黃澤君，李　銳，孫建森，丁　俊（.重慶市腫瘤研究所超聲科40000；.第三軍醫(yī)大學(xué)西南醫(yī)院超聲科，重慶40008；.第三軍醫(yī)大學(xué)基礎(chǔ)部解剖教研室，重慶40008）

兔VX2腫瘤組織與正常組織微血管構(gòu)筑形態(tài)研究*

黃澤君1，李銳2△，孫建森3，丁俊2（1.重慶市腫瘤研究所超聲科400030；2.第三軍醫(yī)大學(xué)西南醫(yī)院超聲科，重慶400038；3.第三軍醫(yī)大學(xué)基礎(chǔ)部解剖教研室，重慶400038）

目的觀察兔VX2肌肉腫瘤與正常肌肉組織微血管構(gòu)筑的形態(tài)特征。方法采用隧道組織塊包埋法建立VX2肌肉腫瘤模型。通過電鏡和微血管鑄型方法觀察兔VX2肌肉腫瘤與正常肌肉組織微血管構(gòu)筑形態(tài)特征。結(jié)果（1）采用隧道組織塊包埋法成功建立了VX2肌肉腫瘤模型兔，成功率為100%。（2）電鏡下觀察正常肌肉組織微血管內(nèi)徑較均勻，基底膜厚度均勻、內(nèi)膜完整，內(nèi)皮細胞及周細胞與基底膜黏附緊密。而肌肉腫瘤組織微血管管徑不均勻，管腔大多擴張呈囊性變，基底膜變薄、厚薄不均，內(nèi)皮細胞與基底膜黏附松散，部分分離。（3）微血管鑄型使正常肌肉組織和肌肉腫瘤組織微血管的三維結(jié)構(gòu)可視化。正常肌肉組織的微血管密度較稀疏，分布均勻，走行自然，呈樹枝狀；而肌肉腫瘤組織微血管密集、結(jié)構(gòu)紊亂，分布不均，多數(shù)走行迂曲呈蛇形，部分囊狀擴張，部分迂曲狹窄，或二者并存吻合成復(fù)雜的血管網(wǎng)、血管團等。結(jié)論兔VX2肌肉腫瘤組織與正常肌肉組織的微血管構(gòu)筑形態(tài)存在顯著差異。

腫瘤，肌組織；腫瘤，實驗性；腫瘤/病理學(xué)；組織包埋；毛細血管/超微結(jié)構(gòu)；微血管構(gòu)筑；兔

腫瘤新生血管是惡性腫瘤生長、浸潤及轉(zhuǎn)移必須依賴的條件［1］。腫瘤的血流在時間及空間上出現(xiàn)異質(zhì)性原因在于腫瘤微血管構(gòu)筑表型（T-MAP）的異常，繼而導(dǎo)致腫瘤微環(huán)境改變，T-MAP的異常不僅影響腫瘤的侵襲性及預(yù)后，同時也是抗腫瘤血管生成治療療效存在顯著差異的重要因素之一［2］。過去幾十年來，人們對血管和血管生成在癌癥中重要性的認識已逐漸深入，而且腫瘤血管結(jié)構(gòu)評估用于體內(nèi)監(jiān)測治療反應(yīng)也越來越重要［3］。本研究擬通過對比兔VX2肌肉腫瘤組織與正常肌肉組織微血管結(jié)構(gòu)和三維分布的特征，了解其微血管構(gòu)筑表型分別具有的特點并分析其差異，為兔肌肉腫瘤組織治療后微血管構(gòu)筑表型的正常化研究打下一定的實驗基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料由第三軍醫(yī)大學(xué)附屬大坪醫(yī)院動物實驗中心提供健康新西蘭大白兔6只，雌雄不限，體質(zhì)量1.7～2.4 kg，平均（2.1±0.5）kg。VX2腫瘤組織由第三軍醫(yī)大學(xué)新橋醫(yī)院超聲科惠贈。Acuson Sequoia 512型彩色多普勒超聲診斷儀（西門子公司），OLYMPUS BX51型光學(xué)顯微鏡，數(shù)碼成像系統(tǒng)DP-50，PHILIPS TECNAI-10透射電鏡。

1.2方法

1.2.1動物模型的建立對6只兔采用隧道組織塊包埋法［1］建立右側(cè)腿部VX2兔肌肉移植瘤模型。從患有VX2腫瘤的種兔體內(nèi)取出靠近邊緣為灰白色魚肉樣有活力的肌肉腫瘤組織，修剪成體積約1 cm3，置于盛適量生理鹽水的培養(yǎng)皿中。將預(yù)接種的實驗兔用速眠新0.2 mL/kg體質(zhì)量經(jīng)肌內(nèi)注射（肌注）麻醉后，依次切開兔皮膚、皮下及肌膜組織，用眼科鑷在肌肉組織中分離出竇道，要求深約1 cm左右。每個竇道內(nèi)植入1～2塊肌肉腫瘤組織后局部加壓止血，再按照肌層、肌膜、皮下組織和皮膚順序縫合，從而制成荷瘤兔模型。詳細記錄每只實驗兔編號及接種情況，單兔單籠喂養(yǎng)，術(shù)后前3天每只兔每天肌注40萬U青霉素。接種2周后用于二維超聲、電鏡檢查和微血管鑄型等實驗。

1.2.2二維超聲檢查動物麻醉，腫瘤處備皮后再涂上適量耦合劑，采用西門子512型超聲診斷儀，使用15L8W高頻探頭（頻率14 MHz、深度40 mm）觀察肌肉腫瘤組織的二維超聲情況，選擇能清晰顯示并直徑大于10 mm的腫瘤作為研究對象，用彩色記號筆標明腫瘤位置及超聲觀察切面方向。

1.2.3電鏡檢查將3只荷瘤兔麻醉固定后迅速取出部分肌肉腫瘤組織和對側(cè)對稱肌肉組織，立即放在石蠟臺上（石蠟表面滴有3%戊二醛溶液），將其修剪為大小約1mm3的組織數(shù)塊，置于3%戊二醛溶液中固定48 h，1%鋨酸恒溫4℃固定2 h，再逐級丙酮脫水，環(huán)氧樹脂Epon812包埋，之后60℃固化，定位后作超薄切片，再用透射電鏡觀察肌肉腫瘤組織和正常肌肉組織中的微血管超微結(jié)構(gòu)情況。

1.2.4微血管鑄型方法采用解剖學(xué)技術(shù)，將3只荷瘤兔的肌肉腫瘤組織和對側(cè)對稱的肌肉組織制成微血管鑄型標本，步驟如下。（1）配制填充劑：乙酸乙酯溶液內(nèi)加入適量的丙烯腈-丁二烯-苯乙烯共聚物（ABS）分別配制成10%、20%的ABS乙酸乙酯液，加入紅色油畫顏料并攪拌均勻，備用。（2）取材和插管：選取速眠新麻醉荷瘤兔將其仰臥固定于木板上，打開胸腔及腹腔，依次暴露心臟，打開左心室，導(dǎo)管從左心室插入并進入升主動脈，將除降主動脈分支動脈以外的血管結(jié)扎，與此同時剪開右心房并觀察流出的液體情況。（3）灌注：首先使用含有肝素鈉的生理鹽水灌注心臟至右心房流出的液體清亮后方停止，然后灌注10%的ABS乙酸乙酯液，當右心房流出灌注液時表明灌注成功，隨即灌注20%的ABS乙酸乙酯液，直至ABS乙酸乙酯液不能再灌入后方停止。（4）補灌：于初次灌注后第2、3天分別根據(jù)情況補充灌注ABS乙酸乙酯液，灌注結(jié)束后取出血管插管同時結(jié)扎各灌注管道。將荷瘤兔模型置于清水中2周硬固。（5）腐蝕、修整：待鑄型劑固化后，將標本浸泡于25%鹽酸溶液腐蝕，時間為7～10 d，然后根據(jù)具體情況進行沖洗，使鑄型標本干凈、完整顯示。最后修整標本，并將定型的模型封存入盛有5%甲醛的有機玻璃標本盒中長期保存。

2　結(jié)　果

2.1腫瘤種植結(jié)果接種種植成功VX2肌肉腫瘤兔6只，成功率為100%，共有9個腫瘤結(jié)節(jié)，其中直徑大于10 mm腫瘤結(jié)節(jié)6個，5～9 mm腫瘤結(jié)節(jié)3個。二維超聲檢查顯示，腫瘤結(jié)節(jié)呈分葉狀或類圓形、低回聲，邊緣多清晰，部分有包膜形成，包膜下可見豐富的血管網(wǎng)（圖1）。

圖1　肌肉腫瘤組織二維超聲圖像

2.2電鏡觀察結(jié)果

2.2.1正常肌肉組織的微血管結(jié)構(gòu)表現(xiàn)微血管內(nèi)徑大小相近，管腔規(guī)則，基底膜完整、厚度均勻，周細胞及內(nèi)皮細胞與基底膜黏附緊密（圖2）。

圖2　正常肌肉組織電鏡下微血管病理圖（12 500×）

2.2.2肌肉腫瘤組織的微血管結(jié)構(gòu)表現(xiàn)微血管內(nèi)徑粗細不一，管腔形態(tài)不規(guī)則，多呈囊性擴張，基底膜厚薄不均，周細胞及內(nèi)皮細胞與基底膜黏附松散，部分分離（圖3）。

圖3　肌肉腫瘤組織電鏡下微血管病理圖（6 200×）

2.3微血管鑄型結(jié)果3只腫瘤兔中鑄型失敗1只，鑄型成功2只。微血管鑄型可直觀顯示正常肌肉和肌肉腫瘤組織微血管的三維分布特征。正常肌肉組織微血管表現(xiàn)為密度較稀疏，分布較均勻，管徑均一，走行自然，呈樹枝狀（圖4）。肌肉腫瘤組織微血管表現(xiàn)為密集，血供豐富；走行紊亂，大多數(shù)走行迂曲呈蛇形，排列紊亂，雜亂無章，分布不均，血管管徑粗細不均，同時可見部分微血管囊狀擴張，部分迂曲狹窄或閉塞，從而構(gòu)成相互吻合的復(fù)雜的血管網(wǎng)、血管叢或血管團等（圖5）。

圖5　肌肉腫瘤組織微血管鑄型圖

3　討　論

微血管生長的正、負調(diào)節(jié)因子的平衡決定了正常組織和腫瘤組織的血管形成［4］。腫瘤血管新生化的主要方式包括血管發(fā)生（vasculogenesis）、血管生成（angiogenesis）、淋巴管生成（lymphangiogenesis）和套疊式生長（intussusceptive growth）。血管的生成過程即微血管床上由內(nèi)皮細胞芽生而產(chǎn)生微血管，缺氧刺激引發(fā)促血管生成因子與抑血管生成因子之間的失衡是主要的始動環(huán)節(jié)，其導(dǎo)致內(nèi)皮細胞增殖、遷移、管型形成，最終新生微血管形成［5-6］。腫瘤組織新生微血管數(shù)目、微血管密度均增多，結(jié)構(gòu)上異常表現(xiàn)為微血管扭曲、擴張、囊性變，以及吻合異常，三維空間分布異常等，以上變化即稱為T-MAP的差異。在腫瘤發(fā)展中瘤細胞異質(zhì)性不斷增加，T-MAP也呈現(xiàn)多樣性，差異性更為明顯。T-MAP異質(zhì)性即是通常所見的T-MAP的多樣性和差異性的統(tǒng)稱［7］。

本研究結(jié)果顯示，腫瘤組織和正常組織微血管構(gòu)筑表現(xiàn)為以下兩方面：（1）在結(jié)構(gòu)和組成方面，從電鏡觀察結(jié)果顯示，正常肌肉組織微血管基底膜完整，由正常的內(nèi)皮細胞圍成，而肌肉腫瘤組織微血管基底膜不完整，由單個幼稚內(nèi)皮細胞圍成，缺乏周細胞或含有復(fù)層化的基底膜和增生的周細胞。Huang等［2］研究也顯示了腫瘤組織微血管的相應(yīng)改變。在形態(tài)結(jié)構(gòu)上，正常組織血管內(nèi)皮層完整光滑，管腔規(guī)則，分布均勻，但腫瘤血管內(nèi)皮層缺失或不完整，基底膜缺乏或中斷，腫瘤血管扭曲變形、動靜脈瘺及盲端形成等血管結(jié)構(gòu)異常多見，可呈腔隙狀、竇狀及樹枝樣等改變［8］。（2）在形態(tài)學(xué)方面，本研究通過血管鑄型技術(shù)對肌肉腫瘤組織和正常肌肉組織三維結(jié)構(gòu)進行了觀察，血管鑄型技術(shù)是標本制作的一項解剖學(xué)的專門技術(shù)［9］，能理想顯示腫瘤及正常組織微血管的二維和三維模型，使微血管結(jié)構(gòu)可視化［10-11］。其方法為向所研究臟器的血管管腔中注入特殊的填充物質(zhì)，待其硬化后將除血管管腔以外的組織分解清除，僅留下管腔的填充物，其能立體、直觀、清晰地顯示血管的形態(tài)、結(jié)構(gòu)、走行的空間立體復(fù)雜關(guān)系。本研究發(fā)現(xiàn)，正常肌肉組織微血管表現(xiàn)較稀疏，呈樹枝狀，走行自然，管徑均一，分布較均勻；而肌肉腫瘤組織微血管密集，走行及排列紊亂、雜亂無章，大多數(shù)走行迂曲呈蛇形，血管內(nèi)徑粗細不等，可同時存在囊狀擴張與迂曲狹窄甚至閉塞的血管，從而構(gòu)成復(fù)雜吻合的血管網(wǎng)及血管團等。本研究結(jié)果與Pabst等［10］研究中顯示的口腔鱗狀細胞癌小鼠移植瘤模型的腫瘤微血管形態(tài)結(jié)果一致，同時與Siemann等［12］描述的腫瘤血管結(jié)構(gòu)是混亂的，缺乏層次結(jié)構(gòu)，血管密度異常，血管輪廓不規(guī)則，有的曲折，有的擴張、有的細長的結(jié)論一致。有研究表明，缺乏為腫瘤細胞提供氧及營養(yǎng)物質(zhì)的正常血管結(jié)構(gòu)可導(dǎo)致腫瘤的浸潤性生長，使腫瘤細胞群啟動其自己的結(jié)構(gòu)和功能異常血管網(wǎng)［13］。

本研究應(yīng)用血管鑄型技術(shù)獲得了兔VX2肌肉腫瘤組織和正常肌肉組織的微血管特異性三維構(gòu)筑模型，為了解其特征性圖像找到了解剖形態(tài)學(xué)依據(jù)，證明兔VX2肌肉腫瘤組織與正常肌肉組織的微血管構(gòu)筑存在顯著差異，通過電鏡及微血管鑄型可以清晰地顯示和識別，對兔肌肉腫瘤組織微血管構(gòu)筑表型治療后正?；芯看蛳铝艘欢ǖ膶嶒灮A(chǔ)。

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Study on microvasculature morphology from rabbit VX2 tumor tissue and normal tissue*

Huang Zejun1，Li Rui2△，Sun Jiansen3，Ding Jun2（1.Department of Ultrasonography，Chongqing Municipal Tumor Research Institute，Chongqing 400030，China；2.Department of Ultrasonography，Southwest Hospital，Third Military Medical University，Chongqing 400038，China；3.Teaching and Researching Section of Anatomy，Department of Basic，Third Military Medical University，Chongqing 400038，China）

ObjectiveTo observe the morphological characteristics of microvasculature in rabbit VX2 muscle tumor and normal muscular tissue.MethodsThe VX2 muscle tumor model was established by the canalled tissue mass embedding method. The electron microscopy and microvascular casting techniques were used to observe the microvascular morphologic characteristics of normal muscular and muscle tumor.Results（1）The VX2 muscle tumor model rabbit was successfully established by the canalled tissue mass embedding method with a success rate of 100%.（2）The microvascular inner diameter of normal muscular tissue observed by the electron microscopy was more uniform，the thickness of basement membrane was uniform with intact intima，the endothelial cells and perithelial cells were tightly adhered with the basement membrane.However，the microvascular diameter in tumor tissue was uneven，the vessel lumen was mostly expanded with cystic change，thin and uneven basement membrane，loose attachment between endothelial cells and basement membrane，and partial separation.（3）The microvascular casting directly showed the three-dimensional microvascular features of the normal muscle and tumor tissue.The microvascular density in normal muscle tissue was relatively sparse with uniform distribution and natural course like branches，whereas the microvessels in the tumor tissue were intensive with structural distortion and ununiform distribution，the majority of courses showed tortuous with snakelike and distributed unevenly，the part showed the cystic dilation，the part was tortuous and narrow，or the both coexisted and anastomosed into complex vascular network and vascular mass.ConclusionThe morphological characteristics of microvasculature from rabbit VX2 muscle tumor tissue and normal muscle tissue have a significant difference.

Neoplasms，muscle tissue；Neoplasms，experimental；Neoplasms/pathology；Tissue embedding；Capillaries/ultrastructure；Microvascular architecture；Rabbits

10.3969/j.issn.1009-5519.2016.13.004

A

1009-5519（2016）13-1964-03

國家自然科學(xué)基金資助項目（30770563）。

黃澤君（1981-），碩士研究生，主治醫(yī)師，主要從事腫瘤超聲診斷工作。

△，E-mail：raylee-7991@yahoo.com.cn。

（2016-03-03）