李穎　黎立　李俊玲　劉效敏　岳龍濤　張俊忠　王世立

【摘要】　目的　探究骨折早期力學(xué)環(huán)境對(duì)骨折端間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)募集的影響。方法　建立大鼠股骨骨折模型，以不同剛度系數(shù)的外固定架予以固定，分為對(duì)照組(超高剛度外固定架組)、高剛度外固定架組和低剛度外固定架組。術(shù)后當(dāng)天和2周攝X線片，觀察骨痂及骨折愈合情況。術(shù)后2、4、6、10 d取骨折端組織，分離有核細(xì)胞，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CD29+CD90+ 細(xì)胞占有核細(xì)胞比例。計(jì)算骨折端MSC絕對(duì)數(shù)量。結(jié)果　X線檢查顯示，術(shù)后2周高剛度外固定架組骨痂量明顯少于低剛度外固定架組。術(shù)后2、4、6、10 d各組CD29+CD90+細(xì)胞數(shù)量逐漸減少(P<0.05)；術(shù)后2、4、6、10 d低剛度外固定架組CD29+CD90+細(xì)胞數(shù)量大于高剛度外固定架組(P<0.05)，且低、高剛度外固定架組CD29+CD90+細(xì)胞數(shù)量均大于對(duì)照組(P<0.05)。結(jié)論　力學(xué)環(huán)境會(huì)影響骨折區(qū)MSC募集，微動(dòng)可促進(jìn)骨折愈合。

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·實(shí)驗(yàn)研究·

力學(xué)環(huán)境對(duì)骨折早期骨折端間充質(zhì)干細(xì)胞募集的影響

李穎黎立李俊玲劉效敏岳龍濤張俊忠王世立

【摘要】目的探究骨折早期力學(xué)環(huán)境對(duì)骨折端間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)募集的影響。方法建立大鼠股骨骨折模型，以不同剛度系數(shù)的外固定架予以固定，分為對(duì)照組(超高剛度外固定架組)、高剛度外固定架組和低剛度外固定架組。術(shù)后當(dāng)天和2周攝X線片，觀察骨痂及骨折愈合情況。術(shù)后2、4、6、10 d取骨折端組織，分離有核細(xì)胞，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CD29+CD90+ 細(xì)胞占有核細(xì)胞比例。計(jì)算骨折端MSC絕對(duì)數(shù)量。結(jié)果X線檢查顯示，術(shù)后2周高剛度外固定架組骨痂量明顯少于低剛度外固定架組。術(shù)后2、4、6、10 d各組CD29+CD90+細(xì)胞數(shù)量逐漸減少(P<0.05)；術(shù)后2、4、6、10 d低剛度外固定架組CD29+CD90+細(xì)胞數(shù)量大于高剛度外固定架組(P<0.05)，且低、高剛度外固定架組CD29+CD90+細(xì)胞數(shù)量均大于對(duì)照組(P<0.05)。結(jié)論力學(xué)環(huán)境會(huì)影響骨折區(qū)MSC募集，微動(dòng)可促進(jìn)骨折愈合。

力學(xué)環(huán)境；骨折愈合；干細(xì)胞；募集

骨折愈合主要生物學(xué)演變過(guò)程包括炎癥階段、軟骨形成階段及骨修復(fù)階段。骨折愈合影響因素眾多，其中骨折區(qū)力學(xué)環(huán)境是重要因素。研究[1]報(bào)道，適度固定骨折可誘發(fā)骨折端細(xì)微運(yùn)動(dòng)，刺激骨痂生長(zhǎng)，從而加速骨折愈合過(guò)程。但目前對(duì)于力學(xué)環(huán)境影響骨折愈合過(guò)程的細(xì)胞生物學(xué)和分子生物學(xué)機(jī)制仍不甚清楚。有研究[2-4]顯示，力學(xué)環(huán)境對(duì)骨折愈合的影響與骨形態(tài)發(fā)生蛋白、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子等分泌有關(guān)。我們?cè)谂R床治療中發(fā)現(xiàn)，骨折完全固定并不能加速骨折痊愈，而適當(dāng)給予一定的活動(dòng)量卻可加速骨折愈合及肢體功能恢復(fù)[5]。因此，研究骨折端力學(xué)環(huán)境對(duì)骨折愈合過(guò)程的影響，對(duì)于探討骨折愈合機(jī)制，進(jìn)而指導(dǎo)臨床骨折治療具有重要意義。

間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)為來(lái)源于中胚層、具有多向分化潛能的成體干細(xì)胞，能向成骨細(xì)胞、成軟骨細(xì)胞等方向分化。骨折損傷部位MSC募集在骨修復(fù)過(guò)程中發(fā)揮重要作用，骨折端募集足夠數(shù)量的MSC是骨折愈合的前提條件和細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)[6]。但不同力學(xué)環(huán)境是否對(duì)骨折端MSC募集有影響，尚未見(jiàn)報(bào)道。骨折早期是力學(xué)刺激促進(jìn)骨折愈合最有效的時(shí)期[7]，本實(shí)驗(yàn)以股骨骨折大鼠為模型，用不同剛度系數(shù)的外固定架予以固定，以給予骨折端不同的力學(xué)環(huán)境，觀察骨折愈合早期不同力學(xué)環(huán)境對(duì)骨折端MSC募集的影響。

1　 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及材料

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：雄性SD大鼠，體重280～300 g，SPF級(jí)，購(gòu)自山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司。

主要試劑與器材：Ficoll分離液(美國(guó)GE醫(yī)療公司)，Dulbecco改良的Eagle培養(yǎng)基(DMEM，美國(guó)Gibco公司)，胎牛血清(杭州四季青公司)，兔抗大鼠單克隆抗體CD29-FITC、CD90-PE(美國(guó)Abcam公司)，熒光70 μm細(xì)胞濾器(美國(guó)Corning公司)。

實(shí)驗(yàn)儀器：顯微鏡(日本Nikon公司)，臺(tái)式離心機(jī)(飛鴿TDL-40B)，生物力學(xué)測(cè)試機(jī)(MTS-858 Mini Bionix)，流式細(xì)胞儀(BD FACS Aria Ⅱ)。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1制備實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型

將體重280～300 g的雄性SD大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組(超高剛度外固定架組)、高剛度外固定架組、低剛度外固定架組。外固定架的剛度系數(shù)不同，其對(duì)骨折區(qū)施加的力學(xué)環(huán)境也不同。手術(shù)過(guò)程：腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉大鼠(30 mg/kg)，將其腹面朝下固定于手術(shù)臺(tái)，右側(cè)大腿外側(cè)剃毛、碘伏消毒，常規(guī)消毒鋪巾，切開(kāi)右側(cè)大腿處皮膚、皮下組織及深筋膜，從淺層股肌與股二頭肌之間的外側(cè)肌間隙鈍性分離進(jìn)入并暴露股骨干。各組分別用超高、高、低剛度外固定架固定股骨。外固定架(圖1)均由4枚鋼針和固定鋼針的橫梁組成，長(zhǎng)、寬、高分別為20、5.5、6 mm，相鄰鋼針之間的距離為5 mm，超高、高、低剛度外固定架固定鋼針直徑分別為1.2、1.0、0.5 mm，外固定架橫梁材料為高分子聚乙烯醫(yī)用材料。固定完成后用小鋼鋸、剪刀制作1 mm的骨缺損作為骨折區(qū)?？p合肌肉、皮膚，完成后使大鼠自由活動(dòng)。術(shù)后3 d內(nèi)肌肉注射頭孢唑啉鈉(30 mg/kg)以防細(xì)菌感染，鋼釘處常規(guī)消毒。實(shí)驗(yàn)中所有大鼠均為右側(cè)股骨單側(cè)造模。

圖1　外固定架固定大鼠股骨骨折模型示意圖

對(duì)經(jīng)外固定架固定的股骨進(jìn)行生物力學(xué)測(cè)試，超高、高、低剛度外固定架剛度系數(shù)分別為60.6、18.2、8.5 N/mm(剛度系數(shù)為斷端活動(dòng)1 mm所需力的大小)。

1.2.2影像學(xué)觀察骨折愈合情況

術(shù)后當(dāng)天、2周分別對(duì)高、低剛度外固定架組攝X線片，觀察2周后高、低剛度外固定架固定下股骨骨折愈合情況。

1.2.3骨折區(qū)有核細(xì)胞計(jì)數(shù)與分析

各組大鼠均分別在術(shù)后2、4、6、10 d腹腔注射致死劑量的戊巴比妥鈉(60 mg/kg)處死大鼠。用手術(shù)剪和手術(shù)刀分離損傷部位皮膚與肌肉，去除外固定架，用髓核鉗將骨折端組織取出，取材部位為中間2根鋼釘之間的斷端組織，稱取200 mg斷端組織置于有DMEM培養(yǎng)基的無(wú)菌培養(yǎng)皿，并剪碎混勻，經(jīng)70 μm細(xì)胞濾器倒入50 mL離心管，收集離心管中的細(xì)胞懸液。采用密度梯度離心法將細(xì)胞懸液按1∶1加至Ficoll有核細(xì)胞分離液上層，1800 rpm/min離心35 min，吸取中間層云霧狀細(xì)胞層。磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌1次，并進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。

以PBS為空白對(duì)照，將收集的細(xì)胞PBS洗滌1次，加入單克隆抗體CD90-FITC、CD29-PE[8]，工作濃度為1∶10，4 ℃，避光，孵育20 min，PBS洗滌2次。經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD29+CD90+細(xì)胞占有核細(xì)胞比例。

根據(jù)以上結(jié)果，計(jì)算MSC絕對(duì)數(shù)量，公式為：MSC絕對(duì)數(shù)量=骨折區(qū)有核細(xì)胞數(shù)量×CD29+CD90+細(xì)胞占有核細(xì)胞比例。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2　結(jié)果

2.1動(dòng)物建模情況

實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組、高剛度外固定架組、低剛度外固定架組，共造模51只，3只麻醉過(guò)深死亡，無(wú)感染發(fā)生，每組各16只。術(shù)后1～2 h大鼠自然蘇醒，蜷縮患肢活動(dòng)，術(shù)后1 d患肢站立，術(shù)后2 d骨折區(qū)形成血腫，尚未有軟骨生成，術(shù)后4 d血腫明顯減少，術(shù)后6 d出現(xiàn)少量軟骨，術(shù)后10 d生成軟骨較之前增多，出現(xiàn)部分?jǐn)喽塑浌沁B接，尚未有骨性連接發(fā)生，且低剛度外固定架組軟骨數(shù)量明顯多于高剛度外固定架組，而高剛度外固定架組軟骨數(shù)量多于對(duì)照組。

2.2影像學(xué)結(jié)果

術(shù)后當(dāng)天和2周對(duì)高、低剛度外固定架組攝X線片(圖2)。術(shù)后2周低剛度外固定架組骨痂量明顯多于高剛度外固定架組，表明低剛度外固定架組骨折愈合速度較快，微動(dòng)可促進(jìn)骨痂形成，加速骨折愈合。

圖2術(shù)后當(dāng)日和2周高、低剛度外固定架組X線片a. 術(shù)后當(dāng)天高剛度外固定架組X線片b. 術(shù)后2周高剛度外固定架組X線片c. 術(shù)后當(dāng)天低剛度外固定架組X線片 d. 術(shù)后2周低剛度外固定架組X線片

2.3有核細(xì)胞計(jì)數(shù)

隨著骨折愈合時(shí)間的延長(zhǎng)，各組骨折端分離得到的有核細(xì)胞數(shù)均減少。術(shù)后2、4、6、8 d低剛度外固定架組骨折端有核細(xì)胞數(shù)量多于高剛度外固定架組，高剛度外固定架組骨折端有核細(xì)胞數(shù)量多于對(duì)照組(表1)。

表1　術(shù)后骨折端有核細(xì)胞計(jì)數(shù)(×105)()

*表示與對(duì)照組相比，P<0.05；**表示與對(duì)照組相比，P<0.01；#表示與高剛度外固定架組相比，P<0.05；##表示與高剛度外固定架組相比，P<0.01

2.4MSC檢測(cè)結(jié)果

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CD29+CD90+細(xì)胞占有核細(xì)胞比例，結(jié)果對(duì)照組術(shù)后2 d CD29+CD90+細(xì)胞占有核細(xì)胞比例為7.1%，術(shù)后10 d為0.9%，高剛度外固定架組術(shù)后2 d CD29+CD90+細(xì)胞占有核細(xì)胞比例為8.3%，術(shù)后10 d為2.7%，低剛度外固定架組術(shù)后2 d CD29+CD90+細(xì)胞占有核細(xì)胞比例為9.8%，術(shù)后10 d為4.0%(圖3)。隨著骨折愈合時(shí)間的延長(zhǎng)，各組CD29+CD90+細(xì)胞占有核細(xì)胞比例均減少；術(shù)后2、4、6、10 d低剛度外固定架組CD29+CD90+細(xì)胞占有核細(xì)胞比例大于高剛度外固定架組(P<0.05)，而高剛度外固定架組CD29+CD90+細(xì)胞占有核細(xì)胞比例大于對(duì)照組(P<0.05)。

2.5MSC絕對(duì)數(shù)量

根據(jù)骨折端有核細(xì)胞數(shù)量及MSC占有核細(xì)胞比例計(jì)算出骨折端MSC絕對(duì)數(shù)量，結(jié)果如圖4所示。術(shù)后2、4、6、10 d高、低剛度外固定架組MSC絕對(duì)數(shù)量均顯著高于對(duì)照組；術(shù)后2、4、6、10 d低剛度外固定架組MSC絕對(duì)數(shù)量均高于高剛度外固定架組。

3　討論

骨折愈合是復(fù)雜的病理生理過(guò)程，涉及多種細(xì)胞及細(xì)胞因子共同作用，影響骨折愈合的因素也是多方面的，其中骨折區(qū)力學(xué)環(huán)境是重要因素。骨折端恰當(dāng)?shù)妮p微運(yùn)動(dòng)可促進(jìn)骨痂形成與鈣化，加速骨折愈合[9]。但目前對(duì)于輕微運(yùn)動(dòng)促進(jìn)骨痂的作用機(jī)制仍不清楚。

圖3　流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CD29+CD90+細(xì)胞占有核細(xì)胞比例

圖4　MSC絕對(duì)數(shù)量

*表示與對(duì)照組相比，P<0.05;**表示與對(duì)照組相比，P<0.01;#表示與高剛度外固定架組相比，P<0.05;##表示與高剛度外固定架組相比，P<0.01

誘發(fā)微動(dòng)主要有主動(dòng)方式和被動(dòng)方式。主動(dòng)方式是通過(guò)肢體負(fù)重作用于內(nèi)、外固定物而產(chǎn)生微動(dòng)[10-11]。被動(dòng)方式是通過(guò)外在施加載荷產(chǎn)生骨折端微動(dòng)[12]。主動(dòng)方式的優(yōu)勢(shì)在于能更真實(shí)地模擬體內(nèi)力學(xué)環(huán)境。本實(shí)驗(yàn)采用主動(dòng)方式，使用不同剛度系數(shù)的外固定架固定大鼠骨折處，繼而通過(guò)肢體負(fù)重產(chǎn)生不同程度的微動(dòng)。

對(duì)于微動(dòng)促進(jìn)骨折愈合的細(xì)胞及分子生物學(xué)機(jī)制，目前尚無(wú)確切結(jié)論。參與骨生成的細(xì)胞和分子較為廣泛[13]，包括基質(zhì)細(xì)胞系統(tǒng)來(lái)源的成骨細(xì)胞、MSC、內(nèi)皮細(xì)胞、網(wǎng)狀細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和造血系統(tǒng)來(lái)源的單核細(xì)胞、破骨細(xì)胞，相關(guān)分子包括骨形態(tài)發(fā)生蛋白、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子等。對(duì)于這些相關(guān)細(xì)胞及細(xì)胞因子在微動(dòng)促進(jìn)骨折愈合中的作用，目前有以下觀點(diǎn)：微動(dòng)造成二次創(chuàng)傷，延長(zhǎng)了骨折修復(fù)炎癥期，促進(jìn)局部血供增加；骨細(xì)胞可以感受機(jī)械應(yīng)力的刺激，增加骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞等代謝活性，促進(jìn)骨形成；微動(dòng)可以提高骨形態(tài)發(fā)生蛋白[2]、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子[3]、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子[4]的表達(dá)水平，從而促進(jìn)骨修復(fù)。而MSC在骨折愈合過(guò)程中起重要作用逐漸被廣泛認(rèn)可，但力學(xué)環(huán)境對(duì)骨折愈合的影響與MSC是否有關(guān)，尚無(wú)相關(guān)理論依據(jù)。

本實(shí)驗(yàn)中影像學(xué)檢查顯示，低剛度外固定架組骨痂量較高剛度外固定架組多，證明微動(dòng)可加速骨折愈合。而骨折端MSC數(shù)量檢測(cè)結(jié)果表明，骨折愈合早期若給予骨折區(qū)活動(dòng)系數(shù)較大的固定，骨折端遷移進(jìn)入的MSC數(shù)量相應(yīng)增加?？梢?jiàn)，骨折端力學(xué)環(huán)境可影響骨折端MSC的募集，進(jìn)一步影響骨折愈合。

骨折損傷部位的MSC來(lái)自于周圍組織和血循環(huán)中[14]，當(dāng)骨骼受損時(shí)，一系列特殊分子在受損部位釋放并進(jìn)入血循環(huán)，使得受損組織及血循環(huán)中的MSC遷移至受損部位并向特定組織分化[14-15]。近年來(lái)，SDF-1/CXCR4在骨折愈合及MSC遷移過(guò)程中的作用逐漸被揭示。Granero-Molto等[16]研究發(fā)現(xiàn)，只有表達(dá)CXCR4的MSC才會(huì)遷移到骨折部位，而不表達(dá)CXCR4的MSC則無(wú)法向骨折區(qū)聚集。由此，我們推測(cè)微動(dòng)可能促進(jìn)了某些與MSC遷移相關(guān)的分子如SDF-1及CXCR4在損傷部位的釋放或表達(dá)，從而促進(jìn)MSC遷移至骨折區(qū)，由此促進(jìn)骨折愈合。但目前對(duì)于力學(xué)環(huán)境影響骨折區(qū)MSC募集的具體機(jī)制及其涉及的相關(guān)信號(hào)通路，尚需進(jìn)一步研究。

此外，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中我們觀察到術(shù)后6 d各組骨折區(qū)均有軟骨生成，表明MSC已部分分化為軟骨細(xì)胞，但肉眼觀察到各組生成的軟骨量及后續(xù)軟骨內(nèi)成骨的進(jìn)度均不同步，那么是否在骨折愈合早期不同力學(xué)環(huán)境下骨折端MSC向成骨、成軟骨細(xì)胞的分化存在差異，也值得進(jìn)一步探討。

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(收稿：2016-01-25; 修回：2016-03-22)

(本文編輯：盧千語(yǔ))

Effect of mechanical environment on recruitment of mesenchymal stem cells at fracture site during early stage of fracture healing

LI Ying1,2, LI Li3, LI Jun-ling1,2, LIU Xiao-min3, YUE Long-tao4, ZHANG Jun-zhong3, WANG Shi-li1,2.

School of Medical and Life Science, University of Jinan and Shandong Academy of Medical Science1, Jinan 250022, China; Medical Biotechnology Center, Shandong Academy of Medical Sciences2, Jinan 250062, China; Department of Orthopaedic, Affiliated Hospital of Shandong University of Traditional Chinese Medicine3, Jinan 250011, China; Central Laboratory, Qianfoshan Hospital Affiliated to Shandong University4, Jinan 250062, China

Correspondingauthor:ZHANGJun-zhongE-mail:caohui63@163.com

WANGShi-liE-mail:shili2005@sina.com

ObjectiveTo explore the influence of mechanical environment on recruitment of mesenchymal stem cells (MSCs) at fracture site during early stage of fracture healing. Methods The rat femur fracture models were established, and fixed with external fixator of different stiffness coefficient. They were divided into control group with super-high stiffness external fixation, high stiffness fixator group and low stiffness fixator group. The bone callus and the degree of fracture healing were observed by X-ray after two weeks. The tissues of fracture site were obtained at 2, 4, 6, 10 days after surgery. The nucleated cells were isolated, and the ratio of CD29+CD90+ cells was detected by flow cytometry. Results According to the X-ray results, the amount of callus of high stiffness fixator group was significantly less than that of low stiffness fixator group. The ratio of CD29+CD90+ cells of three groups decreased with the increasing of healing time (P<0.05). The ratio of CD29+CD90+ cells of low stiffness fixator group was higher than that of high stiffness fixator group, while that of control group was lowest level (P<0.05). Conclusion The recruitment of MSCs at fracture site could be affected by the mechanical environment, and subtle movement could promote fracture healing.

Mechanical environment; Fracture healing; Mesenchymal stem cells; Recruitment

國(guó)家自然科學(xué)基金(81373661)、山東省科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(2013G0021806)

250022， 濟(jì)南大學(xué)、山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院(李穎、李俊玲、王世立)；250062濟(jì)南，山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院山東省醫(yī)藥生物技術(shù)研究中心(李穎、李俊玲、王世立)；250011濟(jì)南， 山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院運(yùn)動(dòng)損傷骨科(黎立、劉效敏、張俊忠)；250062濟(jì)南，山東大學(xué)附屬千佛山醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室(岳龍濤)

張俊忠E-mail: caohui63@163.com

王世立E-mail: shili2005@sina.com

10.3969/j.issn.1673-7083.2016.03.016