蔣　群，屠偉峰，徐少群，趙高峰（.廣東省中醫(yī)院麻醉科，廣州5000；2.廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院臨床麻醉中心，廣東廣州5000）

阿米洛利預(yù)處理對(duì)浸水束縛大鼠血清NO及胃黏膜MPO的影響*

蔣群1，屠偉峰2△，徐少群1，趙高峰1（1.廣東省中醫(yī)院麻醉科，廣州510010；2.廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院臨床麻醉中心，廣東廣州510010）

目的觀察酸敏感離子通道阻斷劑——阿米洛利（Amiloride）預(yù)處理對(duì)急性胃黏膜病變（AMGL）大鼠的影響，并探討AMGL發(fā)病機(jī)制與酸敏感離子通道（ASICs）的關(guān)系。方法選取Wistar大鼠30只，分為正?？瞻讓?duì)照組（NC組）、應(yīng)激模型組（WS組）、阻斷劑組（AM組，給予Amiloride預(yù)處理），每組10只。采用浸水束縛應(yīng)激（WIRS）方法復(fù)制AMGL模型，于應(yīng)激6 h后觀察胃黏膜大體及光鏡下胃黏膜損傷程度、組織學(xué)改變及潰瘍指數(shù)（UI）、血清一氧化碳（NO）活性和胃黏膜組織髓過(guò)氧化物酶（MPO）水平。結(jié)果WS組大鼠胃黏膜呈暗紅色，有大量點(diǎn)狀出血、線狀出血或片狀糜爛，黏膜下血管和皮區(qū)血管充血，光鏡下見(jiàn)上皮細(xì)胞黏液層變薄、缺失，細(xì)胞間隙變大，不同程度壞死；AM組大鼠WIRS 6 h后大鼠胃黏膜出血或糜爛程度明顯輕于WS組，光鏡下雖可見(jiàn)大量毛細(xì)血管充血、擴(kuò)張，上皮細(xì)胞黏膜層有少許缺損，但基本完整。與NC組比較，WS組大鼠WIRS 6 h后胃黏膜UI顯著增高，血清NO活性增強(qiáng)，胃組織MPO水平明顯增高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；與WS組比較，AM組大鼠胃黏膜UI、血清NO活性及胃組織MPO水平顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。結(jié)論Amiloride可有效減輕炎癥介導(dǎo)的WIRS大鼠急性胃黏膜損傷或病變，提示ASICs可能參與了WIRS大鼠AMGL的發(fā)生。

阿米洛利；胃疾病；急性?。灰谎趸?；胃黏膜；過(guò)氧化物酶；離子通道；大鼠

急性胃黏膜病變（AMGL）又稱為應(yīng)激性胃潰瘍，指在各種應(yīng)激狀態(tài)下，胃、十二指腸發(fā)生的急性、多發(fā)性黏膜淺表糜爛和潰瘍。大量研究表明，胃腸道pH值下降是許多病理生理過(guò)程的標(biāo)志。休克、膿毒癥等各種病理?xiàng)l件下內(nèi)臟血流灌注不足可導(dǎo)致胃腸道酸中毒，而適當(dāng)?shù)乃崦舾芯哂芯S持胃腸道內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的作用，不適當(dāng)?shù)乃崦舾锌赡芗铀傺装Y和黏膜潰瘍的發(fā)生［1］。酸敏感離子通道（ASICs）作為化學(xué)感受器、傷害感受器、機(jī)械感受器在胃腸道信息處理過(guò)程中起重要作用。作者前期研究發(fā)現(xiàn)，酸敏感離子通道蛋白3（ASIC3）在胸段背根神經(jīng)節(jié)（DRG）神經(jīng)元上廣泛表達(dá)，且ASIC3 mRNA在AMGL大鼠胃投射DRG的表達(dá)量明顯增高［2］，推測(cè)ASICs可能在應(yīng)激性AGML的發(fā)生、發(fā)展中具有重要作用。本研究采用前期工作中應(yīng)用的浸水束縛應(yīng)激（WIRS）方法復(fù)制AMGL模型［2］，探討ASICs非特異性阻斷劑——阿米洛利（Amiloride）預(yù)處理對(duì)WIRS大鼠胃黏膜損傷的影響，進(jìn)一步了解ASICs在AMGL發(fā)生中的作用。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物采用成年雄性無(wú)特定病原體級(jí)（SPF級(jí)）Wistar大鼠30只，體質(zhì)量（200±30）g，由南方醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心提供。

1.1.2試劑與儀器Amiloride粉劑（美國(guó)Sigma公司，批號(hào)不詳），髓過(guò)氧化物酶（MPO）試劑盒和一氧化氮（NO）試劑盒由南京建成生物醫(yī)學(xué)工程研究所提供。紫外分光光度計(jì)Optizen 2120UV購(gòu)自韓國(guó)美卡希斯公司，酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司，DK-S22型電熱恒溫水浴鍋購(gòu)自上海精宏公司。

1.2方法

1.2.1動(dòng)物分組及模型復(fù)制將30只大鼠分為正?？瞻讓?duì)照組（NC組）、應(yīng)激模型組（WS組）和阻斷劑組（AM組），每組10只。NC組不給予任何處理，WS組采用WIRS法復(fù)制模型，AM組給予Amiloride預(yù)處理，即腹腔注射5μg/kgAmiloride 5min后浸水束縛。模型復(fù)制過(guò)程參照以往制作方法［2］：乙醚麻醉后，將大鼠四肢固定在自制的鐵絲網(wǎng)上，待大鼠清醒后垂直放入（20±1）℃水中，水面至胸骨劍突，6h后取出。

1.2.2標(biāo)本采集與觀察WIRS 6 h后，在水合氯醛深度麻醉狀態(tài)下取胃，沿胃大彎剪開(kāi)平鋪，用冷生理鹽水沖洗，在10倍解剖顯微鏡下觀察胃黏膜情況。

1.2.3胃黏膜潰瘍指數(shù)（UI）的判定按Guth等［3］標(biāo)準(zhǔn)評(píng)估胃黏膜UI：點(diǎn)狀出血為1分，糜爛小于1 cm為2分，糜爛1～2 cm為3分，糜爛大于2～3 cm為4分，糜爛大于3 cm為5分；寬度大于2 mm者分值×2。所有得分相加即為UI。

1.2.4胃黏膜組織學(xué)檢查在胃黏膜損傷明顯處用組織剪剪取0.5 cm×1.0 cm大小組織塊，置于10%甲醛溶液中固定24～48 h，石蠟包埋后行4 μm切片，再用蘇木精-伊紅（HE）染色后于40倍光鏡下觀察胃黏膜組織學(xué)變化。

1.2.5血清NO活性測(cè)定腹主動(dòng)脈取血2 mL，分離血漿，取上清液保存于-70℃冰箱中備用，采用硝酸還原酶法比色測(cè)定。具體步驟嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。

1.2.6胃黏膜MPO測(cè)定取胃組織液氮保存?zhèn)溆?。用液氮研磨組織，與生理鹽水按體積質(zhì)量比19∶1制作5%組織勻漿。采用比色法測(cè)定，具體方法與步驟參照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以±s表示，組間樣本均數(shù)比較采用oneway ANOVA檢驗(yàn)，組間兩兩比較采用q檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)　果

2.1Amiloride對(duì)AMGL大鼠胃黏膜大體形態(tài)的影響

經(jīng)大體標(biāo)本觀察，NC組大鼠胃腔有淡黃色透明液體，胃黏膜呈淡紅色，光滑完整，無(wú)充血；WS組大鼠WIRS 6 h后胃腔內(nèi)見(jiàn)大量血性積液，黏膜表面大量暗紅色血痂，充血嚴(yán)重，呈點(diǎn)狀、線狀、片狀糜爛壞死；AM組大鼠胃腔液體呈黃色，胃黏膜仍存在充血、水腫、岀血、壞死，但程度較輕，顏色較淡（圖1）。

2.2Amiloride對(duì)AMGL大鼠胃黏膜組織形態(tài)的影響光鏡下觀察NC組大鼠胃黏膜上皮光滑完整，腺體排列整齊；WS組大鼠胃黏膜上皮黏膜壞死、脫落，細(xì)胞間隙變大，毛細(xì)血管嚴(yán)重充血、擴(kuò)張，間質(zhì)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，腺體破壞嚴(yán)重；AM組大鼠胃黏膜上皮部分壞死，腺體破壞輕，毛細(xì)血管輕度充血、擴(kuò)張，損傷明顯輕于WS組（圖2）。

圖2　Amiloride對(duì)AMGL大鼠胃黏膜組織病理學(xué)的影響（HE染色，40×）

2.3Amiloride對(duì)AMGL大鼠胃黏膜UI、血清NO活性和胃組織MPO水平的影響與NC組比較，WIRS 6 h后，WS組大鼠胃黏膜UI顯著增高，血清NO活性增強(qiáng)，胃組織MPO水平明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；與WS組比較，AM組大鼠胃黏膜UI、血清NO活性及胃組織MPO水平顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見(jiàn)表1。胃黏膜UI與MPO水平呈顯著正相關(guān)（r=0.904，P＜0.01）。

表1　各組大鼠胃黏膜UI、血清NO活性和胃組織MPO水平比較（±s）

表1　各組大鼠胃黏膜UI、血清NO活性和胃組織MPO水平比較（±s）

注：-表示無(wú)此項(xiàng)。

組別N C 組W S 組A M 組n　U I（分）　N O （μ m o l / L）　M P O （U / g濕重）1 0 1 0 1 0 F P --0 . 0 0 ± 0 . 0 0 4 8 . 7 2 ± 3 . 1 2 2 1 . 7 0 ± 5 . 7 3 2 3 5 . 3 7 ＜0 . 0 1 1 3 . 4 5 ± 2 . 4 6 2 8 . 9 5 ± 2 . 7 5 1 8 . 0 3 ± 3 . 0 6 2 5 . 4 7 ＜0 . 0 1 1 3 . 3 9 ± 4 . 1 2 3 1 . 9 1 ± 2 . 3 5 1 6 . 2 4 ± 2 . 7 3 2 8 . 2 3 ＜0 . 0 1

3　討　論

機(jī)體在遭受各種創(chuàng)傷、重病及其他應(yīng)激情況時(shí)，這些非特異性的強(qiáng)烈刺激可使機(jī)體各系統(tǒng)本能地出現(xiàn)功能和結(jié)構(gòu)上的劇烈反應(yīng)。胃是應(yīng)激狀態(tài)下最為敏感的器官之一，此時(shí)胃黏膜所表現(xiàn)的急性病變也稱為應(yīng)激性胃潰瘍，其發(fā)生機(jī)制尚未明確，目前認(rèn)為是維持胃黏膜完整性的平衡因子失調(diào)和破壞，其病因主要集中在胃黏膜微循環(huán)障礙、胃酸反彌散、氧自由基損害、細(xì)胞凋亡等方面。本研究采用WIRS復(fù)制應(yīng)激性胃潰瘍模型。

ASICs屬于對(duì)Amiloride敏感的上皮鈉通道/退化蛋白（ENaC/DEG）通道家族［4］，由6個(gè)不同的亞基組成，ASICs作為化學(xué)感受器、傷害感受器和機(jī)械感受器，在胃腸道信息處理過(guò)程中具有重要作用［5］。有研究表明，ASIC3和瞬時(shí)受體電位離子通道（TRPV1，俗稱辣椒素受體）共同表達(dá)于脊髓DRG神經(jīng)元［6］，在胃腸道高炎性反應(yīng)中，對(duì)感受組織酸化起到傷害性感受器的重要作用。同時(shí)，已有大量研究表明，胃酸刺激能活化DRG神經(jīng)元軸突上的TRPV1受體，TRPV1受體活化導(dǎo)致降鈣素基因相關(guān)肽（GCRP）、神經(jīng)肽A（NKA）等肽類物質(zhì)大量釋放，通過(guò)GCRP/NO/前列腺素（PGS）途徑誘導(dǎo)充血反應(yīng)［7］，增加胃黏膜血流量（GMBF），對(duì)胃黏膜起到保護(hù)作用。作者在前期工作中也發(fā)現(xiàn)，在WIRS大鼠胸段胃投射DRG中TRPV1水平升高，胃黏膜中GCRP水平增加，提示胃黏膜的傳出樣作用［8］。也有研究明確顯示，在胃黏膜感受器傳入系統(tǒng)與NO胃黏膜保護(hù)機(jī)制中扮演了重要角色［9］。而在ASIC3去基因小鼠中［10］，由氯化氫誘導(dǎo)的胃黏膜損傷程度更大一些，由此推測(cè)，ASIC3與胃黏膜保護(hù)相關(guān)，其保護(hù)機(jī)制與TRPV1相似。本研究通過(guò)使用ASICs阻斷劑——Amiloride預(yù)處理，觀察ASICs在WIRS大鼠胃黏膜損傷發(fā)生中的作用。

本研究結(jié)果顯示，正常大鼠胃黏膜呈淡紅色，光滑完整，無(wú)充血；WIRS 6 h后大鼠胃腔內(nèi)見(jiàn)大量血性積液，胃黏膜明顯充血、水腫，損傷嚴(yán)重，呈點(diǎn)線狀甚至片狀糜爛、壞死，UI高達(dá)（48.72±3.12）分，而Amiloride預(yù)處理大鼠WIRS 6 h后，大鼠胃黏膜出血或糜爛程度明顯輕于WS組，UI降低［（21.70±5.73）分］。光鏡下觀察WIRS 6 h后大鼠胃黏膜、上皮黏膜壞死、脫落，細(xì)胞間隙變大，毛細(xì)血管嚴(yán)重充血、擴(kuò)張，間質(zhì)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，腺體破壞嚴(yán)重；Amiloride預(yù)處理大鼠WIRS 6 h后胃黏膜損傷程度明顯減輕，僅有部分毛細(xì)血管充血、擴(kuò)張。表明在Amiloride阻斷ASICs的情況下，WIRS模型大鼠胃黏膜損傷明顯減輕，即Amiloride預(yù)處理對(duì)大鼠AMGL具有明顯保護(hù)作用。由此推測(cè)，ASICs可能參與了AMGL的發(fā)生。

本研究結(jié)果表明，WS組在胃潰瘍發(fā)生時(shí)伴隨著UI的增加和NO活性升高，與NC組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），提示在應(yīng)激狀態(tài)下機(jī)體能產(chǎn)生適量的NO增加GMBF，保護(hù)局部胃黏膜，而在Amiloride阻斷ASIC3的作用下，WIRS 6 h后NO活性無(wú)明顯增強(qiáng)，說(shuō)明ASIC3同樣可以感受胃酸刺激，誘發(fā)胃黏膜適應(yīng)性保護(hù)作用［11］。另外，本研究結(jié)果顯示，WS組大鼠UI，胃黏膜組織MPO水平較NC組顯著增高，且UI與MPO水平呈顯著正相關(guān)，與前期研究結(jié)果一致［12］；而Amiloride阻斷后MPO水平降低，提示阻斷ASIC3可以通過(guò)抑制中性粒細(xì)胞活化而產(chǎn)生胃黏膜保護(hù)作用。

本研究提示，ASICs在胃腸道病變中具有“雙刃劍”的作用，小劑量的酸敏感可以誘發(fā)胃黏膜的適應(yīng)性保護(hù)作用；同時(shí)，ASIC3在胃腸道高炎性反應(yīng)中感受組織酸化，起到傷害性感受器作用。推測(cè)ASICs參與AMGL的具體機(jī)制可能是由于WIRS誘導(dǎo)產(chǎn)生的胃潰瘍加重了ASIC3對(duì)酸誘發(fā)痛的感知，并通過(guò)炎癥介導(dǎo)加重了應(yīng)激對(duì)胃黏膜的損傷，阻斷或去除這種酸感受器可改善胃腸道的酸傷害性感受，減輕炎性反應(yīng)，從而發(fā)揮胃黏膜的保護(hù)作用。

綜上所述，ASICs在維持胃腸道內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定中具有重要作用，激活A(yù)SICs可以通過(guò)增加GMBF發(fā)揮適應(yīng)性保護(hù)作用，同時(shí)，還可通過(guò)活化中性粒細(xì)胞加重胃黏膜損傷，但其具體機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。

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Effect of amiloride pretreatment on serum NO and gastric mucosal MPO in water immersion restraint rats*

Jiang Qun1，Tu Weifeng2△，Xu Shaoqun1，Zhao Gaofeng1（1.Department of Anesthesiology，Guangdong Provincial Hospital of Traditional Chinese Medicine，Guangzhou，Guangdong 510010，China；2.Clinical Anesthesia Center，Guangzhou General Hospital of Guangzhou Military Region，Guangzhou，Guangdong 510010，China）

ObjectiveTo investigate the effect of acid sensing ion channels（ASICs）blocker amiloride precondition on acute gastricmucosallesion（AGML）ratandto studythe relationbetweenAGMLpathogenesiswith ASICs.MethodsThirty Wistar rats were selected and randomly divided to 3 groups（10 cases per group），including the normal blank control group（NC），stress model group（WS）and blocker group（amiloride precondition group，AM）.The AGML model was induced by water immersion restraint stress（WIRS）.The gastric tissues in general，gastric mucosal lesion degree，histological change under microscope and ulcer index were observed，the levels of serum NO and MPO in gastric mucosal tissue were observed at 6 h after stress.ResultsThe gastric mucosa in the WS group showed dark red with a large of punctate hemorrhage，linear hemorrhage or flake erosion，the submucosal blood vessel and dermatomal blood vessel were congested，the epithelial cell mucous layer was thin and deleted，the intracellular space was increased with different degrees of necrosis；but the gastric mucosal hemorrhage or erosion degree after 6 h of WIRS in the AM group was obviously improved compared with that in the WS group；a large number of blood capillary congestion and expansion were seen under microscope，the epithelial cell mucosal layer had a little defects，but was basically intact.Compared with the group NC，the gastric mucosal UI after 6 h of WIRS in the WS group was significantly increased，serum NO enhanced and gastric tissue MPO level was significantly elevated，the differences were statistically significant（P＜0.01）；compared with the WS group，gastric mucosal UI，serum NO level and gastric tissue MPO level were significantly decreased，the differences were statistically significant（P＜0.01）.ConclusionAmiloride can effectively alleviate the WIRS rat acute gastric mucosal lesion mediated by inflammation，which prompting that ASICs may participate in the occurrence of AGML in WIRS rat.

Amiloride；Stomach diseases；Acute disease；Nitric oxide；Gastric mucosa；Peroxidase；Ion channels；Rats

10.3969/j.issn.1009-5519.2016.13.003

A

1009-5519（2016）13-1961-03

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81272141）；廣東省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（S2011010003373）；江蘇省教育廳開(kāi)放研究課題（KJS09002）。

蔣群（1984-），碩士研究生，主要從事胃保護(hù)與傷害性感受器關(guān)系的研究。

△，E-mail：wftuyx02@163.com。

（2016-03-18）