李艷紅，陳梅晞

(1 桂林醫(yī)學(xué)院，廣西桂林 541001;2 桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院)

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銀杏葉提取物對(duì)OSAS繼發(fā)性高血壓大鼠的治療作用及其機(jī)制

李艷紅1，陳梅晞2

(1 桂林醫(yī)學(xué)院，廣西桂林 541001;2 桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院)

目的探討銀杏葉提取物(GBE)對(duì)阻塞性睡眠呼吸暫停綜合征(OSAS)繼發(fā)性高血壓大鼠的治療作用及其機(jī)制。方法 參考羅熒荃的經(jīng)典造模方法設(shè)立大鼠間歇缺氧(IH)模型。將30只Wistar大鼠隨機(jī)分為常氧對(duì)照(NC)組、IH組、GBE治療(IH+GBE)組，實(shí)驗(yàn)前及實(shí)驗(yàn)后第3、6、9周監(jiān)測(cè)血壓及生理狀態(tài)變化，9周后提取各組腎周前脂肪細(xì)胞并鑒定，用MTT法檢測(cè)12.5、25、50、100、200、400 mg/L的GBE作用3、6、12、24 h后的細(xì)胞活力及增殖率；提取IH組前脂肪細(xì)胞，將其分為缺氧對(duì)照組(IH組)、LPS刺激缺氧組(LPS組)、GBE治療缺氧組(GBE組)，12 h后ELISA法檢測(cè)上清液中炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-6。結(jié)果 ①I(mǎi)H組與NC組比較大鼠尾動(dòng)脈血壓隨著缺氧時(shí)間而增加(P<0.05或<0.01)，IH+GBE組隨著缺氧時(shí)間的延長(zhǎng)血壓維持在正常水平；②GBE在一定程度上能促進(jìn)大鼠前脂肪細(xì)胞生長(zhǎng), 呈劑量、時(shí)間依賴(lài)性(P均<0.05)；③與IH組比較，LPS組上清液中TNF-α、IL-1β、IL-6水平明顯升高，GBE組顯著降低(P均<0.01)。結(jié)論 GBE對(duì)OSAS引起的高血壓大鼠有治療作用；其可能通過(guò)促進(jìn)前脂肪細(xì)胞增殖、抑制脂肪細(xì)胞因子水平，改善OSAS炎癥程度而起作用的。

阻塞性睡眠呼吸暫停綜合征；高血壓；銀杏葉提取物；脂肪細(xì)胞；炎性因子；大鼠

阻塞性睡眠呼吸暫停綜合征(OSAS)作為難治的慢性呼吸系統(tǒng)炎性疾病[1]，是繼發(fā)性高血壓的高危因素，其機(jī)制可能是反復(fù)間歇性缺氧(IH)引起細(xì)胞缺氧再灌注損傷，并觸發(fā)促炎基因的大量表達(dá)，加重血管內(nèi)皮和功能損害，從而引起患者高血壓發(fā)生[2]，目前臨床上尚無(wú)較好的治療方案。肥胖為OSAS和高血壓的危險(xiǎn)因素，三者之間形成惡性循環(huán)，互相加重，嚴(yán)重威脅公眾健康。美國(guó)關(guān)于肥胖和高血壓的相關(guān)性統(tǒng)計(jì)分析指出肥胖是引起高血壓的重要因素[3]。新的研究[4]也表明脂肪細(xì)胞除了存儲(chǔ)能量，還具有內(nèi)分泌及調(diào)節(jié)血壓的功能，如脂肪因子chemerin的過(guò)度合成可引起血管重構(gòu)及炎癥反應(yīng)，與高血壓的發(fā)生密切相關(guān)[5]。由此猜測(cè)脂肪細(xì)胞分泌的炎性因子可能參與了OSAS與高血壓的病理生理過(guò)程。銀杏葉提取物(GBE)現(xiàn)被廣泛用于治療多種心腦肺血管疾病，具有清除自由基、抗脂質(zhì)過(guò)氧化等作用[6]。2014年11月～2015年1月，我們通過(guò)研究GBE對(duì)OSAS大鼠血壓的影響，并分析其對(duì)脂肪細(xì)胞生長(zhǎng)及脂肪細(xì)胞因子的調(diào)控作用，以探討其治療作用及機(jī)制?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1　 材料與方法

1.1材料SPF級(jí)Wistar大鼠30只，雄性，體質(zhì)量120～150 g，由桂林醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)SCXK桂2013-0001,前脂肪細(xì)胞由大鼠腎周脂肪組織提取；GBE(徐州恒凱銀杏制品有限公司)； JXOC-12型低壓氧艙全自動(dòng)控制儀，包括有機(jī)玻璃艙、XF-666型測(cè)氧儀、氮?dú)鈨?chǔ)氣瓶、氧氣儲(chǔ)氣瓶四部分(南京新飛分析儀器制造有限公司)；ALC-NIBP型大鼠尾動(dòng)脈血壓測(cè)量?jī)x(上海奧爾科特生物科技有限公司)；氮?dú)狻⒀鯕?桂林恒盛氣體有限公司)；細(xì)胞培養(yǎng)基、胎牛血清(Hyclone公司)；Ⅰ型膠原酶、胰蛋白酶(Gibco公司)；MTT(Amresco公司)；脂多糖(LPS)、DMSO、油紅O(索萊寶公司)；IBXM紫外分光光度計(jì)(日本島津UV-2401PC)；ELISA試劑盒(華美公司)。

1.2動(dòng)物模型分組及建立參考羅熒荃等[7]的經(jīng)典造模方法，取Wistar大鼠隨機(jī)分為常氧對(duì)照(NC)組、IH組、GBE治療(IH+GBE)組各10只，每天實(shí)驗(yàn)前分別予以對(duì)照組和IH組生理鹽水灌胃，IH+GBE組給予1 mL/kg GBE水溶劑灌胃，1次/d，共9周。實(shí)驗(yàn)期間IH組和IH+GBE組大鼠放置于密閉的玻璃容器中予以8 h循環(huán)向玻璃艙內(nèi)充入氮?dú)?、氧氣，即快速充?0 s的氮?dú)饩S持低氧(6%±0.5%) 30 s后10 s內(nèi)快速充入氧氣維持氧濃度為(21%±0.5%) 30 s，最終以9周后尾動(dòng)脈收縮壓≥150 mmHg提示OSAS合并高血壓造模成功。

1.3大鼠生理狀態(tài)的改變及血壓的監(jiān)測(cè)實(shí)驗(yàn)前及實(shí)驗(yàn)后3、6、9周用無(wú)創(chuàng)血壓記錄儀分別監(jiān)測(cè)各組尾動(dòng)脈血壓的變化情況，并觀察大鼠鼻唇、呼吸等變化情況。

1.4前脂肪細(xì)胞的提取、培養(yǎng)及鑒定采用改良的von Heimburg等[8]方法提取原代前脂肪細(xì)胞:大鼠麻醉后無(wú)菌條件下取出腎周脂肪組織墊，仔細(xì)剔除肉眼可見(jiàn)的血管和纖維，用2 mg/mL的Ⅰ型膠原酶消化90 min至乳糜狀，過(guò)濾、離心收集并沉淀細(xì)胞用于接種培養(yǎng)。油紅O染色鑒定后，取狀態(tài)穩(wěn)定的2、3代前脂肪細(xì)胞長(zhǎng)至70%融合后，加入胰蛋白酶室溫下消化后制成細(xì)胞懸液，用于實(shí)驗(yàn)。大鼠原代前脂肪細(xì)胞12 h即貼壁呈類(lèi)圓形，2 d后呈梭形或多角形，5 d呈漩渦狀或魚(yú)群狀進(jìn)入對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)。成脂誘導(dǎo)后倒置顯微鏡下細(xì)胞內(nèi)可見(jiàn)反光顆粒，可被油紅O染為橘紅色，即可鑒定提取的細(xì)胞為前脂肪細(xì)胞。

1.5前脂肪細(xì)胞存活率的測(cè)算采用MTT比色法。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的前脂肪細(xì)胞懸液，按1×104/孔均勻接種于96孔板中, 基礎(chǔ)培養(yǎng)基處理24 h后棄除廢液，換用無(wú)血清DMED/F 12培養(yǎng)液使細(xì)胞同步化。藥物組濃度梯度為12.5、25、50、100、200、400 mg/L，觀察時(shí)間點(diǎn)為3、6、12、24 h，并設(shè)置不給藥物的細(xì)胞作為對(duì)照組和不含細(xì)胞及藥物的孔作為空白組，每組6個(gè)復(fù)孔。實(shí)驗(yàn)結(jié)束前4 h吸棄舊液，加入含10%的MTT(5 g/L)與無(wú)血清DMEM/F 12培養(yǎng)基混合液200 μL，孵育6 h后棄舊液，每孔加入DMSO 150 μL, 振蕩器上低速振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解。通過(guò)分光光度計(jì)(492 nm)測(cè)定吸光度(A值)，根據(jù)公式計(jì)算細(xì)胞存活率、繪制曲線(xiàn)。存活率=(藥物組A值-空白組A值)/(對(duì)照組A值-空白組A值)。

1.6脂肪細(xì)胞分泌的TNF-α、IL-1β、IL-6檢測(cè)提取IH組大鼠前脂肪細(xì)胞后分為3組：IH組、LPS組、GBE組，LPS組予以1 μg/mL LPS處理12 h，GBE組予以100 mg/L的GBE處理12 h。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后收集各組上清液，按ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)操作檢測(cè)各組細(xì)胞分泌的TNF-α、IL-1β、IL-6水平。

2　結(jié)果

2.1各組生理狀態(tài)比較造模過(guò)程中發(fā)現(xiàn)IH組大鼠嗜睡，睡眠過(guò)程中可聞及類(lèi)似貓喘聲，鼻唇較NC組稍發(fā)紺，并可見(jiàn)呼吸暫停，清醒期飲食及活動(dòng)量減少。IH+GBE組給予GBE期間大鼠生理活動(dòng)與NC組無(wú)明顯差異，飲食、活動(dòng)量正常。

2.2各組不同時(shí)間尾動(dòng)脈血壓比較見(jiàn)表1。

表1　各組不同時(shí)間尾動(dòng)脈血壓比較±s)

注：與NC組比較，#P<0.05；與IH組比較，△P<0.01。

2.3不同時(shí)間不同濃度GBE對(duì)前脂肪細(xì)胞存活率的影響見(jiàn)表2。

表2　不同時(shí)間不同濃度GBE對(duì)前脂肪細(xì)胞存活率的影響±s)

注：相同作用時(shí)間下與0 mg/L GBE比較，*P<0.05；相同藥物濃度下，與3 h比較，△P<0.05。

2.4各組TNF-α、IL-1β、IL-6水平比較見(jiàn)表3。

表3　各組TNF-α、IL-1β、IL-6水平比較

注：與IH組比較，*P<0.01；與LPS組比較，#P<0.01。

3　討論

脂肪細(xì)胞分泌的瘦素、TNF-α、IL-1等多種生物活性物質(zhì)參與了機(jī)體正常的生命活動(dòng)，缺氧可以刺激脂肪細(xì)胞因子的過(guò)度表達(dá)，引起血管內(nèi)皮損傷、胰島素抵抗、炎癥反應(yīng)等[9,10]。OSAS疾病進(jìn)展中肥胖、缺氧、高血壓三者互相作用形成惡性循環(huán)[11]，使臨床治療收效欠佳。有數(shù)據(jù)表明，高血壓患者中OSAS的發(fā)生率可達(dá)50%以上，而有30%的OSAS患者同時(shí)合并高血壓。因此，抑制脂肪細(xì)胞炎性物質(zhì)的過(guò)度分泌是治療OSAS引起高血壓的重要途徑之一。

GBE主要有效成分是黃酮和萜類(lèi)內(nèi)酯，黃酮類(lèi)可以清除自由基、抗脂質(zhì)過(guò)氧化，萜類(lèi)內(nèi)酯與絲裂原活化蛋白激酶可以抑制炎癥反應(yīng)[12]。趙外歐等[13]研究發(fā)現(xiàn)，GBE可以通過(guò)NF-κB信號(hào)通路抑制缺氧引起的血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷。Eckert等[14]研究發(fā)現(xiàn)，黃酮、銀杏內(nèi)酯可以降低阿爾茨海默病的氧化應(yīng)激反應(yīng)。以上研究均提示,GBE可減輕氧化性損傷。本研究發(fā)現(xiàn),OSAS動(dòng)物模型給予GBE治療可以明顯降低高血壓的發(fā)生，在細(xì)胞水平給予GBE可以提高前脂肪細(xì)胞存活率，且呈劑量、時(shí)間依賴(lài)性；可顯著抑制脂肪細(xì)胞炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-6的表達(dá)。提示GBE對(duì)OSAS引起的高血壓有一定的治療作用，這可能是與抑制脂肪細(xì)胞的炎性因子分泌有關(guān)。

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Effect of Ginkgo biloba extract on OSAS rats with secondary hypertension

LIYanhong1,CHENMeixi

( 1GuilinMedicalUniversity,Guilin541001,China)

Objective To investigate the effect and mechanism of Ginkgo biloba extract (GBE) on the obstructive sleep apnea hypoxia syndrome (OSAS) rats with secondary hypertension. MethodsThe intermittent hypoxia (IH) rat models were established. Thirty Wistar rats were randomly divided into the normal oxygen group (NC group), IH group and GBE treatment group (IH+GBE group). We recorded the changes of blood pressure and physiological statement on week 3, 6 and 9. After 9 weeks, the preadipocytes near kidney of each group were extracted and identified, MTT was used to detect the cell viability and proliferation rates of rat preadipocytes which were cultured with 12.5, 25, 50, 100, 200 and 400 mg/L GBE for treatment of 3, 6, 12 and 24 hours. The preadipocytes in the IH groups were extracted and then were divided into the hypoxia control group, LPS-stimulated hypoxia group (LPS group) and GBE-treated hypoxia group (GBE group). After 12 hours, the inflammatory cytokines TNF-α, IL-1β and IL-6 contents in the cell supernatant were detected. Results ① The blood pressure of the IH group was gradually increased with the time of hypoxia as compared with that of the NC group (P<0.05 orP<0.01), and the blood pressure in the IH+GBE group maintained normal with the prolonged time of hypoxia. ② GBE could promote adipocyte′s growth with a dose-time relationship (allP<0.05). ③ The levels of TNF-α, IL-1β and IL-6 in the LSP group were significantly higher, but those were significantly lower in the GBE group (allP<0.01).ConclusionGBE has therapeutical effect on OSAS-induced hypertension, which may be achieved by promoting the proliferation of preadipocytes, inhibiting the levels of adipocytes and improving the degree of OSAS inflammation.

obstructive sleep apnea syndrome; hypertension; Ginkgo biloba extract; adipocyte; inflammatory factor

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(81060009);廣西衛(wèi)生廳重點(diǎn)科研項(xiàng)目(重 2010047);廣西自然科學(xué)基金項(xiàng)目(2013jjAA40386)。

李艷紅(1989-)，女，碩士，主要從事呼吸睡眠研究。E-mail:591952247@qq.com

簡(jiǎn)介：陳梅晞(1962-)，女，副主任醫(yī)師，教授，主要從事睡眠呼吸疾病和慢性阻塞性肺疾病診治。E-mail:chenmx@glmc.edu.cn

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.17.005

R562

A

1002-266X(2016)17-0016-03

2016-01-04)