楊蕾,劉海龍，張斌，湯建民

(鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院，鄭州450000)

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瑞舒伐他汀對(duì)急性心肌梗死大鼠心肌細(xì)胞凋亡的抑制作用及其機(jī)制

楊蕾,劉海龍，張斌，湯建民

(鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院，鄭州450000)

目的探討瑞舒伐他汀對(duì)急性心肌梗死(AMI)大鼠心肌細(xì)胞凋亡的抑制作用及其機(jī)制。方法 從60只SD雄性大鼠中隨機(jī)抽取10只作為對(duì)照組，只分離不結(jié)扎前降支，余下的50只分別結(jié)扎其前降支制作AMI模型。24 h后存活的41只隨機(jī)分為3組，分別為AMI組13只、Statin1組14只、Statin2組14只。術(shù)后第1天起，Statin1、2組分別給予瑞舒伐他汀1.5、3.0 mg/(kg·d)灌胃,對(duì)照組及AMI組分別以等量的生理鹽水灌胃。4周后TUNEL法染色檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)(AI)，免疫組化法檢測(cè)線粒體融合蛋白2(Mnf2)表達(dá)，免疫印跡法檢測(cè)磷酸化Akt(p-Akt)表達(dá)，并進(jìn)行比較。結(jié)果與對(duì)照組相比，AMI組及Statin1、Statin2組心肌細(xì)胞AI升高，p-Akt表達(dá)下降，Mnf2表達(dá)增加(P均<0.05)；與AMI組相比，Statin1、Statin2組心肌細(xì)胞AI和Mnf2表達(dá)均顯著降低(P均<0.05)，而p-Akt表達(dá)增高(P<0.05)，且Statin2組較Statin1組變化更為顯著(P<0.05)。結(jié)論 瑞舒伐他汀可抑制大鼠AMI后的細(xì)胞凋亡，其作用可能與下調(diào)Mnf2的表達(dá)有關(guān)，且呈一定劑量依賴性。

急性心肌梗死;細(xì)胞凋亡;線粒體融合蛋白2; Ras-PI3K/Akt；瑞舒伐他汀;大鼠

急性心肌梗死(AMI)后壞死心肌介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，在促進(jìn)壞死心肌修復(fù)愈合的同時(shí)，也加速心肌的重構(gòu)并通過細(xì)胞因子的級(jí)聯(lián)效應(yīng)導(dǎo)致心肌細(xì)胞凋亡。線粒體融合蛋白2(Mfn2)是線粒體外膜上的一種跨膜蛋白，其可能通過激活線粒體凋亡途徑，或抑制Ras-磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)-蛋白激酶B (PKB)通路，誘導(dǎo)心肌細(xì)胞發(fā)生凋亡[1]。他汀類藥物除抑制甲羥戊酸合成，還可抑制類異戊二烯的生成，影響Ras-PI3K/Akt通路，發(fā)揮其調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡、改善血管內(nèi)皮功能、抗血小板、調(diào)脂、抗動(dòng)脈粥樣硬化等作用[2]。本實(shí)驗(yàn)于2015年4～10月建立大鼠AMI模型，研究瑞舒伐他汀對(duì)AMI大鼠心肌細(xì)胞凋亡的抑制作用，并探討其作用機(jī)制。

1　材料與方法

1.1材料健康成年SPF級(jí)SD雄性大鼠60只，體質(zhì)量250～300 g，購自山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。試劑及藥品：Mfn2兔多克隆抗體(武漢博士德生物工程有限公司)；PV9000試劑盒、DAB試劑盒(北京中杉生物工程公司)；凋亡試劑盒(德國roche公司)；瑞舒伐他汀鈣片(10 mg/片)，AstraZeneca公司。儀器：日本尼康顯微照像系統(tǒng)；微波爐(格蘭仕)；溫箱(電熱恒溫水浴箱DHG-9031,上海)；電子天平(BS224S,德國)。

1.2動(dòng)物分組及模型建立健康成年SPF級(jí)SD雄性大鼠60只，適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d。隨機(jī)抽取10只為對(duì)照組，前降支下穿線不結(jié)扎；其余50只制作AMI模型：用10%的水合氯醛3 mL/kg腹腔注射麻醉大鼠，氣管切開插管，呼吸機(jī)輔助呼吸，潮氣量15 mL/kg,呼吸頻率70～80次/min，呼吸比2∶1，開胸后分離胸膜、心包，擠出心臟，以醫(yī)用縫線穿圓形塑料套管前結(jié)扎大鼠左前降支阻斷血流，造成AMI模型。24 h后存活41只大鼠，按照隨機(jī)數(shù)字表法分為3組，AMI組13只、Statin1組14只、Statin2組14只，術(shù)后第1天起Statin1、2組分別給予瑞舒伐他汀1.5、3.0 mg/(kg·d)灌胃，對(duì)照組及AMI組均以等量生理鹽水灌胃，每3天稱重1次并調(diào)整給藥劑量,共給藥4周。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)各組存活量分別為對(duì)照組10只、AMI組9只、Statin1組11只、Statin2組13只。

1.3心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)(AI)的測(cè)算用轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)脫氧尿苷三磷酸缺口末端標(biāo)記法(TUNEL)對(duì)組織石蠟切片行凋亡染色。凋亡細(xì)胞出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性，每張標(biāo)本取3張切片，每張切片在心梗區(qū)域隨機(jī)取5個(gè)高倍鏡視野，記錄陽性細(xì)胞數(shù)，計(jì)算AI，AI=凋亡細(xì)胞核數(shù)/總細(xì)胞核數(shù)×100%。

1.4心肌組織中Mfn2表達(dá)的檢測(cè)采用免疫組化法。處死大鼠后取心臟標(biāo)本，制作石蠟切片，選取梗死心肌組織邊緣區(qū)域(對(duì)照組在左室前壁)切片。依照試劑盒步驟檢測(cè)Mfn2。陽性切片作陽性對(duì)照，PBS切片作陰性對(duì)照，細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性，每張標(biāo)本取3張，分析Mfn2蛋白陽性染色指數(shù)(陽性細(xì)胞數(shù)/視野細(xì)胞總數(shù)×100%)。

1.5心肌組織中p-Akt表達(dá)的檢測(cè)采用免疫印跡法。提取組織總蛋白，測(cè)定蛋白濃度。 蛋白上樣量為50 μg，經(jīng)電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉后，加入一抗(抗α-actin、抗p-Akt、抗Akt)，4 ℃放置12 h以上，加入辣根過氧化物酶偶聯(lián)的二抗，平穩(wěn)搖動(dòng)，室溫放置2 h后檢測(cè)。

2　結(jié)果

2.1各組AI、Mfn2比較見表1。

2.2各組心肌組織 p-Akt 的表達(dá)比較與對(duì)照組比較，AMI組及Statin1、Statin2組心肌組織中p-Akt蛋白表達(dá)均降低(P均<0. 01);與AMI組比較，Statin1組、Statin2組p-Akt表達(dá)增加(P均<0.05) ，以Statin2組為著(P<0.05) ，見圖1、表1。

圖1　各組p-Akt表達(dá)的免疫印跡圖

組別AIp-AktMfn2對(duì)照組084.50±5.080.0480±0.0030*AMI組0.6087±0.0613*9.52±0.09*0.8850±0.0155*Statin1組0.3915±0.0334*#17.85±1.18*#0.6248±0.0558*#Statin2組0.2626±0.0297*#@28.35±2.29*#@0.3875±0.0478*#@

注：與對(duì)照組比較,*P<0.05;與 AMI組比較，#P<0.05; 與Statin1組比較，@P<0.05。

3　討論

既往認(rèn)為AMI時(shí)以心肌細(xì)胞壞死為主。近年來多項(xiàng)相關(guān)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)，AMI后細(xì)胞凋亡才是心肌細(xì)胞死亡的主要方式[3]。Kajstura等[4]在AMI動(dòng)物模型中發(fā)現(xiàn)，梗死后約6 h心肌細(xì)胞凋亡可達(dá)到高峰，7 d仍有大量的心肌細(xì)胞發(fā)生凋亡。Bardales等[5]用TUNEL法檢測(cè)85例AMI死亡患者尸解的心肌細(xì)胞，凋亡率超過90%。

AMI發(fā)生后，缺氧、缺血、再灌注等誘因激活各種凋亡因子，調(diào)控相關(guān)信號(hào)通路,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[6]。細(xì)胞凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)為多途徑且相互影響，研究發(fā)現(xiàn),Ras-PI3K/Akt 路徑是促使心肌細(xì)胞發(fā)生凋亡的主要通路[7]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,AMI組較對(duì)照組細(xì)胞凋亡明顯增多，同時(shí)心肌組織中p-Akt表達(dá)較對(duì)照組也明顯降低。以上結(jié)果均表明AMI后大量心肌細(xì)胞凋亡，與Ras-PI3K/Akt通路激活密切相關(guān)。

原癌基因Ras不僅能調(diào)控PI3K/Akt 通路，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，還可通過PI3K非依賴型途徑直接激活A(yù)kt[8]。研究表明，Mfn2在心肌、骨骼肌和腦組織中高表達(dá)，其可能參與心肌細(xì)胞凋亡的早期活化，加速線粒體分裂，促使線粒體體積減小[9]。Mfn2對(duì)Ras有直接負(fù)調(diào)控作用，能阻滯Ras-PI3K/Akt 通路，抑制Akt磷酸化，繼而使B淋巴細(xì)胞瘤-2基因表達(dá)減少，促凋亡基因Bax表達(dá)增加，通過線粒體相關(guān)途徑參與細(xì)胞凋亡[10]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,大鼠AMI造模成功后，梗死及周圍心肌組織Mfn2表達(dá)明顯增高，p-Akt表達(dá)明顯降低，這表明梗死后損傷激活Mfn2的表達(dá)，弱化Akt 磷酸化從而促發(fā)心肌細(xì)胞凋亡。

大量的循證醫(yī)學(xué)證實(shí)，他汀類藥物在冠心病防治過程中占據(jù)著不可替代的地位。隨著臨床廣泛應(yīng)用及研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)他汀類藥物有重要的獨(dú)立于調(diào)脂外的多重作用[11]：他汀類藥物除抑制甲羥戊酸合成，阻斷Cho的生成過程，還可抑制類異戊二烯，可與一些單體G蛋白(如Ras，Rho等)偶聯(lián)，增加后者的親脂性，影響Ras-PI3K/Akt 及Rho/Rho激酶信號(hào)通路、RAAS系統(tǒng)和過氧化物酶增殖物激活受體的活性，發(fā)揮其抑制心肌細(xì)胞凋亡、改善血管內(nèi)皮功能、調(diào)脂、抗動(dòng)脈粥樣硬化等作用，降低心血管疾病的發(fā)病率和病死率[2]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,瑞舒伐他汀可使Mfn2表達(dá)明顯下調(diào)，抑制Ras相關(guān)信號(hào)通路的活化，減少大鼠AMI后的細(xì)胞凋亡，其作用表現(xiàn)出一定的劑量依賴性。

綜上所述，筆者認(rèn)為Ras介導(dǎo)的PI3K/Akt信號(hào)通路可能在AMI后心肌細(xì)胞凋亡發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用，而瑞舒伐他汀通過下調(diào)Mfn2表達(dá)，上調(diào)p-Akt水平，最終減少AMI后心肌細(xì)胞凋亡，防止AMI范圍進(jìn)一步擴(kuò)大導(dǎo)致心肌細(xì)胞壞死，從而對(duì)心功能不全及心室重構(gòu)有一定的治療作用。

[1] Guo XM, Chen KH, Guo YH, et al. Mitofusion2 triggers vascular smooth muscle cell apoptosis via mitochondrial death pathway[J].Circ Res, 2007,101(11):1113-1122.

[2] 趙艷，杜冠華，王少華.Rho/Rho激酶信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路與他汀類藥物[J].中國新藥與臨床雜志,2008,10(27):786-790.

[3] Prech M, MarszaIek A, Schroder J, et al. Apoptosis as a mechanism for the eIimination of cardiomyocytes after acute myocardiaI infarction [J]. Am J Cardiol, 2010,105(9):1240-1245.

[4] Kajstura J, Cheng W, Sarangarajan R, et al. Necrotic and apoptotic myocyte cell death in the aging heart of Fischer 344 rats[J]. Am J Physiol， 1996,271(3 Pt 2):1215-1228.

[5] Bardales RH, Hailey LS, Xie SS, et al. In situ apoptosis assay for the detection of early acute myocardial infarction[J]. Am J pathol,1996,149(3):821-829.

[6] 張麗娜，吳星恒.心肌細(xì)胞凋亡與PI 3K/Akt信號(hào)途徑表達(dá)及其調(diào)控機(jī)制的研究[J].南昌大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版),2010，50(5)：119-121.

[7] Ishihara Y，Shimamoto N. Sulfaphenazole attenuates myocardial cell apoptosis accompanied with cardiac ischemia-reperfusion by suppressing the expression of BimEL and Noxa[J]. Pharmacol Sci， 2012,119(3):251-259.

[8] 袁向飛，陸敏.Ras/MAPK與PI3K/Akt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路及其相互作用[J].國際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志,2006,156(3)：4-5.

[9] Parra V, Eisner V, Chiong M, et al. Changes in mitochondrial dynamics during ceramide-induced cardiomyocyte early apoptosis[J]. Cardiovasc Res, 2008,77(2):387-397.

[10] Shen T, Zheng M, Cao CM, et al. Mitofusin-2 is a major determinant of oxidative stress-mediated heart muscle cell apoptosis[J]. J Biol Chem, 2007,282(8)：23354-23361.

[11] 鄢華，高煒.他汀類藥物作用和作用機(jī)制的新認(rèn)識(shí)[J].臨床內(nèi)科雜志，2006，23(1)：5-7.

湯建民(E-mail：tjmgrx@163.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.17.009

R541.4

A

1002-266X(2016)17-0028-03

2015-11-18)