94m g/L，提示萬(wàn)古霉素與阿奇霉素聯(lián)合使用時(shí)，對(duì)形成生物被膜的M RS A有較好的體外抗菌效果。見(jiàn)表2。

表1　萬(wàn)古霉素與阿奇霉素單、聯(lián)用的M I C比較（m g/L）

表2　萬(wàn)古霉素與阿奇霉素單、聯(lián)用M I C比較（m g/L，）

表2　萬(wàn)古霉素與阿奇霉素單、聯(lián)用M I C比較（m g/L，）

組別阿奇霉素單用　1 . 2 1 ± 0 . 5 4 　6 0 . 2 4 ± 3 5 . 7 9聯(lián)用　0 . 3 8 ± 0 . 3 2 　1 8 . 9 4 ± 1 5 . 0 6 t值　8 . 5 0 　5 . 4 3 P值　0 . 0 0 1 　0 . 0 0 1萬(wàn)古霉素

3　討論

M RS A的耐藥機(jī)制主要是由mec A基因介導(dǎo)表達(dá)為青霉素蛋白P B P2a，表現(xiàn)為低親和力，與β-內(nèi)酰胺類(lèi)藥物很少或不與之結(jié)合，故表現(xiàn)為耐藥。近年來(lái)還發(fā)現(xiàn)，mec A基因與輔助基因及表控基因的共同作用，明顯提高了M RS A對(duì)β-內(nèi)酰胺類(lèi)藥物的耐藥性［6］，并且表現(xiàn)出多重耐藥。

另外，對(duì)M RS A進(jìn)行分子生物學(xué)觀察，證實(shí)M RS A的另一個(gè)重要特性是形成生物被膜。生物被膜是細(xì)菌的自我保護(hù)形式，由多聚復(fù)合物包裹菌體形成，天然的被膜屏障和膜內(nèi)的特殊微環(huán)境阻礙或延緩抗生素進(jìn)入菌體，從而提高細(xì)菌的自身耐藥性和免疫逃避性［7］。由生物被膜細(xì)菌導(dǎo)致的持續(xù)性和反復(fù)性的嚴(yán)重感染已被公認(rèn)為是抗感染的最為棘手的難題［8］。

萬(wàn)古霉素是糖肽類(lèi)抗菌藥物的代表藥物，早已成為全世界治療M RS A引起的重癥感染的首選抗菌藥物［9］。如何合理地使用萬(wàn)古霉素，并聯(lián)合其他抗菌藥物以應(yīng)對(duì)由于萬(wàn)古霉素MIC值的爬升所導(dǎo)致M RS A菌株對(duì)萬(wàn)古霉素的敏感性下降［10］，最大限度地降低萬(wàn)古霉素臨床使用中嚴(yán)重的毒副作用成為新的研究熱點(diǎn)。

大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)藥物因具有調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能和良好的抗生物被膜特性而被廣泛用于臨床重癥感染的治療。已有研究表明，阿奇霉素能夠有效地抑制金黃色葡萄球菌生物被膜的形成，并且對(duì)已形成生物被膜的金黃色葡萄球菌具有較好的抗菌活性和抗毒素作用［4］。群體信號(hào)感應(yīng)系統(tǒng)（Q S）調(diào)控細(xì)菌生物被膜形成，而且還參與細(xì)菌毒力因子釋放的調(diào)控［11］。阿奇霉素在一定程度上抑制Q S調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)，導(dǎo)致藻酸鹽的合成減少，抑制細(xì)菌的早期粘附，抑制生物被膜的形成、成熟、甚至破壞已形成的生物被膜。因此，萬(wàn)古霉素和阿奇霉素聯(lián)合使用治療M RS A引起的生物被膜細(xì)菌感染，具有重要的理論意義。

本研究通過(guò)體外萬(wàn)古霉素與阿奇霉素聯(lián)合藥物敏感試驗(yàn)，根據(jù)兩藥物之間的相關(guān)作用來(lái)判斷對(duì)生物被膜形成的M RS A是否具有較好的抗菌活性。試驗(yàn)所涉及的17株生物被膜形成的M RS A樣本，是經(jīng)過(guò)頭孢西丁紙片法和乳膠凝集法同時(shí)鑒定確證。運(yùn)用棋盤(pán)格稀釋法檢測(cè)萬(wàn)古霉素和阿奇霉素聯(lián)合藥敏時(shí)的MIC。棋盤(pán)格法聯(lián)合藥敏操作簡(jiǎn)單易行，重復(fù)性較好，但工作量大，不適用于臨床實(shí)際工作中大批量的標(biāo)本檢測(cè)。試驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示，兩藥聯(lián)合時(shí)相加作用占88.2%，協(xié)同作用占11.8%，確定無(wú)無(wú)關(guān)作用和拮抗作用。萬(wàn)古霉素聯(lián)用后MIC由單用時(shí)的1.21m g/L降至0.38m g/L，阿奇霉素聯(lián)用后MIC由單用時(shí)的60.24m g/L降至18.94m g/L，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示萬(wàn)古霉素與阿奇霉素聯(lián)合使用時(shí)，對(duì)形成生物被膜的M RS A有較好的體外抗菌效果，臨床上可以考慮適當(dāng)降低兩藥物的治療濃度。綜合分析，在兩藥聯(lián)用過(guò)程中，阿奇霉素抑制M RS A菌的多糖合成，降低細(xì)菌間的黏附，破壞已形成的生物被膜，提高進(jìn)入細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)的通透性，萬(wàn)古霉素進(jìn)入菌體后破壞細(xì)胞壁，抑制細(xì)菌蛋白質(zhì)的合成，從而達(dá)到聯(lián)合殺菌作用。

在實(shí)際工作中，還需要進(jìn)行更多的具有科學(xué)性和安全性的試驗(yàn)，研究體外藥物的抗菌活性與臨床聯(lián)合用藥的相關(guān)性，擴(kuò)大抗菌譜，減小藥物的使用劑量以減少毒副作用，預(yù)防和延緩細(xì)菌耐藥性的發(fā)生。

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（申海菊 編輯）

In vitro antim icrobial effect of Vancom ycin combined w ith Azithrom ycin on M ethicillin-resistant Staphylococci aureus w ith biofilm

Li Huang
（Clinical Laboratory，Tongling Municipal Hospital，Tongling，Anhui 244000，China）

ObjectiveToexploretheinvitroantimicrobial effect of Vancomycincombinedwith Azithromycin on Methicillin-resistant Staphylococci aureus（MRSA）with biofilm.M ethods MRSA were detected using Cefoxitin disk diffusion method and MRSA latex agglutination test.Biofilm was detected using Congo red medium.Fractional inhibitory concentration（FIC）of Vancomycin combined with Azithromycin was detected by broth dilution checkerboard joint susceptibility testing，which could show the related effects.Results The minimal inhibitory concentration（MIC）of Vancomycin combined with Azithromycin was significantly lower than that of each drug alone；the combined medication showed additive effect（88.2%）and synergistic effect （11.8%），but no irrelevant or antagonism effect.Additive effect was decided when FIC value was 0.5-1.0. Synergistic effect was decided when FICvalue was≤ 0.5.Conclusions The in vitro inhibitory effect of Azithromycin combined with Vancomycin against MRSA with biofilm is obvious，which can effectively reduce the clinical doses and the side effects of the drugs.

MRSA；biofilm；checkerboard dilution method；Vancomycin；Azithromycin

R 378.11

B

10.3969/j.issn.1005-8982.2016.15.023

1005-8982（2016）15-0119-04

2016-02-24