冼晶，黃高明，梁秀就，黃松，蔡勁薇，李勵(lì)，盧德成，羅佐杰

（1.廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院 內(nèi)分泌科，廣西 南寧 530021；2.廣西醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院 流行病學(xué)與統(tǒng)計(jì)學(xué)教研室，廣西 南寧 530021；3.廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院 病理科，廣西 南寧 530021）

論著

庫(kù)欣綜合征中FHIT、Ki-67、PCNA的表達(dá)及相關(guān)因素的研究*

冼晶1，黃高明2，梁秀就3，黃松1，蔡勁薇1，李勵(lì)1，盧德成1，羅佐杰1

（1.廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院 內(nèi)分泌科，廣西 南寧 530021；2.廣西醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院 流行病學(xué)與統(tǒng)計(jì)學(xué)教研室，廣西 南寧 530021；3.廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院 病理科，廣西 南寧 530021）

目的探討庫(kù)欣綜合征腎上腺皮質(zhì)病變中腫瘤抑制基因脆性組氨酸三聯(lián)體（FHIT）、腫瘤增殖抗原Ki-67、增殖細(xì)胞核抗原（PCNA）的表達(dá)，探索鑒別庫(kù)欣綜合征腎上腺皮質(zhì)病變的相關(guān)因素。方法應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)49例庫(kù)欣綜合征腎上腺皮質(zhì)病變（腺癌14例、腺瘤26例、增生9例）中FHIT、Ki-67、PCNA的表達(dá)，對(duì)臨床病理及生化指標(biāo)采用有序結(jié)果的累積比數(shù)Logistic回歸分析探索鑒別庫(kù)欣綜合征皮質(zhì)病變的相關(guān)因素。結(jié)果FHIT在腎上腺皮質(zhì)增生中表達(dá)最高，腺瘤次之，腺癌最低（分別為100%、96.15%和42.96%），Ki-67與PCNA在腎上腺皮質(zhì)腺癌的表達(dá)最高，腺瘤次之，增生最低（分別為85.71%、7.69%、0.00%和100%、96.15%、77.78%）。應(yīng)用Logistic回歸分析發(fā)現(xiàn)FHIT、PCNA兩個(gè)因素與鑒別腺癌、腺瘤、增生的關(guān)系更為密切。結(jié)論FHIT、Ki-67和PCNA的表達(dá)與庫(kù)欣綜合征腎上腺皮質(zhì)病變密切相關(guān)。Logistic回歸分析提示FHIT、PCNA與鑒別診斷的關(guān)系更為密切。

庫(kù)欣綜合征；FH IT；Ki-67；PCNA；Logistic回歸分析

庫(kù)欣綜合征（Hypercortisolism，cushing syndrome）腎上腺皮質(zhì)病變表現(xiàn)為皮質(zhì)腺癌、腺瘤及增生。3者在臨床上均可表現(xiàn)為庫(kù)欣綜合征，但治療方法及預(yù)后各不相同，而在臨床及病理形態(tài)學(xué)的鑒別診斷上有較大難度[1]。目前尚未見庫(kù)欣綜合征腎上腺皮質(zhì)腺癌、腺瘤、增生的診斷相關(guān)因素的研究報(bào)道。本研究應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法，檢測(cè)庫(kù)欣綜合征腎上腺皮質(zhì)病變（腺癌、腺瘤及皮質(zhì)增生）中腫瘤抑制基因脆性組氨酸三聯(lián)體（fragile histindine triad，F(xiàn)HIT）、腫瘤增殖抗原Ki-67（Ki-67 nuclear antigen，Ki-67）、增殖細(xì)胞核抗原（proliferation cell nuclear antigen，PCNA）的表達(dá)并探討它們與皮質(zhì)病變的關(guān)系。對(duì)庫(kù)欣綜合征的各項(xiàng)臨床病理及生化指標(biāo)進(jìn)行Logistic回歸分析，探討鑒別庫(kù)欣綜合征腎上腺皮質(zhì)腺癌、腺瘤、增生的相關(guān)因素，旨在尋找在庫(kù)欣綜合征腎上腺皮質(zhì)病變中有鑒別診斷意義的客觀指標(biāo)。

1　資料與方法

1.1一般資料

組織標(biāo)本為廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院2005～2012年手術(shù)切除、經(jīng)病理證實(shí)的庫(kù)欣綜合征腎上腺皮質(zhì)病變石蠟包埋標(biāo)本49例。其中，腎上腺皮質(zhì)腺癌14例，腺瘤26例，增生9例；男性19例（37.5%），女性30例（62.5%）；年齡5~68歲，平均（35.84±16.18）歲。全部病例都有Cushing綜合征典型的臨床癥狀、體征和實(shí)驗(yàn)室改變。全部病例行小劑量地塞米松抑制試驗(yàn)均不被抑制。該研究獲得本單位倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)及受試者簽署的知情同意書。

1.2檢測(cè)方法

采用EliVision TM super二步法，參照試劑盒說明書進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色。主要染色步驟：切片脫蠟和水化后抗原修復(fù)，一抗FHIT（工作濃度1∶100）、Ki-67（即用型）、PCNA（即用型）室溫下孵育60min，然后滴加放大劑、多聚酶結(jié)合物，DAB顯色，復(fù)染等。兔抗人FHIT濃縮型多克隆抗體購(gòu)自北京中山生物技術(shù)公司，鼠抗人Ki-67、PCNA單克隆抗體和EliVision TM super檢測(cè)試劑盒為福州邁新生物技術(shù)公司產(chǎn)品。

1.3結(jié)果判斷

根據(jù)多數(shù)文獻(xiàn)的判斷方法，綜合考慮切片中陽性細(xì)胞著色強(qiáng)度、陽性細(xì)胞占所觀察同類細(xì)胞數(shù)的百分比兩項(xiàng)指標(biāo)，判斷免疫組織化學(xué)結(jié)果：細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)呈棕褐色或棕黃色顆粒者為陽性細(xì)胞。FHIT蛋白定位于細(xì)胞質(zhì)。Ki-67、PCNA陽性定位于細(xì)胞核。按染色強(qiáng)度評(píng)分：無色0分，淺黃色1分，棕黃色2分，棕褐色3分；再按陽性細(xì)胞所占的百分比評(píng)分：陽性細(xì)胞<5%為0分，6%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，>75%為4分。染色強(qiáng)度與陽性細(xì)胞百分比的乘積：0分為陰性（-），1～4分為弱陽性（+），5～8分為中等陽性（++），9～12分為強(qiáng)陽性（+++）。Ki-67陽性定位于細(xì)胞核，陽性細(xì)胞數(shù)<10%為陰性（-），陽性細(xì)胞數(shù)≥10%為陽性：其中10%～25%為弱陽性（+），25%～50%為中等陽性（++），>50%為強(qiáng)陽性（+++）[2-3]。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件包進(jìn)行處理。計(jì)量指標(biāo)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，組間差異比較用方差分析及其兩兩檢驗(yàn)（q檢驗(yàn)）；分類資料用率或構(gòu)成比（%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)或Fisher精確概率法，其兩兩比較采用Bonferroni檢驗(yàn)水準(zhǔn)調(diào)整法；因素篩選采用有序結(jié)果的累積比數(shù)Logistic回歸分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1激素及生化指標(biāo)情況

血皮質(zhì)醇各時(shí)間段3組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。血促腎上腺皮質(zhì)激素（adreno cortico tropic hormone，ACTH）8AM和0AM 2組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），而4PM組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。24 h尿17-OH、24 h尿17-KS以及血鉀3組間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。激素及生化指標(biāo)情況見表1。

2.2庫(kù)欣綜合征腎上腺皮質(zhì)病變中FHIT、Ki-67、PCNA的表達(dá)

庫(kù)欣綜合征腎上腺皮質(zhì)病變中FHIT的表達(dá)，腺癌的總陽性率均較腺瘤（χ2=11.925，P=0.001）及皮質(zhì)增生低（χ2=5.568，P=0.018）。腺癌總陽性率為42.86%，僅表現(xiàn)為弱陽性，其余全部為陰性。腺瘤與皮質(zhì)增生在總陽性率的比較中無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Fisher精確概率P=1.000）。見表2。

庫(kù)欣綜合征腎上腺皮質(zhì)病變中Ki-67的表達(dá)，總陽性率的表達(dá)腺癌較腺瘤（χ2=21.041，P< 0.001）、皮質(zhì)增生為高（χ2=12.878，P<0.001）。腺瘤與皮質(zhì)增生在總陽性率的表達(dá)比較中無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Fisher精確概率P=1.000）。見表3。

表1　激素及生化指標(biāo)情況 （）

表1　激素及生化指標(biāo)情況 （）

組別腺癌腺瘤皮質(zhì)增生F值P值血皮質(zhì)醇/（nmol/L）8AM　897.09±231.87　821.83±247.53　920.26±192.22　0.781　0.464 4PM　519.93±239.34　666.41±226.16　798.49±306.61　3.272　0.047 0AM　523.54±128.64　531.65±269.70　771.38±337.63　2.996　0.060血ACTH/（pmol/L）8AM　3.55±1.56　3.78±1.63　5.85±1.53　6.055　0.005 4PM　3.27±1.89　2.49±0.92　3.56±0.81　3.363　0.043 0AM　3.99±1.78　2.73±1.30　3.36±1.27　3.414　0.041 24 h尿17-OH/（μmol/L）21.20±10.08 16.29±8.96 15.71±5.58 1.487 0.237 24 h尿17-KS/（μmol/L）25.43±11.88 17.65±8.57 18.79±5.42 3.152 0.052血鉀/（mmol/L）3.69±0.59 3.32±0.65 3.30±0.79 1.489 0.236

表2　FHIT在皮質(zhì)醇增多癥腎上腺病變中的表達(dá)　例（%）

庫(kù)欣綜合征腎上腺皮質(zhì)病變中PCNA的表達(dá)，雖然腺瘤、腺癌、皮質(zhì)增生3者的總陽性率總的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=4.560，P=0.102），但是在分級(jí)比較中，腺癌在較高陽性（++/+++）的表達(dá)比腺瘤（χ2=4.660，P=0.031）及增生高（χ2=9.136，P=0.003）；腺瘤與增生差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=1.571，P=0.210）。見表4。

2.3庫(kù)欣綜合征腎上腺皮質(zhì)病變中FHIT、Ki-67、PCNA表達(dá)與臨床指標(biāo)的關(guān)系

49例組織標(biāo)本中FHIT、Ki-67、PCNA表達(dá)與患者的年齡、性別、發(fā)病部位（左側(cè)或右側(cè)）無關(guān)（P> 0.05）。見表5。

2.4庫(kù)欣綜合征腎上腺皮質(zhì)病變影響因素分析

分析庫(kù)欣綜合征與各項(xiàng)臨床及生化指標(biāo)的關(guān)系，用logistic回歸作因素篩選。由于庫(kù)欣綜合征的組織學(xué)類型分為皮質(zhì)增生、腺瘤、腺癌3類，屬有序多分類的資料，故采用有序結(jié)果的Logistic回歸分析。因素篩選采用逐步法，入選α水平為0.05，剔除α水平為0.10。方程的擬合優(yōu)度檢驗(yàn)：χ2=9.422，P=0.991>0.05，說明方程擬合效果好。分析結(jié)果表明：只有FHIT和PCNA 2個(gè)因素與庫(kù)欣綜合征腎上腺皮質(zhì)病變有關(guān)，F(xiàn)HIT呈負(fù)相關(guān)，PCNA呈正相關(guān)。見表6。

表5　庫(kù)欣綜合征腎上腺皮質(zhì)病變中FHIT、Ki-67、PCNA表達(dá)與臨床指標(biāo)的關(guān)系　例（%）

表6　多因素有序Logistic回歸分析結(jié)果

3　討論

FHIT是1996年OHTA等[4]發(fā)現(xiàn)的擬定的抑癌基因，其基因結(jié)構(gòu)和功能改變與人類多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)[5]。在人類多種惡性腫瘤及多種惡性腫瘤細(xì)胞系中FHIT基因呈現(xiàn)高頻率的純合缺失、雜合缺失或異常轉(zhuǎn)錄。大約70%的人類上皮腫瘤和某些癌出現(xiàn)FHIT基因缺失、甲基化或蛋白質(zhì)表達(dá)減少[6]。各種致癌因素影響亦可使FHIT蛋白表達(dá)受阻，從而使FHIT蛋白表達(dá)降低。病變組織中檢測(cè)到FHIT蛋白表達(dá)的缺失以及缺失的程度與其良惡性及預(yù)后有關(guān)，相反FHIT蛋白的高表達(dá)提示為良性[7]。本研究發(fā)現(xiàn)，在庫(kù)欣綜合征腎上腺皮質(zhì)病變中，F(xiàn)HIT在腺癌的表達(dá)率最低（P<0.05），且全部為陰性或弱陽性，皮質(zhì)增生的表達(dá)率最高（P<0.05），且全部為強(qiáng)陽性表達(dá)，腺瘤的表達(dá)介于兩者之間，提示在庫(kù)欣綜合征腎上腺皮質(zhì)病變中，腎上腺皮質(zhì)腺癌的FHIT基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物異常及其蛋白缺失或減少較腺瘤和增生更為明顯，F(xiàn)HIT基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物異常及其蛋白表達(dá)的改變與腎上腺皮質(zhì)病變的良惡性有密切關(guān)系，其表達(dá)下調(diào)與腎上腺皮質(zhì)腺癌發(fā)生、發(fā)展有密切關(guān)系。本研究同時(shí)發(fā)現(xiàn)FHIT在腎上腺皮質(zhì)腺癌中除有陰性表達(dá)外，另有6/14例為弱陽性表達(dá)，提示FHIT基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物異常及其蛋白缺失或減少在惡性腫瘤中亦非全部缺失，部分特別是惡性程度較低腺癌僅為蛋白表達(dá)的減少而非完全缺失。

Ki-67是目前已知的增殖抗原中最具增殖能力及應(yīng)用最廣泛的增殖細(xì)胞標(biāo)記之一，與腫瘤惡性程度、浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)密切相關(guān)[8-9]。本研究發(fā)現(xiàn)庫(kù)欣綜合征腎上腺皮質(zhì)病變中，Ki-67在腺癌的表達(dá)率最高（P<0.05），較腺瘤和增生更為明顯（P<0.05），提示皮質(zhì)腺癌的細(xì)胞增殖較腺瘤和皮質(zhì)增生更為活躍。另外發(fā)現(xiàn)Ki-67的表達(dá)隨增生、腺瘤、腺癌的細(xì)胞增殖程度的提高，表達(dá)的陽性強(qiáng)度增加，陽性率亦有增加。提示Ki-67表達(dá)的高低可反映腫瘤的良惡性。

PCNA在腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)情況可以敏感地反映腫瘤細(xì)胞的增殖活性，與腫瘤的生物學(xué)行為及惡性程度密切相關(guān)。較高的PCNA表達(dá)率反映了高水平的細(xì)胞增殖狀態(tài)[10]。本研究發(fā)現(xiàn)，在庫(kù)欣綜合征腎上腺皮質(zhì)病變中，PCNA的表達(dá)在腺癌最高，腺瘤次之，增生最低（P<0.05）。從增生、腺瘤到腺癌，隨著細(xì)胞增殖水平的提高，PCNA表達(dá)的陽性強(qiáng)度亦隨之增加。且由于增生和腺瘤的細(xì)胞增殖水平不同，PCNA表達(dá)高低也可以作為兩者的判斷指標(biāo)。

在臨床上，腫瘤大小常作為區(qū)別腫瘤良惡性的指標(biāo)。腎上腺皮質(zhì)腫瘤直徑超過5 cm應(yīng)考慮有惡變的可能。而腎上腺位于腹后腔，腫瘤太小時(shí)不易觸到，體格檢查時(shí)發(fā)現(xiàn)有腹部包塊提示腫瘤直徑較大。能否觸及腹部包塊及腫瘤大小對(duì)鑒別庫(kù)欣綜合征腎上腺皮質(zhì)病變的類型有價(jià)值。庫(kù)欣綜合征超過半數(shù)患者出現(xiàn)骨量減少或病理性骨折。皮質(zhì)腺癌的骨量減少甚至病理性骨折更明顯。其原因可能與皮質(zhì)醇增多引起的骨量丟失過多、破骨增加等因素有關(guān)。但骨量減少或骨折是否與腫瘤的良惡性有關(guān)尚未見相關(guān)報(bào)道。臨床上庫(kù)欣綜合征患者血皮質(zhì)醇8AM、4PM和0AM均可出現(xiàn)升高并伴有節(jié)律紊亂。4PM血皮質(zhì)醇可能因受影響因素較多而未見有相關(guān)統(tǒng)計(jì)的報(bào)道。庫(kù)欣綜合征患者由于腎上腺皮質(zhì)腺癌、腺瘤或增生自主分泌皮質(zhì)醇增多，抑制垂體ACTH的分泌，使血ACTH水平降低。8AM血ACTH水平可能是鑒別腎上腺皮質(zhì)腺癌、腺瘤及增生的指標(biāo)之一。

多因素Logistic回歸分析模型結(jié)果只有FHIT、PCNA兩個(gè)因素進(jìn)入模型。提示FHIT和PCNA這兩個(gè)因素與鑒別診斷的關(guān)系更為密切。主要原因是其他因素與這兩個(gè)因素具有較高的相關(guān)性，因此，在多因素分析時(shí)被排除在方程之外。另外研究的病例數(shù)相對(duì)較少也是影響多因素分析結(jié)果的可能原因。

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（張蕾編輯）

Expression of FHIT，K i-67 and PCNA in Cushing syndrome and related factors*

Jing Xian1,Gao-ming Huang2,Xiu-jiu Liang3,Song Huang1, Jing-wei Cai1,Li Li1,De-cheng Lu1,Zuo-jie Luo1
（1.Department of Endocrinology，the First Affiliated Hospital of Guangxi Medical University，Nanning，Guangxi530021，China；2.Department of Epidmiology and Statistics，Public Health College of Guangxi Medical University，Nanning，Guangxi530021，China；3.Department of Pathology，the First Affiliated Hospital of Guangxi Medical University，Nanning，Guangxi 530021，China）

Objective To study the expression of FHIT，Ki-67 and PCNA in hypercortisolism of various adrenocortical diseases and explore the correlative factors of the differential diagnosis of hypercortisolism of adrenocortical adenocarcinoma，adenoma and hyperplasia.Methods The expressions of FHIT，Ki-67 and PCNA were detected by immunohistochemical staining in 49 cases of adrenocortical diseases，which included 14 cases of adrenocortical carcinoma，26 cases of adrenocortical adenoma and 9 cases of adrenocortical hyperplasia.The factors correlated to differential diagnosis of hypercortisolism of various adrenocortical diseases were analyzed statistically by ordinal logistic regression.Results The expression rate of FHIT in adrenocortical hyperplasia，adrenocortical adenoma and adrenocortical adenocarcinoma was 100.00%，96.15%and 42.96%，respectively.The expression rate of Ki-67 in adreno－cortical adenocarcinoma and adrenocortical adenoma was 85.71%and 7.96%，respectively，while there was no expression atall in adrenocortical hyperplasia（0.00%）.The expression rate of PCNA in adrenocortical adenocarcinoma，adrenocortical adenoma and adrenocortical hyperplasia was 100.00%，96.15%and 77.78%，respectively.Logistic regression single-factor analysis revealed that 8 factors including FHIT，Ki-67，PCNA，abdominal mass，tumor size，osteopenia or fracture，serum cortisol level（4 pm）and blood ACTH level（8 am）were possibly linked to the differential diagnosis of hypercortisolism of the adrenocortical diseases，and multiple-factor analysis showed that FHIT and PCNA were the factors closely correlated to differential diagnosis of adrenocortical carcinoma，adenoma and hyperplasia. Conclusions The expressions of FHIT，Ki-67 and PCNA are strongly related with hypercortisolism of various adrenocortical diseases.They might be applied as the markers for distinguishing adrenocortical carcinoma，adrenocortical adenoma and adrenocortical hyperp lasia.The results of logistic regression analysis suggest that FHIT，Ki-67，PCNA，abdominal mass，tumor size，osteopenia or fracture，serum cortisol（4 pm）and blood ACTH level（8 am）may be the correlated factors of differential diagnosis of adrenocortical carcinoma，adenoma and hyperplasia；moreover，F(xiàn)HIT and PCNA are the factors closely correlated to differential diagnosis of hypercortisolism of adrenocortical diseases.

hypercortisolism；FHIT；Ki-67；PCNA；logistic regression

R 586.2

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2016.14.008

1005-8982（2016）14-0037-05

2015-11-30

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（No：81060220）；廣西自然科學(xué)基金項(xiàng)目（No：2011GXNSFA018172）；廣西留學(xué)回國(guó)人員科學(xué)基金（No：桂科回0731019）；廣西青年科學(xué)基金（No：桂科青0728073）；廣西衛(wèi)生廳自籌經(jīng)費(fèi)科研課題項(xiàng)目（No：Z20133027）

羅佐杰，E-mail：zluo888@163.com