郭向華，黎華輝，周　聯(lián)，羅　霞，典靈輝，郭潤華（.廣東醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，廣東 東莞53808；.廣州中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，廣東廣州50006；3.解放軍第四一一醫(yī)院干部病房科，上海0008）

HMGB1表達(dá)水平對實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎小鼠Th1/Tc1細(xì)胞反應(yīng)的影響*

郭向華1，黎華輝1，周聯(lián)2，羅霞2，典靈輝1，郭潤華3△（1.廣東醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，廣東 東莞523808；2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，廣東廣州510006；3.解放軍第四一一醫(yī)院干部病房科，上海200081）

目的觀察高遷移率族蛋白B1（HMGB1）的表達(dá)水平對實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎小鼠輔助性T細(xì)胞1/細(xì)胞毒性T細(xì)胞1（Th1/Tc1）細(xì)胞反應(yīng)的影響。方法將BALB/C小鼠分為乙醇對照組、模型組和丙酮酸乙酯（EP）干預(yù)組，后兩組采用2，4，6-三硝基苯磺酸（TNBS）灌腸建立小鼠結(jié)腸炎模型。每天進(jìn)行疾病活動指數(shù)（DAI）評分，于造模后第7天處死小鼠，觀察結(jié)腸組織病理學(xué)損傷情況；流式細(xì)胞術(shù)分析脾臟、腸系膜淋巴結(jié)Th1/Tc1細(xì)胞比例的變化，酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）法檢測血清和結(jié)腸組織中HMGB1、干擾素γ（IFN-γ）的表達(dá)水平。結(jié)果與乙醇對照組比較，模型組小鼠DAI評分、鏡下組織病理學(xué)損傷評分均明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；同時，外周血和結(jié)腸組織中HMGB1、IFN-γ水平，脾臟、腸系膜淋巴結(jié)中Th1/Tc1細(xì)胞比例也明顯高于乙醇對照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。與模型組比較，EP干預(yù)治療1周后，EP干預(yù)組小鼠血清和結(jié)腸組織HMGB1水平明顯降低，DAI評分下降，鏡下組織病理損傷明顯減輕，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；伴隨脾臟、腸系膜淋巴結(jié)Th1/Tc1細(xì)胞比例的下降，血清和結(jié)腸組織中IFN-γ水平降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.01）。結(jié)論HMGB1可作為內(nèi)源性免疫刺激劑誘導(dǎo)促進(jìn)Th1/Tc1細(xì)胞反應(yīng)亢進(jìn)，進(jìn)而參與實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎小鼠的致病。

結(jié)腸炎；HMGB1蛋白質(zhì)；Th1細(xì)胞；T淋巴細(xì)胞，細(xì)胞毒性；干擾素Ⅱ型；三硝基苯磺酸；小鼠

潰瘍性結(jié)腸炎（ulcerative colitis，UC）與克羅恩病（Crohn′s disease，CD）同屬于炎癥性腸病（inflammatory bowel disease，IBD），為一組病因未明、發(fā)病機(jī)制尚不清楚的慢性復(fù)發(fā)性腸道炎癥疾病，現(xiàn)已證實(shí)其容易誘發(fā)結(jié)直腸癌［1-2］。該病近年在我國呈高發(fā)趨勢，但目前臨床尚缺乏有效的治療手段。因此，深入研究其發(fā)病機(jī)制并尋求更有效的治療途徑是目前最緊迫的任務(wù)。

盡管IBD的發(fā)病機(jī)制不十分明了，但免疫機(jī)制紊亂一直是該病的研究熱點(diǎn)［1］，輔助性T細(xì)胞1/輔助性T細(xì)胞2（Th1/Th2）細(xì)胞比例失衡已是被廣泛認(rèn)可的發(fā)病機(jī)制之一。通常認(rèn)為，CD是以Th1細(xì)胞介導(dǎo)的免疫損傷為主，而UC是Th2細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥性疾病［1-2］。近年來有研究發(fā)現(xiàn)，炎性細(xì)胞因子——高遷移率族蛋白B1 （high mobility group box-1 protein，HMGB1）可通過激活抗原呈遞細(xì)胞（antigen presenting cell，APC）表面的相應(yīng)受體，參與Th1、Treg CD4+T細(xì)胞的分化調(diào)控［3-4］。既往的研究結(jié)果顯示，HMGB1與IBD的發(fā)病過程密切相關(guān)［5-6］，但具體機(jī)制尚不清楚。HMGB1、Th1細(xì)胞均參與了IBD的致病，而HMGB1是否通過調(diào)控Th1細(xì)胞的活化增殖參與IBD致病目前尚鮮見相關(guān)報(bào)道，因而值得深入研究。本研究以2，4，6-三硝基苯磺酸 （trinitrobenzenesul fonic acide，TNBS）誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎為基礎(chǔ)，應(yīng)用HMGB1的高效抑制劑——丙酮酸乙酯（ethyl pyruvate，EP）進(jìn)行體內(nèi)干預(yù)，探討IBD發(fā)病中HMGB1對Th1/Tc1（細(xì)胞毒性T細(xì)胞1）的調(diào)控作用及其分子機(jī)制，為進(jìn)一步揭示IBD的發(fā)病機(jī)制及新型藥物的研發(fā)提供理論基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1動物、藥品及試劑無特定病原體級（SPF級）BALB/C小鼠30只，均為雌性，6～8周齡，體質(zhì)量18～22g，購自廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心；2.5%TNBS（美國Sigma公司產(chǎn)品），用無水乙醇1∶1混勻稀釋而成；EP（美國Sigma公司）以乳酸林格液配置成所需濃度；乳酸鈉林格注射液購自安徽雙鶴有限公司；小鼠干擾素γ（interfer on-γ，IFN-γ）、小鼠HMGB1 ELISA試劑盒購自杭州聯(lián)科生物技術(shù)有限公司；單克隆抗體PE-Cy7抗小鼠CD3、APC抗小鼠CD8a、PE抗小鼠CD69、PE-Isotype Control、PE抗小鼠IFN-γ購自美國eBioscience公司；BD FACSCanto流式細(xì)胞儀購自美國BD公司。

1.2方法

1.2.1造模、給藥及標(biāo)本采集將30只BALB/C小鼠分為乙醇對照組、模型組和EP干預(yù)組，每組10只。各組動物禁食24 h，水合氯醛麻醉后，用灌胃針從肛門插入至腸內(nèi)4 cm，除乙醇對照組灌注50%乙醇100 μL外，其余動物注入2.5%TNBS 100 μL灌腸造模，注入藥液后均倒置60 s，然后放回籠中飼養(yǎng)。造模8 h后開始給藥，EP干預(yù)組每天按100 mg/kg腹腔注射EP溶液，乙醇對照組和模型組每天腹腔注射等量乳酸林格液。造模后第7天處死動物，收集血清及結(jié)腸標(biāo)本以備檢測。

1.2.2疾病活動指數(shù)（disease activity index，DAI）評分按Okayasu等［7］方法，觀察小鼠每天大便性狀（是否成形）、體質(zhì)量變化（較實(shí)驗(yàn)開始時小鼠體質(zhì)量變化百分比）及血便情況，對小鼠進(jìn)行DAI評分。

1.2.3結(jié)腸黏膜病理改變及組織學(xué)損傷指數(shù)（tissues damage index，TDI）評分動物處死后，迅速剖開腹腔，截取病變明顯處結(jié)腸，進(jìn)行蘇木精-伊紅（hematoxylineosinstaining，HE）常規(guī)染色。鏡下觀察組織學(xué)病理變化，分別觀察炎癥細(xì)胞浸潤情況及黏膜受累范圍、程度等組織學(xué)改變，參照文獻(xiàn)［8］評分標(biāo)準(zhǔn)，采用雙盲法進(jìn)行TDI評分。

1.2.4外周血IFN-γ及HMGB1測定采集外周血分離血清，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme linked immunosor bent assay，ELISA）法檢測血清HMGB1、IFN-γ水平，按照試劑盒說明操作。

1.2.5腸組織勻漿上清液中IFN-γ及HMGB1檢測將新鮮結(jié)腸用冷磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）清洗干凈并稱質(zhì)量，然后迅速轉(zhuǎn)入液氮保存。切取200 mg結(jié)腸剪碎后用冰冷生理鹽水制成10%結(jié)腸組織勻漿，離心后提取上清液，ELISA檢測上清液中IFN-γ及HMGB1水平。

1.2.6Th1/Tc1細(xì)胞亞群檢測采用流式細(xì)胞術(shù)標(biāo)本處理方法［9］制備脾臟（spleen，SP）和腸系膜淋巴結(jié)（mesenteric lymph node，MLN）單細(xì)胞懸液，每組各取5只小鼠進(jìn)行測定；使用膜抗體CD3、CD8和內(nèi)標(biāo)抗體IFN-γ界定Th1/Tc1細(xì)胞，即CD3+CD8-IFN-γ+（Th1）/CD3+CD8+IFN-γ+（Tc1）細(xì)胞。數(shù)據(jù)經(jīng)BD FACSCanto流式細(xì)胞儀獲取、處理及分析。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以±s表示，組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)　果

2.1各組小鼠DAI評分及體質(zhì)量變化比較模型組小鼠于造模后第1天出現(xiàn)少動、厭食、大便稀軟，多數(shù)動物出現(xiàn)黏液血便，體質(zhì)量較乙醇對照組明顯下降，而DAI評分則顯著高于乙醇對照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。EP干預(yù)組小鼠造模后也出現(xiàn)不同程度的少動，精神、食欲不佳，稀便或軟便，體質(zhì)量減輕等表現(xiàn)，但在給藥第3天癥狀開始減輕，大便逐漸成形，與模型組比較，體質(zhì)量回升迅速，DAI評分明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。

2.2各組小鼠結(jié)腸黏膜病理改變及TDI評分比較光鏡下見模型組小鼠結(jié)腸黏膜明顯充血、水腫、糜爛及潰瘍，黏膜和黏膜下層有大量淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞浸潤，腺體破壞且結(jié)構(gòu)紊亂，杯狀細(xì)胞減少，其TDI評分顯著高于乙醇對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。而EP干預(yù)組小鼠結(jié)腸黏膜病理損傷明顯改善，表現(xiàn)為黏膜及黏膜下炎癥細(xì)胞浸潤減少，腺體破壞及黏膜充血、水腫減輕，TDI評分較模型組顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表1、圖1。

表1　各組小鼠DAI、TDI評分及體質(zhì)量變化比較（±s）

表1　各組小鼠DAI、TDI評分及體質(zhì)量變化比較（±s）

注：與乙醇對照組比較，aP＜0.01，bP＜0.05；與模型組比較，cP＜0.05。

組別乙醇對照組模型組EP干預(yù)組n　DAI評分（分）　TDI評分（分）　體質(zhì)量（g）10 10 10 0.00±0.00 3.13±0.89a1.02±0.57bc0.00±0.00 9.00±2.11a6.00±1.41bc22.57±1.50 16.85±1.67b19.20±1.37ac

圖1　各組小鼠結(jié)腸黏膜病理改變（HE染色，100×）

2.3各組小鼠血清IFN-γ及HMGB1檢測結(jié)果比較模型組小鼠血清IFN-γ及HMGB1水平較乙醇對照組顯著升高（分別升高3倍之多），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；應(yīng)用EP干預(yù)治療1周后，EP干預(yù)組血清HMGB1水平較模型組下降50%左右，血清IFN-γ水平也較模型組明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。見表2。

表2　各組小鼠血清IFN-γ及HMGB1檢測結(jié)果比較（±s）

表2　各組小鼠血清IFN-γ及HMGB1檢測結(jié)果比較（±s）

注：與乙醇對照組比較，aP＜0.01；與模型組比較，bP＜0.01。

組別乙醇對照組模型組EP干預(yù)組n　IFN-γ（pg/mL）　HMGB1（ng/mL）10 10 10 97.17±15.12 312.37±27.64a176.54±31.89ab1.87±1.05 6.72±1.24a3.24±0.47ab

2.4各組小鼠SP及MLN單細(xì)胞懸液中Th1/Tc1細(xì)胞亞群檢測結(jié)果比較與乙醇對照組比較，模型組小鼠SP 及MLN單細(xì)胞懸液中Th1/Tc1細(xì)胞亞群均有所增加，其中Th1細(xì)胞在SP中升高明顯，Tc1細(xì)胞在MLN中變化突出，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；與模型組比較，EP干預(yù)組小鼠SP及MLN單細(xì)胞懸液中 Th1/Tc1細(xì)胞亞群呈同步降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表3。

表3　各組小鼠SP及MLN單細(xì)胞懸液中Th1/Tc1細(xì)胞亞群檢測結(jié)果比較（±s，%）

表3　各組小鼠SP及MLN單細(xì)胞懸液中Th1/Tc1細(xì)胞亞群檢測結(jié)果比較（±s，%）

注：與乙醇對照組比較，aP＜0.01；與模型組比較，bP＜0.05，cP＜0.01。

組別n SP Th1細(xì)胞　Tc1細(xì)胞MLN Th1細(xì)胞　Tc1細(xì)胞乙醇對照組模型組EP干預(yù)組1.07±0.35 4.42±0.62a2.42±0.25c5 5 5 1.83±0.48 5.54±0.79a3.15±0.56c1.21±0.25 3.47±0.51a1.82±0.25b0.81±0.25 2.66±0.36a1.23±0.23b

2.5各組小鼠結(jié)腸組織勻漿上清液中HMGB1及IFN-γ水平比較與乙醇對照組比較，模型組小鼠結(jié)腸組織勻漿上清液中HMGB1及IFN-γ水平均顯著增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；與模型組比較，EP干預(yù)組小鼠結(jié)腸組織勻漿上清液中HMGB1及IFN-γ水平明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表4。

表4　各組小鼠結(jié)腸組織勻漿上清液中HMGB1及IFN-γ水平比較（±s）

表4　各組小鼠結(jié)腸組織勻漿上清液中HMGB1及IFN-γ水平比較（±s）

注：與乙醇對照組比較，aP＜0.01；與模型組比較，bP＜0.05。

組別乙醇對照組模型組EP干預(yù)組n IFN-γ（pg/mL）HMGB1（ng/mL）5 5 5 115.94±23.58 388.62±24.72a254.20±36.43b0.18±0.02 0.41±0.05a0.23±0.03b

3　討　論

HMGB1是20世紀(jì)70年代在小牛胸腺中鑒定得到的一種核內(nèi)非組蛋白染色體結(jié)合蛋白，因其在凝膠電泳中遷移率快而得名［10］。HMGB1通常主要位于細(xì)胞核內(nèi)，但在一些免疫細(xì)胞活化或?qū)嵸|(zhì)細(xì)胞損傷、死亡時，核內(nèi)的HMGB1即可主動或被動釋放至細(xì)胞質(zhì)乃至細(xì)胞外，一旦進(jìn)入細(xì)胞外即可作為一種重要的炎性細(xì)胞因子，在膿毒癥、急性胰腺炎、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡等重癥炎癥及自身免疫性疾病中發(fā)揮重要作用［11-12］。有研究發(fā)現(xiàn)，IBD小鼠血清及結(jié)腸組織中HMGB1明顯升高，結(jié)腸黏膜病理損傷嚴(yán)重；而HMGB1中和抗體或其抑制劑——EP的應(yīng)用可以明顯減輕腸道炎性反應(yīng)［5-6］。提示HMGB1與IBD的發(fā)病密切相關(guān)，HMGB1可能成為IBD治療的新靶點(diǎn)。

根據(jù)T淋巴細(xì)胞表面分化抗原的不同，可將其分為CD4+細(xì)胞和CD8+細(xì)胞亞群。前者又稱為Th細(xì)胞，后者又稱為Tc細(xì)胞。Th1細(xì)胞屬于CD4+細(xì)胞的一個亞群，以分泌IFN-γ為特征，Th1細(xì)胞過度反應(yīng)可導(dǎo)致遲發(fā)性超敏反應(yīng)和多種自身免疫性疾病。與Th細(xì)胞分化相似，1995年Sad等［13］將能分泌Th1型細(xì)胞因子的CD8+T細(xì)胞命名為Tc1。在很多情況下，由于Tc1和Th1功能相關(guān)，因而常會把Tc1細(xì)胞也稱為Th1樣細(xì)胞。有研究表明，Tc1亞群可通過分泌Th1型細(xì)胞因子在某些炎癥及自身免疫性疾病的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用［14］。本研究采用TNBS/乙醇誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎模型，其腸道組織學(xué)變化趨向于人類的CD，引發(fā)以Th1型為主的免疫炎性反應(yīng)［1］?，F(xiàn)已基本明確，HMGB1可作為內(nèi)源性免疫佐劑通過與APC表面的受體結(jié)合，參與Th1 CD4+T細(xì)胞的分化調(diào)控［3］。然而，HMGB1調(diào)控Th1/Tc1細(xì)胞反應(yīng)是否參與了TNBS結(jié)腸炎小鼠的致病，目前仍鮮見相關(guān)報(bào)道。因此，本研究以TNBS灌腸誘導(dǎo)小鼠結(jié)腸炎為模型，應(yīng)用HMGB1抑制劑——EP進(jìn)行體內(nèi)干預(yù)，探索CD發(fā)病中HMGB1對Th1/Tc1細(xì)胞的調(diào)控作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，TNBS灌腸1周后，模型組小鼠結(jié)腸組織病理損傷嚴(yán)重，其DAI評分、TDI評分均顯著高于乙醇對照組；ELISA法檢測結(jié)果顯示，血清及結(jié)腸組織中HMGB1、Th1型細(xì)胞因子——IFN-γ表達(dá)水平均明顯升高；SP和MLN中Th1/Tc1細(xì)胞也同比升高，提示HMGB1與Th1/Tc1細(xì)胞反應(yīng)均參與介導(dǎo)了CD小鼠的發(fā)病過程，與文獻(xiàn)報(bào)道一致［15-16］。為了驗(yàn)證HMGB1可能是通過調(diào)控Th1/Tc1細(xì)胞反應(yīng)參與TNBS結(jié)腸炎小鼠致病，本研究進(jìn)一步應(yīng)用HMGB1抑制劑——EP進(jìn)行體內(nèi)干預(yù)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，結(jié)腸炎小鼠血清和結(jié)腸組織中HMGB1水平降低的同時，還伴隨結(jié)腸病理損傷的明顯減輕，SP、MLN中Th1/Tc1細(xì)胞下調(diào)，以及血清和結(jié)腸組織中IFN-γ水平降低。表明HMGB1確實(shí)能夠通過促進(jìn)Th1/Tc1細(xì)胞反應(yīng)參與TNBS結(jié)腸炎小鼠的致病。

綜上所述，本研究結(jié)果證實(shí)，HMGB1能夠通過促進(jìn)Th1/Tc1細(xì)胞反應(yīng)參與CD小鼠的發(fā)病過程。其具體機(jī)制可能是：IBD小鼠由于腸道免疫細(xì)胞過度活化，組織細(xì)胞損傷、壞死，使HMGB1主動或被動釋放增加，HMGB1可作為內(nèi)源性免疫激活劑通過活化APC并促使其分泌Th1/Tc1細(xì)胞的誘導(dǎo)因子——IFN-γ或白介素-12等，在其作用下，Th1/Tc1細(xì)胞大量活化、功能亢進(jìn)，進(jìn)而通過介導(dǎo)炎癥瀑布反應(yīng)直接參與IBD的致病。

［1］ Malik TA.Inflammatory bowel disease：historical perspective，epidemiology，and risk factors［J］.Surg Clin North Am，2015，95（6）：1105-1122.

［2］ Munkholm P.Review article：the incidence and prevalence of colorectal cancer in inflammatory bowel disease［J］.Aliment Pharmacol Ther，2003，18（Suppl 2）：S1-5.

［3］Messmer D，Yang H，Telusma G，et al.High mobility group box protein 1：an endogenous signal for dendritic cell maturation and Th1 polarization［J］. J Immunol，2004，173（1）：307-313.

［4］Zhu XM，Yao YM，Liang HP，et al.High mobility group box-1 protein regulate immunosuppression of regulatory T cells through toll-like receptor 4［J］.Cytokine，2011，54（3）：296-304.

［5］Maeda S，Hikiba Y，Shibata W，et al.Essential roles of high-mobility group box 1 in the development of murine colitis and colitis-associated cancer［J］. Biochem Biophys Res Commun，2007，360（2）：394-400.

［6］Davé SH，Tilstra JS，Matsuoka K，et al.Ethyl pyruvate decreases HMGB1 release and ameliorates murine colitis［J］.J Leukoc Biol，2009，86（3）：633-643.

［7］Okayasu I，Hatakeyama S，Yamada M，et al.A novel method in the induction of reliable experimental acute and chronic ulcerative colitis in mice［J］. Gastroenterology，1990，98（3）：694-702.

［8］McCarthy J.Double blind，placebo controlled trial of two probiotic strains in interleukin 10 knockout mice and mechanistic link with cytokine balance［J］.Gut，2003，52（7）：975-980.

［9］Guo X，Guo R，Luo X，et al.Ethyl pyruvate ameliorates experimental colitis in mice by inhibiting the HMGB1-Th17 and Th1/Tc1 responses［J］.Int Immunopharmacol，2015，29（2）：454-461.

［10］Bustin M.Regulation of DNA-dependent activities by the functional motifs of the high-mobility-group chromosomal proteins［J］.Mol Cell Biol，1999，19（8）：5237-5246.

［11］Li G，Wu X，Yang L，et al.TLR4-mediated NF-κB signaling pathway mediates HMGB1-induced pancreatic injury in mice with severe acute pancreatitis［J］.Int J Mol Med，2016，37（1）：99-107.

［12］Tsung A，Tohme S，Billiar TR.High-mobility group box-1 in sterile inflammation［J］.J Intern Med，2014，276（5）：425-443.

［13］Sad S，Marcotte R，Mosmann TR.Cytokine-induced differentiation of precursor mouse CD8+T cells into cytotoxic CD8+T cells secreting Th1 or Th2 cytokines［J］.Immunity，1995，2（3）：271-279.

［14］Delfs MW，F(xiàn)urukawa Y，Mitchell RN，et al.CD8+T cell subsets TC1 and TC2 cause different histopathologic forms of murine cardiac allograft rejection［J］.Transplantation，2001，71（5）：606-610.

［15］Rakoff-Nahoum S，Bousvaros A.Innate and adaptive immune connections in inflammatory bowel diseases［J］.Curr Opin Gastroenterol，2010，26（6）：572-577.

［16］Strober W，F(xiàn)uss I，Mannon P.The fundamental basis of inflammatory bowel disease［J］.J Clin Invest，2007，117（3）：514-521.

Effects of HMGB1 expression level on Th1//Tc1 cellular response in experimental colitis mice*

Guo Xianghua1，Li Huahui1，Zhou Lian2，Luo Xia2，Dian Linghui1，Guo Runhua3△（1.College of Basic Medicine，Guangdong Medical University，Dongguan，Guangdong 523808，China；2.School of Chinese Materia Medica，Guangzhou University of Chinese Medicine，Guangzhou，Guangdong 510006，China；3.Department of Cadre′s Ward，411 Hospital of PLA，Shanghai 200081，China）

ObjectiveTo investigate the expression level of high-mobility group box 1 protein（HMGB1）on helper T1/ cytotoxic T cell 1（Th1/Tc1）in experimental colitis mice.MethodsThe BALB/c mice were randomly divided into ethanol control group，model group and ethyl pyruvate（EP）intervention group.The colitis model in the latter two groups was induced by the enema of 2，4，6-trinitro-benzene sulfonic acid（TNBS）.The disease activity index（DAI）score was daily evaluated.Mice were killed on 7 d after model construction.The colonic tissue pathological damage situation was observed.The flow cytometry was applied to examine the percentages of Th1//Tc1 cells in spleen as well as in mesenteric lymph nodes（MLN）.The blood and colonic tissue expression levels of HMGB1 and IFN-γ were measured by ELISA.ResultsThe DAI and microscopic histopathological damage score in the model group were significantly increased compared with the ethanol control group（P＜0.01）；meanwhile the levels of HMGB1 and IFN-γ in peripheral blood and colonic tissue and the percentages of Th1//Tc1 cells in spleen and MLN were significantly higher than those in the ethanol control group，the differences were statistically significant（P＜0.01）.After 1 week EP intervention，the HMGB1 level in serum and colonic tissue in the EP intervention group was significantly decreased，the DAI score was declined and microscopic histopathologic damage was obviously alleviated，the differences were statistically significant（P＜0.05）；with the percentage decrease of Th1/Tci cells in spleen and MLN，serum and colonic tissue IFN-γ expression was decreased，the difference was statistically significant（P＜0.01）.ConclusionHMGB1 may serve as the endogenous immunologic stimulant to induce and promote Th1/Tc1 cell hyperreaction，thus involves in pathogenesis of experimental colitis mice.

Colitis；HMGB1 protein；Th1 cells；T-lymphocytes，cytotoxic；Interferon typeⅡ；Trinitrobenzenesulfonic acid；Mice

10.3969/j.issn.1009-5519.2016.13.007

A

1009-5519（2016）13-1973-03

中央財(cái)政支持地方高校發(fā)展專項(xiàng)資金資助項(xiàng)目［276（2014）］；廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目（2014A020212457）；廣東省中醫(yī)藥局科研基金資助項(xiàng)目（20132209）；廣東醫(yī)科大學(xué)博士啟動基金資助項(xiàng)目（2XB13094）。

郭向華（1972-），博士研究生，講師，主要從事炎癥免疫性疾病的免疫藥理研究。

△，E-mail：370291797@qq.com。

（2016-04-13）