王慧杰，龐輝，陳萌, 王科，楊瑩，陳相宜

(廣西醫(yī)科大學(xué)，南寧530021)

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螺旋藻激酶對人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞通透性及動脈粥樣硬化大鼠血清黏附因子的影響

王慧杰，龐輝，陳萌, 王科，楊瑩，陳相宜

(廣西醫(yī)科大學(xué)，南寧530021)

目的研究螺旋藻激酶(SPK)對人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞通透性及動脈粥樣硬化大鼠血清黏附因子的影響。方法 體外培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞，采用H2O2建立氧化損傷內(nèi)皮細(xì)胞模型。測定單層細(xì)胞透過率、細(xì)胞外乳酸脫氫酶(LDH)滲出量、細(xì)胞分泌的細(xì)胞間黏附分子 1(ICAM-1)量；采用高脂飼料喂養(yǎng)法建立大鼠動脈粥樣硬化(AS)模型, 同時給予SPK干預(yù),連續(xù)飼養(yǎng)12周。末次給藥后取血,分離血清, ELISA法測定細(xì)胞間黏附分子1(ICAM-1)、血管細(xì)胞黏附分子1(VCAM-1)。結(jié)果體外實驗：SPK可顯著降低氧化損傷造成的單層細(xì)胞通透性，減少細(xì)胞外溢出的LDH和細(xì)胞分泌的ICAM-1(P均<0.05)；體內(nèi)實驗：SPK顯著降低AS模型大鼠血清ICAM-1、VCAM-1水平(P均<0.05)。結(jié)論 SPK可降低血管內(nèi)皮細(xì)胞通透性，減少其釋放黏附因子；降低AS大鼠血清黏附因子，預(yù)防AS。

螺旋藻激酶；血管內(nèi)皮細(xì)胞；動脈粥樣硬化；乳酸脫氫酶；細(xì)胞間黏附分子1；血管細(xì)胞黏附分子1;大鼠

動脈粥樣硬化(AS) 是從血管內(nèi)膜開始的一種常見血管性病變，是引起心腦血管疾病的主要原因，嚴(yán)重威脅人類生命健康[1]。血管內(nèi)皮細(xì)胞(VEC)損傷是AS啟動的起始環(huán)節(jié)，而氧化應(yīng)激被認(rèn)為是血管內(nèi)皮損傷最重要的致病因素[2]。氧化應(yīng)激主要通過氧化作用促進(jìn)局部炎癥反應(yīng)、誘導(dǎo)血管基因改變和參與影響信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑等多方面參與AS的發(fā)生和發(fā)展過程。因此,尋找高效、低毒、價格合理的抗氧化、保護(hù)VEC的藥物是現(xiàn)代醫(yī)藥學(xué)研究的熱點。螺旋藻經(jīng)過發(fā)酵酶化后產(chǎn)生一種具有生物活性的蛋白激酶，稱為螺旋藻激酶(SPK)。前期藥理實驗證明，SPK具有延長大鼠血液凝固和抑制大鼠血栓形成的作用[3]，以及對體外培養(yǎng)腎上腺素?fù)p傷模型的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECS)具有一定的保護(hù)作用[4]。2015年1～9月，本實驗通過H2O2建立氧化損傷內(nèi)皮細(xì)胞模型，通過測定單層細(xì)胞透過率、細(xì)胞培養(yǎng)液乳酸脫氫酶(LDH)滲出量、內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)液中細(xì)胞間黏附分子1(ICAM-1)含量，觀察SPK對單層細(xì)胞通透性的影響；通過復(fù)制大鼠AS模型，觀察SPK對AS模型大鼠血清中ICAM-1、血管細(xì)胞黏附分子1(VCAM-1)含量的影響，觀察SPK對VEC的通透性及其分泌的黏附因子的影響，推測其抗AS的作用。

1　材料與方法

1.1材料動物：SD大鼠，雄性，體質(zhì)量220～250 g,由廣西醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供，動物合格證號:桂動許字(2000)第001號，實驗室溫度控制在20～25 ℃。細(xì)胞株：人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞細(xì)胞系(HUVEC304)購自美國ScienCell公司。主要試劑：SPK發(fā)酵提取物粉劑，由廣西北海市康福保健食品有限公司提供，SPK：螺旋藻發(fā)酵物粉劑進(jìn)行水提，低溫離心收集上清液，硫酸銨分級鹽析收集沉淀，經(jīng)超純水透析，凝膠柱層析，凍干保存?zhèn)溆?，得到的SPK，比活達(dá)2 631 IU/mg[5]；RPMI1640培養(yǎng)基購自美國GIBCO公司；胎牛血清購自美國GIBCO公司；Trypsin1∶250 購自美國Amerco公司；辛伐他汀片(10C140907)購自涿州東樂制藥有限公司；維生素D3(121203)購自上海通用藥業(yè)股份有限公司。人ICAM-1試劑盒，大鼠ICAM-1、VCAM-1試劑盒購自武漢華美生物工程有限公司。主要儀器：美國Thermo 3111二氧化碳培養(yǎng)箱；蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司超凈工作臺；日本Olympus 倒置顯微鏡；日本島津紫外可見分光光度計；SIGMA公司3K15型高速冷凍離心機；美國伯樂酶標(biāo)儀；上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠電熱恒溫干燥箱。

1.2體外細(xì)胞實驗

1.2.1分組及處理正常對照組：正常培養(yǎng)細(xì)胞，實驗中不添加任何除培養(yǎng)細(xì)胞需要的培養(yǎng)液之外的干擾試劑；損傷組：在細(xì)胞培養(yǎng)系中加終濃度為2 mmol/L H2O2共培養(yǎng)4 h；陽性對照組：在細(xì)胞培養(yǎng)系中預(yù)先用終濃度為10 μg/mL維生素E預(yù)處理12 h，再加終濃度為2 mmol/L H2O2，繼續(xù)共培養(yǎng)14 h；SPK低、中、高劑量組:在細(xì)胞培養(yǎng)系中分別預(yù)先用終濃度為1、2、3 mg/mL SPK預(yù)處理12 h，再加終濃度為2 mmol/L H2O2，繼續(xù)共培養(yǎng)4 h。各組細(xì)胞處理結(jié)束后，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液，-20 ℃冷凍保存待測。

1.2.2內(nèi)皮細(xì)胞單層通透模型的建立采用Transwell小室。按試劑盒操作方法在Transwell小室培養(yǎng)HUVECS，陽性對照組和SPK各組按實驗分組分別加入維生素E和不同濃度SPK共培養(yǎng)12 h。隨后除正常對照組外，各組加2 mmol/L H2O2溶液刺激4 h后,每孔吸去頂層小室液體，重新加入l mg/mL牛血清白蛋白200 μL，培養(yǎng)箱孵育45 min。在頂層小室和下層孔內(nèi)各取樣品100 μL，考馬斯蛋白定量試劑盒檢測蛋白濃度。單層內(nèi)皮細(xì)胞對白蛋白通透性的大小用通透系數(shù)T表示，按以下公式計算: T=(C下×L下)/(t×A×C上)[注：其中C下為底層孔內(nèi)白蛋白濃度，L下為底層小室液體量，t為時間，A為濾膜面積，C上為頂層小室白蛋白濃度。

1.2.3細(xì)胞外培養(yǎng)上清LDH及ICAM-1的測定通過比色法測定丙酮酸含量推算出LDH的活力。按照試劑盒的操作步驟依次加入所用試劑后，在波長450 nm下測OD值，按說明書計算公式：細(xì)胞培養(yǎng)液LDH的含量=OD測定管/OD標(biāo)準(zhǔn)管×標(biāo)準(zhǔn)管濃度×1 000。ICAM-1的測定采用ELISA法。取100 μL收集的上清液，檢測步驟按試劑盒說明書，在酶標(biāo)板內(nèi)依次加入試劑，顯色后酶標(biāo)儀450 nm測OD值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的OD值和濃度使用CurveExpert 1.4軟件繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，選擇R2值最大的公式，代入OD值，計算培養(yǎng)上清液中的ICAM-1含量。

1.3體內(nèi)實驗

1.3.1動物分組、模型制備及處理方法健康成年雄性SD大鼠78只，隨機分為6組，每組13只，空白對照組普通飼料喂養(yǎng)。模型組，陽性對照組，SPK低、中、高劑量組給予高脂飼料喂養(yǎng)(高脂飼料配方：3%膽固醇，0.2%丙基硫氧嘧啶，0.9%膽酸鈉，10%豬油，5%白糖,80.9%基礎(chǔ)飼料)[6]12周，建立動脈粥樣硬化(AS)模型。第1周每只大鼠按600 000 U/kg的總劑量腹腔注射維生素D3, 分 3 d給完,第3、6、9周一次性給予10萬U/kg維生素D3,空白對照組腹腔注射等體積注射用油，每組動物單獨喂養(yǎng)，自由飲食、飲水。給藥：空白對照組、模型組給予蒸餾水2 mL每天灌胃1次；陽性對照組給予辛伐他汀，按照5 mg/kg藥物灌胃給藥；SPK低、中、高劑量組按照SPK 80、160、320 U/kg每天灌胃給藥1次，每組動物灌胃液體量均為2 mL,連續(xù)飼養(yǎng)12周。于12周末，大鼠空腹12 h， 10%水合氯醛麻醉，腹主動脈取血，常溫靜置30 min,離心10 min(3 000 r/min),取血清分裝保存于超低溫(-80 ℃)冰箱待測。由于飼養(yǎng)過程中陽性對照組動物死亡3只，其余組死亡小于3只，每組選取10只作為樣本檢測。

1.3.2血清ICAM-1、VCAM-1檢測采用ELISA法。取100 μL大鼠血清，檢測步驟按試劑盒說明書，在酶標(biāo)板內(nèi)依次加入試劑，顯色后酶標(biāo)儀450 nm測OD值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品OD值和標(biāo)準(zhǔn)品濃度使用CurveExpert 1.4軟件繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，選擇R2值最大的公式，代入OD值，計算血清中的ICAM-1、VCAM-1量。

2　結(jié)果

2.1各組細(xì)胞T及LDH、ICAM-1水平比較與正常對照組相比，損傷組細(xì)胞T升高了6倍以上；與損傷組比較，陽性對照組則使通透性減少了60%以上，SPK各濃度組對氧化造成的細(xì)胞通透性增強表現(xiàn)出明顯的抑制作用，且這種作用隨藥物濃度的增大而增強(P均<0.05)。與正常對照組相比，損傷組細(xì)胞外滲出LDH水平明顯升高, ICAM-1分泌量增多(P均<0.05)；與損傷組比較，陽性對照組和SPK各劑量組細(xì)胞外LDH、ICAM-1均降低，且此趨勢與SPK的濃度呈劑量依賴關(guān)系(P均<0.05)。見表1。

表1　各組細(xì)胞T及LDH、 ICAM-1水平比較

注：與正常對照組比較，aP<0.05；與損傷組比較，bP<0.05。

2.2各組血清ICAM-1、VCAM-1水平比較與模型組比較，SPK高、中、低劑量組血清ICAM-1、VCAM-1水平均降低，高劑量SPK可將ICAM-1降至正常水平(P<0.05或<0.01)。見表2。

表2 各組血清ICAM-1和VCAM-1水平比較

注：與空白對照組相比，*P<0.05 ，**P<0.01；與模型組相比，#P<0.01。

3　討論

VEC是位于循環(huán)血液與血管壁內(nèi)皮下組織間的單層細(xì)胞,覆蓋于整個血管網(wǎng)的內(nèi)表面，是血管壁組織和血液之間的第一道屏障,直接與循環(huán)的血液接觸。VEC不僅是一個選擇性通透的保護(hù)膜，防止血液成分對平滑肌細(xì)胞的過度作用，而且是重要的分泌器官和效應(yīng)器官，參與多種與血管有關(guān)的生理和病理過程，它對心血管功能的正常發(fā)揮具有重要的調(diào)節(jié)作用。VEC功能障礙是AS、高血壓、心力衰竭等多種血管性疾病發(fā)病的重要環(huán)節(jié)[7]。VEC易受到血液中活性物質(zhì),特別是自由基、脂質(zhì)過氧化物的影響，而活性氧自由基是VEC損傷的主要原因[8]。H2O2是一種強氧化劑，可直接作用于細(xì)胞膜脂質(zhì),造成脂質(zhì)過氧化反應(yīng),損傷細(xì)胞膜。損傷的VEC出現(xiàn)功能紊亂,可導(dǎo)致血小板、炎性細(xì)胞活化且黏附率上升；另外VEC受活性氧物質(zhì)攻擊而發(fā)生功能失常，還表現(xiàn)在細(xì)胞間粘連接等結(jié)構(gòu)破壞, 受損的VEC表達(dá)多種細(xì)胞黏附分子，其中ICAM-1和VCAM-l是活化VEC和巨噬細(xì)胞表面的兩種主要的黏附分子[9]。黏附分子可吸引、募集單核細(xì)胞黏附，增加氧化低密度脂蛋白產(chǎn)生，間接產(chǎn)生致炎效應(yīng)；黏附分子表達(dá)的增加還可促進(jìn)血中單核細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞黏附于受損內(nèi)皮表面并進(jìn)入內(nèi)皮下；單核細(xì)胞分化為巨噬細(xì)胞，巨噬細(xì)胞攝取脂蛋白變?yōu)榕菽?xì)胞,大量的泡沫細(xì)胞堆積最終形成AS[10]。本實驗通過體外培養(yǎng)建立H2O2造成的內(nèi)皮細(xì)胞氧化損傷模型。H2O2損傷的VEC表達(dá)黏附分子，黏附分子介導(dǎo)炎癥細(xì)胞黏附于血管內(nèi)皮，并穿過內(nèi)皮細(xì)胞層最終沉積于內(nèi)膜下，細(xì)胞單層通透性增強，使細(xì)胞內(nèi)的LDH釋放到細(xì)胞外，細(xì)胞培養(yǎng)液中 LDH活性增加[11]；LDH活性的高低是反映細(xì)胞受損傷程度非常靈敏的指標(biāo)。本研究結(jié)果顯示，經(jīng)過SPK干預(yù)的氧化受損后的VEC T明顯降低，SPK使細(xì)胞培養(yǎng)液上清的LDH活性明顯降低，ICAM-1表達(dá)減少。因此SPK可減少H2O2對體外培養(yǎng)HUVECS的氧化損傷。

AS是一種慢性炎癥性疾病,是血管壁對各種損傷的一種異常反應(yīng),具有經(jīng)典炎癥變性、滲出及增生的特點[12]。本研究中，我們采用高脂飼料聯(lián)合維生素D3復(fù)制大鼠AS模型，單純高脂飲食可導(dǎo)致大鼠血清中ICAM-1和VCAM-l表達(dá)增加，給予SPK聯(lián)合高脂飲食飼養(yǎng)大鼠，可降低由于高脂飲食引起的ICAM-1和VCAM-l含量的增加。而且SPK高劑量組的作用效果明顯優(yōu)于中、低劑量組, 能起到更好的抑制黏附分子表達(dá)的作用，提示SPK能顯著降低AS大鼠血清中ICAM-1和VCAM-l含量，預(yù)防其進(jìn)展。

綜上，SPK可以通過對抗內(nèi)皮細(xì)胞氧化損傷，明顯降低氧化損傷造成的VEC通透性，維持內(nèi)皮細(xì)胞屏障作用，提高細(xì)胞抗氧化能力，減少VEC黏附因子的表達(dá)，對抗炎癥反應(yīng)的發(fā)生，進(jìn)而來實現(xiàn)預(yù)防AS發(fā)生發(fā)展的作用。

[1] 殷亞昕，劉潤梅，翟紅霞，等．不同飼料聯(lián)合維生素 D3建立大鼠動脈粥樣硬化模型的比較[J].中國康復(fù)理論與實踐，2010，16(12):1134-1136．

[2] De Caterina R, Massaro M, Scoditti E, et al. Pharmacological modulation of vascular inflammation in atherothrombosis [J]. Ann N Y Acad Sci, 2010,1207:23-31.

[3] 龐輝，李小花，陳高斯，等.螺旋藻激酶對大鼠動靜脈環(huán)路血栓的溶栓作用研究 [J].時珍國藥國藥，2010，21(4)：908-909.

[4] 趙杰，肖云曉，龐輝，等.螺旋藻激酶對人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞t-PAmRNA、PAI-1mRNA表達(dá)的影響[J].時珍國醫(yī)國藥，2012，23(6)：1471-1473.

[5] 肖云曉,陳高斯，龐輝.螺旋藻激酶分離提純方法初探[J].時珍國藥國藥，2011，22(6):1399-1400.

[6] 趙娟，李相君，孫波.維生素D3聯(lián)合高脂飼料建立大鼠動脈粥樣硬化模型[J].實用醫(yī)學(xué)雜志，2009,25(21):3569.

[7] Nakayama M, Nakamura J, Hamada Y, et al. Aldose reduetase inhibition ameliorates pupillary light reflex and F-wve latency in patients with mild diabetic neuropathy[J]. Diabetes Care, 2001,24(6):1093-1098.

[8] Kapitonova MY, Muid S, Froemming GR, et al. Real space flight travel is associated with ultrastructuralchanges, cytoskeletal disruption and premature senescence of HUVEC[J]. Malays J Pathol, 2012,34(2):103-113.

[9] Collins RG, Velji R, Guevara NV, et al. P-Selectin or intercellular adhesion molecule (ICAM)-ldeficiency substantially protects against atherosclerosis in apolipoprotein E-deficient mice[J]. J Exp Med, 200,191(1):189-194.

[10] Ichiki T, Funakoshi Y, Ito K, et al. Expression of monocyte chemoattractant protein-1 by nonenzymatically glycated albumin (Amadori adducts) in vascular smooth muscle cells [J]. Biochem Biophys Res Commun, 2000,269(3):666-670.

[11] Olah G, Modis K, Gero D, et al. Cytoprotective effect of gamma-tocopherol against tumor necrosis factor alpha induced cell dysfunction in L929 cells [J]. Int J Mol Med, 2011,28(5):711-720.

[12] 劉俊田.動脈粥樣硬化發(fā)病的炎癥機制的研究進(jìn)展[J].西安交通大學(xué)學(xué)報,2015,3(2):141-152.

Effects of spirulinakinase on permeability and adhesion molecules of vascular endothelial cells

WANGHuijie1,PANGHui,CHENMeng,WANGKe,YANGYing,CHENXiangyi

(1GuangxiMedicalUniversity,Nanning530021,China)

ObjectiveTo investigate the effects of spirulinakinase (SPK) on the cell permeability and the adhesion molecules of vascular endothelial cells, and serum adhesion molecules of atherosclerosis (AS) rats. MethodsThe human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) were cultured in vitro, and then were induced by hydrogen peroxide (H2O2) to establish the oxidative damage endothelial cell models. We determined the permeability rate (T) of monolayer cell and lactate dehydrogenase (LDH) seepage and intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1). The rat AS model was established by high-fat diet, and different doses of spirulina kinase (SPK) were given by gavage. After 12 weeks, rats were killed and the blood serum was collected to measure ICAM-1 and vascular cell adhesion molecule-1 (VCAM-1) by ELISA. ResultsSPK significantly reduced the oxidative damage-induced permeability of monolayer cell, and the leakage of LDH and the secreted ICAM-1 were decreased in vitro experiment (allP<0.05); SPK significantly reduced the levels of ICAM-1 and VCAM-1 in the serum of AS model rats in vivo experiment (allP<0.05). ConclusionSPK can decrease the permeability of vascular endothelial cells and reduce the release of adhesion molecules; SPK can decrease the adhesion molecules in serum of AS rats to prevent AS.

spirulinakinase; vascular endothelial cells; lactate dehydrogenase; intercellular adhesion molecule-1; vascular cell adhesion molecule-1; rafs

廣西壯族自治區(qū)自然科學(xué)基金項目(2013GXNSFAA019176)。

王慧杰(1988-)，女，碩士,研究方向為海洋藥物及心血管保護(hù)機制研究。E-mail:347920956@qq.com

簡介：龐輝(1962-)，女，教授，碩士生導(dǎo)師,研究方向為海洋藥物及心血管保護(hù)機制研究。E-mail:454720524@qq.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.17.003

R972.6

A

1002-266X(2016)17-0009-04

2016-01-28)