郭　帆,施文正,汪之和

(上海海洋大學(xué)食品學(xué)院,上海 201306)

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南極磷蝦酶解液脫氟工藝的研究

郭帆,施文正*,汪之和

(上海海洋大學(xué)食品學(xué)院,上海 201306)

本文以脫氟率和氨基酸損失率為指標(biāo),比較了四種不同鈣源物對(duì)南極磷蝦酶解液氟脫除的影響。并結(jié)合吸附法與離子沉淀法共同脫氟,在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,以脫氟率為響應(yīng)值,利用響應(yīng)面優(yōu)化法對(duì)結(jié)合脫氟方法進(jìn)行優(yōu)化。脫氟前后利用氨基酸自動(dòng)分析儀檢測酶解液中氨基酸種類與含量。結(jié)果表明,四種鈣源物中乳酸鈣對(duì)南極磷蝦酶解液氟脫除效果最好。利用結(jié)合法脫氟的工藝條件為:乳酸鈣與氧化鋁質(zhì)量比1∶4,酶解液pH9.0,流速2.0 mL/min,此時(shí)脫氟率可達(dá)到93.98%±0.04%。脫氟前后南極磷蝦酶解液中氨基酸種類并沒有發(fā)生變化,氨基酸總量損失率也僅為3.49%。由此證明,結(jié)合法對(duì)南極磷蝦酶解液脫氟有良好的效果。

結(jié)合法,脫氟,響應(yīng)面,氨基酸

南極磷蝦是世界上數(shù)量最多的生物資源,其蘊(yùn)藏量巨大,估計(jì)在6.5億t到10億t之間[1]。南極磷蝦是可供人類利用的海洋動(dòng)物資源中蘊(yùn)藏量最為豐富的一種,也是人類重要的后備蛋白庫[2]。南極磷蝦營養(yǎng)豐富,除富含蛋白外,還含有人體所必需的全部氨基酸,富含亞油酸、亞麻酸等不飽和脂肪酸及鈣、鉀、鎂、鍶等多種礦物質(zhì)元素[3]。且類胡蘿卜素色素含量高。但南極磷蝦有富集氟的特性,其氟含量極高。整蝦干樣中氟含量平均為1232 mg/kg;甲殼中氟的含量較高,平均為4028 mg/kg;肌肉中氟含量較少,平均為228 mg/kg[4]。南極磷蝦各部位的氟含量遠(yuǎn)均遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于我國對(duì)肉類和魚類氟限量的要求2.0 mg/kg[5]。如此高的氟含量,使消費(fèi)者擔(dān)心食用南極磷蝦會(huì)導(dǎo)致氟中毒,從而影響了對(duì)南極磷蝦的食用。

南極磷蝦酶解液有很大的開發(fā)潛力,酶解液中富含人類所需的所有必需氨基酸,但如同南極磷蝦高的含氟量一樣,其酶解液中的氟含量依舊很高。經(jīng)檢測,南極磷蝦酶解液中氟含量約為50～80 mg/L。這遠(yuǎn)遠(yuǎn)高出國家對(duì)飲用水以及諸多食品的氟含量限量要求,為了使南極磷蝦酶解液得到更好的利用,非常有必要對(duì)其進(jìn)行降氟處理[6]。

目前我國除氟方法主要集中在水的脫氟處理。除氟技術(shù)方法主要有:吸附過濾法、離子沉淀法、電滲析法、反滲透、納濾法等[7]。而南極磷蝦脫氟的方法主要集中在鈣離子沉淀法,活性氧化鋁吸附法也僅用于含氟量較低的自來水脫氟。本文結(jié)合這兩種氟脫除的方法,對(duì)南極磷蝦酶解液中氟脫除做了研究,并達(dá)到了較高的脫氟率,為南極磷蝦氟脫除提供了新的思路。

1　材料與方法

1.1材料與設(shè)備

實(shí)驗(yàn)所用南極磷蝦捕撈于南極海域FAO48.2區(qū),捕撈后于-20 ℃條件下保存。

木瓜蛋白酶(酶活≥6000 U/mg)、氟化鈉、三水合乙酸鈉、二水合檸檬酸鈉、高氯酸、冰醋酸、濃鹽酸、硫酸銅、硫酸鉀、甲醛、氫氧化鈉、無水氯化鈣、氧化鈣、一水合醋酸鈣、五水合乳酸鈣等分析純,國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;實(shí)驗(yàn)所用水去離子水。

JYL-C020型組織攪碎機(jī)九陽料理機(jī);BSA型分析天平梅特勒-托利多儀器有限公司;PHS-3C型精密酸度計(jì)上海雷磁儀器廠;JB-1A型磁力攪拌器上海精密科學(xué)儀器有限公司;PF-1型氟離子選擇電極上海雷磁精密儀器有限公司;232單鹽橋型甘汞參比電極上海雷磁精密儀器有限公司;CR-21G型高速冷凍離心機(jī)日本HITACHI公司;L-8900氨基酸自動(dòng)分析儀日本HITACHI公司。

1.2測定方法

1.2.1氟含量的測定方法按GB/T5009.18-2003食品中氟的測定中氟離子選擇電極法測定[8]。

降氟率(%)=(1-降氟前酶解液中氟含量(mg/L)/降氟后酶解液中氟含量(mg/L))×100

1.2.2氨基酸含量測定按GB/T5009.124-2003食品中氨基酸的測定方法測定[9]。

氨基酸損失率(%)=(1-降氟前酶解液中氨基酸含量(mg/L)/降氟后酶解液中氨基酸含量(mg/L))×100

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1酶解液的制備凍藏的南極磷蝦在自然條件下解凍。組織攪碎機(jī)攪成漿狀后1∶2比例加水,加0.3%木瓜蛋白酶,調(diào)節(jié)pH到7.5,50 ℃下酶解5 h,冷卻,13000 r/min、4 ℃下離心30 min[10],所得上清液即為實(shí)驗(yàn)用酶解液。

1.3.2不同鈣源物對(duì)南極磷蝦酶解液氟脫除的影響無機(jī)鈣源選擇生石灰(CaO)、氯化鈣(CaCl2),有機(jī)鈣源選擇乳酸鈣[Ca(CH3CHOHCOO)2·5H2O]、醋酸鈣[Ca(CH3COO)2·H2O]。每種鈣源物的添加量如表1所示。取10 mL南極磷蝦酶解液于燒杯中,分別添加不同量的鈣源物,調(diào)節(jié)pH到9,用恒溫加熱攪拌器攪拌至固體全部溶解[11],結(jié)果用SPSS軟件進(jìn)行分析。

表1　不同鈣源物的添加量Table 1　Addition of different calcium sources

1.3.3吸附法結(jié)合Ca2+沉淀法脫氟的單因素實(shí)驗(yàn)以4∶1、3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3、1∶4的質(zhì)量比將脫氟效果最好的鈣源物與活性氧化鋁混合,填充于內(nèi)徑為2.5 cm的交換柱中,裝柱高約為整柱高的一半。制備好的南極磷蝦酶解液分成7份,分別調(diào)pH到5、6、7、8、9、10、11。再分別以0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5 mL/min的速度通過每種比例的交換柱,收集到的濾液通過0.45 μm的微濾膜后測定其氟含量,氨基酸含量?？紤]到南極磷蝦酶解液通過交換柱時(shí),反應(yīng)溫度難以保持在恒定溫度不變。本實(shí)驗(yàn)參考李紅艷[7]、呂傳萍[13]等的相關(guān)研究,選取室溫(25 ℃)為本實(shí)驗(yàn)反應(yīng)的環(huán)境溫度。

1.3.4響應(yīng)面法優(yōu)化脫氟工藝在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,以兩種物料比例、pH、流速為參考因素,以脫氟率為響應(yīng)值,應(yīng)用Design-Expert 8.0.6軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析并建立數(shù)學(xué)回歸模型,確定脫氟的最佳工藝。共有17個(gè)實(shí)驗(yàn)。因素設(shè)計(jì)表如表2所示。

表2　響應(yīng)面因素設(shè)計(jì)表Table 2　Factors design of response surface

2　結(jié)果與分析

2.1不同鈣源物對(duì)南極磷蝦酶解液氟脫除的影響

李紅艷[7]對(duì)納濾法、電滲析法、鈣離子沉淀法三種方法脫除南極磷蝦酶解液中氟的含量進(jìn)行過比較。結(jié)果表明鈣離子沉淀法操作簡單,且脫氟效果明顯,是一種很好的酶解液脫氟方法。鈣離子沉淀法的原理是鈣離子與氟離子結(jié)合形成氟化鈣沉淀,通過微濾法除去反應(yīng)后溶液中的沉淀物。本文研究針對(duì)南極磷蝦酶解液,比較了不同鈣源物對(duì)其氟脫除的效果。選取兩種無機(jī)鈣源(生石灰和氯化鈣)和兩種有機(jī)鈣源(醋酸鈣和乳酸鈣)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。如圖1、圖2可知,氟含量和氨基酸含量均隨著鈣源物添加量的增加而減少,當(dāng)四種鈣源物添加量≥125 mmol/L時(shí),四種鈣源物對(duì)氟含量降低的影響均不再顯著(p>0.05),當(dāng)四種鈣源物添加量≥145 mmol/L時(shí),四種鈣源物對(duì)氨基酸含量的影響不再顯著(p>0.05)。這與王靈昭[14]的研究結(jié)果基本吻合。當(dāng)鈣源物添加量相同時(shí),添加有機(jī)鈣源的酶解液中氟含量明顯低于添加無機(jī)鈣源酶解液中氟含量,而氨基酸含量也明顯高于無機(jī)鈣源。這就表明有機(jī)鈣源降低氟含量的效果優(yōu)于無機(jī)鈣源。由圖可以明顯看出,四種鈣源物中,乳酸鈣對(duì)樣品氟脫除效果最優(yōu),對(duì)酶解液營養(yǎng)影響最小。這可能是由于乳酸鈣易溶于水,而且其為人體補(bǔ)充鈣的良好鈣制劑,使其在南極磷蝦酶解液中更容易吸收,從而達(dá)到良好的降氟效果。

圖1　不同鈣源物對(duì)南極磷蝦酶解液氟含量的影響Fig.1　Effects of different calcium source solution of fluorine content on Antarctic krill hydrolysate注:不同字母表示組間顯著性差異(p<0.05),圖2同。

圖2　不同鈣源物對(duì)南極磷蝦酶解液氨基酸含量的影響Fig.2　Effects of different calcium source solution of amino acid on Antarctic krill hydrolysate

2.2吸附法結(jié)合Ca2+沉淀法脫氟的單因素實(shí)驗(yàn)

2.2.1質(zhì)量比對(duì)降氟率的影響隨著m乳酸鈣:m氧化鋁的減小,酶解液脫氟率明顯增加,當(dāng)m乳酸鈣∶m氧化鋁達(dá)到1∶4后,脫氟率達(dá)到94.25%,此時(shí)交換柱流出酶解液中氟含量僅為1.94 mg/L,已經(jīng)達(dá)到國家飲用水規(guī)定氟含量的安全標(biāo)準(zhǔn)。在總質(zhì)量不變的情況下,隨著乳酸鈣含量的增大,脫氟率減小,這可能是由于酶解液流過交換柱時(shí),與交換柱中填充的乳酸鈣反應(yīng)生成大量結(jié)晶氟化鈣,阻礙了活性氧化鋁吸附酶解液中氟的緣故。實(shí)驗(yàn)結(jié)果與Islam M[12]等的研究結(jié)果類似。Islam M的相關(guān)研究表明,隨著鈣源物添加量增大,反應(yīng)活性位點(diǎn)重疊,導(dǎo)致反應(yīng)有小面積減少使得脫氟率有所降低。如圖3所示,當(dāng)m乳酸鈣∶m氧化鋁≈1∶4時(shí),此時(shí)酶解液脫氟率不再有明顯的變化,故取1∶5～1∶3為響應(yīng)因素范圍值。

圖3　質(zhì)量比對(duì)降氟率的影響Fig.3　Effect of mass ratio on reducing fluoride

2.2.2pH對(duì)降氟率的影響由圖4可知,隨著酶解液pH的升高,降氟率呈現(xiàn)先快速上升后基本穩(wěn)定不變的趨勢。當(dāng)pH呈堿性時(shí),降氟率明顯升高。當(dāng)pH>10時(shí),降氟率稍有降低的趨勢。這與李紅艷、呂傳萍等的研究略有不同。李紅艷[7]的研究表明,pH>10時(shí)脫氟率不再明顯變化可能是因?yàn)槊附庖褐写罅堪被嵝‰钠鸬搅司彌_作用。呂傳萍[13]認(rèn)為當(dāng)pH>10時(shí),反應(yīng)到達(dá)平衡狀態(tài),降氟率不再升高。由本實(shí)驗(yàn)結(jié)果看,pH>10時(shí)降氟率略有降低。這可能是實(shí)驗(yàn)原因所造成的誤差。也可能是溶液呈堿性時(shí),Ca2+與OH-容易結(jié)合形成Ca(OH)2使活性氧化鋁表面堵塞,從而導(dǎo)致酶解液不能與吸附劑充分反應(yīng),造成降氟率有所降低。故實(shí)驗(yàn)選取pH8～10為最佳響應(yīng)面取值范圍。

圖4　pH對(duì)降氟率的影響Fig.4　Effect of pH on reducing fluoride

2.2.3流速對(duì)降氟率的影響由圖5可以看出,降氟率隨著通過交換柱酶解液流速的升高呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢。這可能是因?yàn)榱魉龠^小時(shí),酶解液中氟與交換柱填充料充分反應(yīng)形成的不溶物阻礙反應(yīng)繼續(xù)發(fā)生。而當(dāng)流速過快時(shí),部分酶解液未與混合脫氟物料反應(yīng)。當(dāng)流速為2.0 mL/min時(shí),酶解液中氟的脫除率達(dá)到最大93.26%，故實(shí)驗(yàn)選取1.5～2.5 mL/min為響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)范圍。

圖5　流速對(duì)降氟率的影響Fig.5　Effect of flow rate on reducing fluoride

2.3響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)

響應(yīng)面設(shè)計(jì)方案及響應(yīng)結(jié)果如表3所示。

2.3.1方差分析方差分析結(jié)果見表4。

利用軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行回歸擬合,得到的回歸方程為:Y=+85.45+4.28A+1.97B+1.90C-1.34AB-1.09AC-1.17BC-1.68A2-1.21B2-3.64C2。由表4可知,失擬項(xiàng)的p值>0.05,而模型的p值<0.0001,表明模型高度顯著,該模型擬合程度良好,實(shí)驗(yàn)誤差小,可以對(duì)吸附法結(jié)合Ca2+沉淀法脫氟影響進(jìn)行分析和預(yù)測。

表3　Box-Bohnken設(shè)計(jì)方案及響應(yīng)結(jié)果值Table 3　Box-Bohnken design scheme and response results

表4　因素的方差分析Table 4　Analysis of variance

注:p≤0.01 為極顯著,用**表示;p≤0.05 為顯著,用*表示;p>0.05 為不顯著。

2.3.2響應(yīng)面圖優(yōu)化手動(dòng)優(yōu)化后,所做的響應(yīng)面圖如圖6～圖8所示。

圖6　質(zhì)量比和pH對(duì)降氟率的影響Fig.6　Effects of mass ratio and pH on reducing fluoride

圖7　質(zhì)量比和流速對(duì)降氟率的影響Fig.7　Effects of mass ratio and flow rate on reducing fluoride

圖8　pH和流速對(duì)降氟率的影響Fig.8　Effects of pH and ratio on reducing fluoride

由圖6、圖7、圖8可以看出,在所選范圍之內(nèi),脫氟率隨乳酸鈣與氧化鋁質(zhì)量比的加大而減小,隨pH的升高先增加后略微降低,隨流速的增大先增大后減小。并且相互之間交互作用顯著,三個(gè)因素中乳酸鈣與活性氧化鋁質(zhì)量比對(duì)降氟率的影響最明顯,這與表4的結(jié)果一致。

2.3.3驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)通過Design-Expert 8.0.6軟件對(duì)經(jīng)手動(dòng)優(yōu)化后的回歸方程求解[11]。在實(shí)驗(yàn)的因素水平范圍內(nèi)預(yù)測的吸附法結(jié)合Ca2+沉淀法脫氟最佳條件為:乳酸鈣與活性氧化鋁質(zhì)量比1∶4.38,pH8.97,流速2.07 mL/min。在此條件下酶解液脫氟率達(dá)到94.14%。結(jié)合實(shí)際條件將其修正為質(zhì)量比為1∶4,pH9.0,流速2 mL/min。在此條件下,進(jìn)行了驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),測得的脫氟率為93.98%±0.04%,與理論預(yù)測脫氟率基本吻合,說明手動(dòng)優(yōu)化后的分析和預(yù)測都非常可靠。與氯化鈣法脫氟、生石灰法脫氟的脫氟率比較,結(jié)合法對(duì)南極磷蝦酶解液的脫氟效果明顯優(yōu)于單一鈣源法。

2.3.4酶解液中氨基酸含量的變化考慮到在脫氟的過程中酶解液中營養(yǎng)物質(zhì)可能會(huì)受到影響,故以酶解液中氨基酸含量為指標(biāo)來檢測反應(yīng)前后其營養(yǎng)的變化。南極磷蝦富含人體所需的所有必需氨基酸,經(jīng)檢測其酶解液中共有18種氨基酸,其中谷氨酸含量最高[15]。數(shù)據(jù)如表5,脫氟前后氨基酸損失率僅為3.49%。證明了活性氧化鋁吸附法結(jié)合乳酸鈣沉淀法脫氟對(duì)酶解液中營養(yǎng)物質(zhì)氨基酸的含量影響并不明顯。

3　結(jié)論

鈣離子沉淀法是常用的脫氟方法,本文比較了有機(jī)鈣源和無機(jī)鈣源對(duì)南極磷蝦酶解液的脫氟效果,結(jié)果表明在所選用的四種鈣源物中,乳酸鈣的降氟效果最優(yōu)。

表5　脫氟前后酶解液中氨基酸含量變化Table 5　Changes of amino acid content before and after reaction

本文結(jié)合活性氧化鋁吸附脫氟法和鈣離子沉淀脫氟法,通過氧化鋁與乳酸鈣以不同比例混合后填充交換柱,不同pH的南極磷蝦酶解液以不同流速經(jīng)過交換柱進(jìn)行脫氟,在做了單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化,確定了結(jié)合脫氟法的較優(yōu)工藝:乳酸鈣與活性氧化鋁的質(zhì)量比1∶4,pH9.0,流速2.0 mL/min,此條件下脫氟率可達(dá)到93.98%。

對(duì)南極磷蝦酶解液脫氟前后的氨基酸含量進(jìn)行

檢測,結(jié)果表明結(jié)合脫氟法對(duì)南極磷蝦酶解液中氨基酸含量影響較小,脫氟前后總氨基酸損失率僅為3.49%。

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Study on fluoride removal of Antarctic krill hydrolysate

GUO Fan,SHI Wen-zheng*,WANG Zhi-he

(College of Food Sciences,Shanghai Ocean University,Shanghai 201306,China)

In this study,the rate of defluorinating and amino acid losses removal rate were regarded as the index.The effects of four different calcium sources to Antarctic krill hydrolysate fluoride removal were compared.Adsorption and ion precipitation were combined to remove the fluoride.Based on the single factor experiment,the rate of defluorinating being as the response value,and the study used the response surface optimization method to optimize defluorinating method.The kinds and contents of amino acids in the peptide was detected by automatic amino acid analyzer before and after experiment.The results showed that,calcium lactate was the best calcium sources of removing fluoride.The best removal technological conditions were as follows:mass rate was 1∶4,pH was 9.0 and the flow rate was 2.0 mL/min.The removal fluoride reached 93.98%±0.04% under this condition.The kinds of amino acids in the peptide were not changed before and after the removal of fluorine,the total loss rate of the amino acids was only 3.49%.The results indicated that the combined methods had good effect on enzymatic hydrolysate defluorination.

combined method;fluoride removal rate;response surface;amino acid

2015-11-19

郭帆(1991-)，女，碩士在讀，研究方向：水產(chǎn)品加工與利用，E-mail：424336379@qq.com。

施文正(1975-)，男，博士，副教授，研究方向：水產(chǎn)品加工與食品風(fēng)味，E-mail：wzshi@shou.edu.cn。

南極海洋生物資源開發(fā)利用項(xiàng)目(2015)；國家“863”高新技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃( 2011AA090801)； 上海高校一流學(xué)科建設(shè)項(xiàng)目資助。

TS201.1

B

1002-0306(2016)09-0245-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.09.039