馬紅柳，饒海英，漆洪波，羅　欣（.墊江縣人民醫(yī)院婦產(chǎn)科，重慶408000；.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院產(chǎn)科，重慶40006）

FSTL1及MMP-2在子癇前期孕婦胎盤組織及滋養(yǎng)細(xì)胞中的表達(dá)及相關(guān)性研究*

馬紅柳1，饒海英2，漆洪波2，羅欣2（1.墊江縣人民醫(yī)院婦產(chǎn)科，重慶408000；2.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院產(chǎn)科，重慶400016）

目的探討卵泡抑素樣蛋白1（FSTL1）及基質(zhì)金屬蛋白酶2（MMP-2）在子癇前期孕婦胎盤組織及滋養(yǎng)細(xì)胞中的表達(dá)及相關(guān)性。方法以2014年1月至2015年9月在重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院產(chǎn)科住院行剖宮產(chǎn)術(shù)的子癇前期孕婦35例和正常足月妊娠行擇期剖宮產(chǎn)術(shù)孕婦40例為研究對(duì)象，采用蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)正常晚期妊娠孕婦和子癇前期患者胎盤組織中FSTL1和MMP-2蛋白的表達(dá)；采用免疫熒光法檢測(cè)正常培養(yǎng)和缺氧/復(fù)氧（H/R）處理的人早孕期絨毛膜外滋養(yǎng)細(xì)胞株HTR8/SVneo中FSTL1和MMP-2的表達(dá)；采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）檢測(cè)兩組孕婦血清FSTL1水平，分析FSTL1和MMP-2表達(dá)水平與子癇前期的相關(guān)性。結(jié)果與正常足月妊娠胎盤組織比較，子癇前期患者胎盤組織中FSTL1水平明顯升高，而MMP-2水平明顯下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與正常培養(yǎng)的細(xì)胞比較，H/R處理的細(xì)胞FSTL1蛋白水平明顯升高，而MMP-2水平明顯下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；FSTL1主要定位于HTR8/SV-neo細(xì)胞質(zhì)中。正常足月妊娠孕婦血清FSTL1水平顯著低于子癇前期孕婦，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。結(jié)論胎盤組織和血清中FSTL1和MMP-2水平的異常變化可能與子癇前期發(fā)病有關(guān)，二者可能存在協(xié)同作用。通過研究FSTL1和MMP-2的相互作用，可為子癇前期發(fā)病機(jī)制的研究提供新思路。

先兆子癇；胎盤；滋養(yǎng)層；卵泡抑素；基質(zhì)金屬蛋白酶2；氧化性應(yīng)激；孕婦

子癇前期是一種妊娠期特發(fā)的全身性疾病，其病因和發(fā)病機(jī)制目前仍未完全闡明，嚴(yán)重威脅圍生期母兒安全。卵泡抑素樣蛋白1（follistatin-like protein 1，F(xiàn)STL1）又名轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子 β1誘導(dǎo)蛋白36（transforming growth factor-β1-stimulated clone36，TSC-36）或卵泡抑素相關(guān)蛋白（follistatinrelated protein，F(xiàn)RP），是細(xì)胞外基質(zhì)蛋白家族成員之一［1］，其具有調(diào)控細(xì)胞增殖、分化、凋亡、侵襲、遷移等多種生物學(xué)功能［2］。近年來有文獻(xiàn)報(bào)道，F(xiàn)STL1參與了炎癥、心血管疾病、自身免疫性疾病、腫瘤等的發(fā)生和發(fā)展［3-4］，但其與子癇前期發(fā)病的相關(guān)性尚不清楚。本研究通過檢測(cè)子癇前期孕婦胎盤組織及血清中FSTL1的表達(dá)，以及缺氧/復(fù)氧（H/R）條件下人早孕期絨毛膜外滋養(yǎng)細(xì)胞株HTR8/SVneo中FSTL1、基質(zhì)金屬蛋白酶2 （matrix metalloproteinase 2，MMP-2）的表達(dá)情況，初步探討二者與子癇前期發(fā)病的關(guān)系。

1　資料與方法

1.1一般資料以2014年1月至2015年9月在重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院產(chǎn)科住院行剖宮產(chǎn)術(shù)的子癇前期孕婦35例（診斷標(biāo)準(zhǔn)參照《婦產(chǎn)科學(xué)》第8版全國統(tǒng)編教材［5］，子癇前期組）和正常足月妊娠行擇期剖宮產(chǎn)術(shù)孕婦40例（正常對(duì)照組）為研究對(duì)象。均為單胎妊娠；既往無高血壓、心臟病、腎臟病、糖尿病及甲狀腺功能亢進(jìn)等病史；無復(fù)發(fā)性自然流產(chǎn)、畸胎、死胎等不良孕產(chǎn)史；無吸煙、長(zhǎng)期服用藥物史。要求孕期無急、慢性感染性疾??；胎兒無畸形。兩組孕婦年齡、體質(zhì)量指數(shù)、孕產(chǎn)次、孕周、新生兒性別等比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

表1　兩組孕婦一般資料比較

1.2方法

1.2.1標(biāo)本采集入院后，于治療和分娩前采集兩組孕婦空腹肘靜脈血5 mL，離心分離收集血清，樣品轉(zhuǎn)入-80℃冰箱保存待測(cè)。剖宮產(chǎn)孕婦胎盤娩出后5 min內(nèi)，避開肉眼可見的鈣化灶及壞死區(qū)，取胎盤母體面中央組織約1.0 cm3大小，磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer aolution，PBS）漂洗后立即置于液氮中保存，過夜后轉(zhuǎn)入-80℃冰箱保存待測(cè)。

1.2.2蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)胎盤組織及HTR8/SVneo細(xì)胞中FSTL1和MMP-2蛋白的表達(dá)嚴(yán)格按照蛋白質(zhì)提取試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)研究所）說明書提取胎盤組織和HTR8/SVneo細(xì)胞總蛋白。采用聚氰基丙烯酸正丁酯（bicinchoninic acid，BCA）法檢測(cè)蛋白水平（南京凱基生物技術(shù)研究所）。行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodiumdodecylsulfate-polyacrylamidegelelectrophoresis，SDS-PAGE），將蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜（polyvinylidene fluoride，PVDF，美國Millipore公司），室溫封閉1 h后，分別加入羊抗人FSTL1單克隆抗體（1∶1 000，美國Abacm公司）、兔抗人MMP-2單克隆抗體（1∶1 000，美國Abacm公司）和兔抗人β-actin單克隆抗體（1∶1 000，美國Santa Cruz公司），4℃孵育過夜。分別加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG（1∶1 000，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）和兔抗羊IgG（1∶1 000，美國Gene Tex公司）二抗，室溫孵育1 h。加入電化學(xué)發(fā)光（electrochemiluminescence，ECL）顯色液（南京凱基生物技術(shù)有限公司），利用ChemiDoc XRS化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（美國Bio-Rad公司）檢測(cè)蛋白質(zhì)印跡各條帶灰度，用Quantity One 4.6.2版圖像分析軟件進(jìn)行分析。

1.2.3細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)HTR8/SVneo細(xì)胞中FSTL1的表達(dá)HTR8/SVneo細(xì)胞按參考文獻(xiàn)［6］進(jìn)行正常培養(yǎng)（正常培養(yǎng)組）和H/R培養(yǎng)（H/R組），H/R培養(yǎng)方法為先缺氧培養(yǎng)8 h后再常氧培養(yǎng)16 h 2個(gè)循環(huán)，共計(jì)48 h后再行固定、1%聚乙二醇辛基苯基醚（Triton×100）透化、封閉后，滴加羊抗人FSTL1單克隆抗體（1∶50），置于濕盒，4℃孵育過夜。滴加異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC）標(biāo)記的兔抗羊熒光二抗（1∶50，美國Earthox公司），37℃孵育1 h，用4′，6-二脒基-2-苯基吲哚（4，6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride，DAPI）染細(xì)胞核，甘油封片，于激光共聚焦顯微鏡（TCS SP2，Leica，德國）下觀察著色部位及熒光強(qiáng)度。

1.2.4孕婦血清中FSTL1水平檢測(cè)采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）檢測(cè)兩組孕婦外周血FSTL1水平。FSTL1 ELISA檢測(cè)試劑盒購自上海潤裕生物科技有限公司，操作按說明書進(jìn)行。所有標(biāo)本均行3個(gè)復(fù)孔檢測(cè)且為同批測(cè)定，取平均值為最終檢測(cè)水平，批內(nèi)變異系數(shù)（coefficient variations，CV）＜0.5%。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以±s表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)　果

2.1兩組孕婦胎盤組織中FSTL1和MMP-2蛋白的表達(dá)子癇前期組孕婦胎盤組織中FSTL1蛋白表達(dá)水平較正常對(duì)照組明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見圖1。

圖1　兩組孕婦胎盤組織中FSTL1和MMP-2蛋白的表達(dá)

2.2HTR8/SVneo細(xì)胞中FSTL1和MMP-2蛋白的表達(dá)H/R組HTR8/SVneo細(xì)胞FSTL1蛋白表達(dá)水平較正常培養(yǎng)組明顯升高，而MMP-2表達(dá)水平較正常培養(yǎng)組降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見圖2。

圖2　HTR8/SVneo細(xì)胞中FSTL1和MMP-2蛋白的表達(dá)

2.3FSTL1在HTR8/SVneo細(xì)胞中的表達(dá)定位FITC標(biāo)記的熒光二抗結(jié)合FSTL1蛋白呈綠色熒光；DAPI標(biāo)記的細(xì)胞核呈藍(lán)色熒光。通過兩組圖片的合并（Merged）顯示，F(xiàn)STL1主要表達(dá)在細(xì)胞質(zhì)中，H/R組熒光強(qiáng)度較正常培養(yǎng)組增強(qiáng)。見圖3。

圖3　FSTL1蛋白在HTR8/SVneo細(xì)胞中的表達(dá)定位（200×）

2.4兩組孕婦血清FSTL1水平比較子癇前期組孕婦血清FSTL1水平顯著高于正常對(duì)照組［分別為（5.21±0.92）、（8.18±0.67）μg/mL］，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

3　討　論

FSTL1屬于細(xì)胞外基質(zhì)蛋白家族，存在于大部分哺乳動(dòng)物中，可由多種細(xì)胞分泌。FSTL1具有多種生理功能，參與多種生物學(xué)過程，包括細(xì)胞遷移、增殖、凋亡、新陳代謝、分化、免疫反應(yīng)及內(nèi)分泌功能等［1，7］。有研究表明，F(xiàn)STL1可能與腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移和浸潤有關(guān)［8］。Chan等［9］應(yīng)用PCR檢測(cè)了45例子宮內(nèi)膜癌及16例卵巢癌患者癌組織中FSTL1的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與正常對(duì)照組織比較，F(xiàn)STL1的表達(dá)是下調(diào)的。將FSTL1過表達(dá)慢病毒轉(zhuǎn)染入內(nèi)膜癌細(xì)胞及卵巢癌細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力減弱。而有關(guān)FSTL1在人類胎盤組織中的表達(dá)情況的研究較少。Mouillet等［10］通過PCR、蛋白質(zhì)印跡等方法證實(shí)FSTL1在人類胎盤組織絨毛外滋養(yǎng)細(xì)胞中特異性表達(dá)。

MMPs是一組具有許多共同生化性質(zhì)的可降解細(xì)胞外基質(zhì)的酶，其異常表達(dá)可導(dǎo)致一些病理過程的發(fā)生。MMPs與腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移和侵襲能力密切相關(guān)。以往研究已證實(shí)，MMPs的異常表達(dá)與子癇前期存在密切關(guān)系［11］。滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲的關(guān)鍵在于對(duì)基質(zhì)成分的水解及基底膜的穿越，而基底膜的主要成分包括Ⅳ型膠原、層粘連蛋白、纖維連接蛋白、硫酸類肝素蛋白多糖等，這些均是MMPs的作用底物。由此可見，MMPs在這一過程中起著關(guān)鍵作用。

本研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)STL1主要表達(dá)在胎盤的滋養(yǎng)細(xì)胞中，子癇前期患者胎盤組織中FSTL1表達(dá)水平較正常胎盤組織顯著升高，且子癇患者血清FSTL1水平也高于正常孕婦，證實(shí)其表達(dá)異常與子癇前期具有相關(guān)性，且可能與滋養(yǎng)細(xì)胞的侵襲能力有關(guān)。而Chaly等［3］研究證實(shí)，通過H/R培養(yǎng)HTR8/SVneo細(xì)胞可以誘發(fā)顯著的氧化應(yīng)激，與子癇前期胎盤組織類似。本研究利用該模型證實(shí)，H/R組HTR8/SVneo細(xì)胞FSTL1蛋白表達(dá)水平顯著高于正常培養(yǎng)組，表明氧化應(yīng)激可以觸發(fā)FSTL1在滋養(yǎng)細(xì)胞中的異常表達(dá)，與前文所述子癇前期中FSTL1表達(dá)升高相呼應(yīng)。本研究進(jìn)一步證明，在子癇前期胎盤和H/R處理的 HTR8/SVeno細(xì)胞中MMP-2活性下降。FSTL1蛋白可通過抑制MMP的表達(dá)抑制腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和浸潤，表明在子癇前期中由于氧化應(yīng)激刺激FSTL1的表達(dá)，抑制了MMP-2的活性，從而引起滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲能力下降。

子癇前期的發(fā)生是一個(gè)多因素、分階段的動(dòng)態(tài)進(jìn)展過程，而滋養(yǎng)細(xì)胞的侵襲能力受損在此過程中發(fā)揮著舉足輕重的作用。本研究通過檢測(cè)子癇前期及正常足月妊娠者胎盤組織和血清中FSTL1及MMP-2在胎盤組織中的表達(dá)，并通過采用H/R滋養(yǎng)細(xì)胞模型模擬子癇前期，進(jìn)一步證實(shí)了目的蛋白在氧化應(yīng)激下的異常表達(dá)情況，初步探討了FSTL1和MMP-2在子癇前期發(fā)病中的作用，期望能為子癇前期的發(fā)病機(jī)制研究提供新的靶點(diǎn)和理論依據(jù)。

［1］Wei K，Serpooshan V，Hurtado C，et al.Epicardial FSTL1 reconstitution regenerates the adult mammalian heart［J］.Nature，2015，525（7570）：479-485.

［2］Hayakawa S，Ohashi K，Shibata R，et al.Cardiac myocyte-derived follistatin-like 1 prevents renal injury in a subtotal nephrectomy model［J］.J Am Soc Nephrol，2015，26（3）：636-646.

［3］Chaly Y，Hostager B，Smith S，et al.Follistatin-like protein 1 and its role in inflammation and inflammatory diseases［J］.Immunol Res，2014，59（1/3）：266-272.

［4］Kudo-Saito C，F(xiàn)uwa T，Murakami K，et al.Targeting FSTL1 prevents tumor bone metastasis and consequent immune dysfunction［J］.Cancer Res，2013，73（20）：6185-6193.

［5］謝幸，茍文麗.婦產(chǎn)科學(xué)［M］.8版.北京：人民衛(wèi)生出版社，2013：67.

［6］Luo X，Yao ZW，Qi HB，et al.Gadd45α as an upstream signaling molecule of p38 MAPK triggers oxidative stress-induced sFlt-1 and sEng upregulation in preeclampsia［J］.Cell Tissue Res，2011，344（3）：551-565.

［7］Fan N，Sun H，Wang Y，et al.Follistatin-like 1：a potential mediator of inflammation in obesity［J］.Mediators Inflamm，2013，2013：752519.

［8］Chen SX，Xu XE，Wang XQ，et al.Identification of colonic fibroblast secretomes reveals secretory factors regulating colon cancer cell proliferation［J］.J Proteomics，2014，110：155-171.

［9］Chan QK，Ngan HY，Ip PP，et al.Tumor suppressor effect of follistatinlike 1 in ovarian and endometrial carcinogenesis：a differential expression and functional analysis［J］.Carcinogenesis，2009，30（1）：112-114.

［10］Mouillet JF，Mishima T，Paffaro AM，et al.The expression and post-transcriptional regulation of FSTL1 transcripts in placental trophoblasts［J］. Placenta，2015，36（11）：1231-1238.

［11］Vincent ZL，Mitchell MD，Ponnampalam AP.Regulation of MT1-MMP/ MMP-2/TIMP-2 axis in human placenta［J］.J Inflamm Res，2015，8：193-200.

Study on expression and correlation of FSTL1 and MMP-2 in placenta tissue and trophoblasts in preeclampsia pregnant women*

Ma Hongliu1，Rao Haiying2，Qi Hongbo2，Luo Xin2（1.Department of Gynecology and Obstetrics，Dianjiang County People′s Hospital，Chongqing 408000，China；2.Department of Obstetrics，F(xiàn)irst Affiliated Hospital，Chongqing Medical University，Chongqing 400016，China）

ObjectiveTo detect the expression and correlation of follistatin-like protein 1（FSTL1）and matrix metalloproteinase-2（MMP-2）in placenta tissue and trophoblasts in preeclampsia pregnant women.MethodsThirty-five preeclampsia pregnant women and 40 normal full term pregnant women undergoing cesarean section in the obstetric department of the First Affiliated Hospital of Chongqing Medical University from January 2014 to September 2015 were taken as the research subjects. Western blotting was adopted to detect the expression of FSTL1 and MMP-2 protein in placental tissues；the expressions of FSTL1 and MMP-2 in human early pregnancy extrachorionic trophoblastic cell lines HTR8/SVneo by normal culture and hypoxia/re-oxygenation（H/R）treatment were detected by adopting immunofluorescence assay；the enzyme-linked immunosorbent assay（ELISA）was used to examine the levels of FSTL1 in serum in the two groups.The correlation between FSTL1 and MMP-2 expression levels with preeclampsia was analyzed.ResultsThe expression level of FSTL1 in placenta tissues of preeclampsia patients was significantly increased compared with placenta tissue in full term pregnancy，while the expression level of MMP-2 was significantly reduced，and the differences were statistically significant（P＜0.05）.The expression level of FSTL1 protein in the cells of H/R treatment was significantly increased compared with that in the normal culture group，while the expression level of MMP-2 was significantly reduced，and the differences were statistically significant（P＜0.05）；the positioning of FSTL1 was primarily located in cytoplasm of HTR8/SVneo.The serum FSTL1 level in the full term pregnant women group was significantly lower than that in the preeclampsia pregnant women，the difference was statistically significant（P＜0.01）.ConclusionThe abnormal changes of FSTL1 and MMP-2 expression in placental tissues and serum may contribute to the pathogenesis of preeclampsia，the two may have synergistic effect. Studying the interaction of FSTL1 and MMP-2 may provide a new idea for the research of preeclampsia pathogenesis.

Pre-eclampsia；Placenta；Trophoblasts；Follistatin；Matrix metalloproteinase 2；Oxidative stress；Pregnant women

10.3969/j.issn.1009-5519.2016.13.005

A

1009-5519（2016）13-1967-03

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81300509、81471472）。

馬紅柳（1974-），主治醫(yī)師，主要從事婦產(chǎn)科常見病及多發(fā)病臨床診療工作。

（2016-03-11）